陳欣 潘月好 金國華 樓舒暢

甲狀旁腺激素和骨硬化蛋白抗體聯(lián)合治療雌性SD大鼠骨質(zhì)疏松癥的療效觀察

陳欣 潘月好 金國華 樓舒暢

目的 探索甲狀旁腺激素（PTH）和骨硬化蛋白抗體（Scl-Ab）聯(lián)合治療雌性SD大鼠骨質(zhì)疏松癥的療效，為臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。方法 從70只健康雌性SD大鼠隨機選取65只行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，其余5只行假手術(shù)；術(shù)后在正常環(huán)境下飼養(yǎng)12周，從雙側(cè)卵巢切除大鼠中隨機選取5只檢測脛骨骨密度，較假手術(shù)大鼠下降37.64%，證實骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。遂將余下60只雙側(cè)卵巢切除大鼠隨機分成4組：未用藥組15只（其中2只大鼠因傷口感染而死亡）、Scl-Ab組15只（Scl-Ab 25mg/kg皮下注射，2次/周）、PTH組15只（PTH 60μg/kg皮下注射，3次/周）、PTH+Scl-Ab組15只（Scl-Ab 25mg/kg皮下注射，2次/周；同時PTH 60μg/kg皮下注射，3次/周）。治療12周后處死大鼠取脛骨行Micro-CT、HE組織切片和骨生物力學(xué)檢測與比較。結(jié)果Micro-CT三維重建分析，藥物治療12周后Scl-Ab組、PTH組和PTH+Scl-Ab組骨小梁數(shù)量較未用藥組明顯增多，且骨小梁更粗、聯(lián)系更為緊密；脛骨干骺端微觀參數(shù)改善較未用藥組更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），其中PTH+Scl-Ab組最為明顯（P＜0.05）。HE組織切片可見Scl-Ab組、PTH組和PTH+Scl-Ab組骨小梁之間聯(lián)系緊密，排列規(guī)律，且脛骨干骺端骨量增加，脛骨局部骨組織礦化明顯，其中PTH+Scl-Ab組最為明顯。骨生物力學(xué)檢測結(jié)果顯示Scl-Ab組、PTH組和PTH+Scl-Ab組最大載荷、剛度值均高于未用藥組（均P＜0.05），其中PTH+Scl-Ab組亦分別高于Scl-Ab組和PTH組（均P＜0.05）。結(jié)論 PTH、Scl-Ab治療雌性SD大鼠骨質(zhì)疏松癥的療效明顯，其中兩藥聯(lián)用療效更佳。

去勢大鼠 骨質(zhì)疏松癥 甲狀旁腺激素 骨硬化蛋白抗體

隨著人類壽命的延長和社會老齡化的進(jìn)展，骨質(zhì)疏松癥引起的骨折大大增加了老年人病殘率和病死率，明顯加重了社會公共衛(wèi)生的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]，如何防治骨質(zhì)疏松癥是臨床醫(yī)師不可忽視的問題。隨著研究的深入，學(xué)者們對抗骨質(zhì)疏松藥物提出了一種新要求——強烈刺激成骨作用、增加骨量、抑制骨吸收的活性[2]。甲狀旁腺激素（PTH）是在鈣鹽沉積以及骨形成過程中的重要調(diào)節(jié)因素，間斷使用可促進(jìn)骨質(zhì)形成、預(yù)防骨折發(fā)生。相關(guān)研究表明間歇性給藥可以作用于四肢骨中的骨小梁以及密質(zhì)骨表面，刺激成骨細(xì)胞增殖，抑制成骨細(xì)胞凋亡，激活襯里細(xì)胞，從而促進(jìn)骨質(zhì)形成[3]。有研究發(fā)現(xiàn)骨硬化蛋白（sclerostin，Scl）經(jīng)Wnt通路負(fù)向調(diào)節(jié)骨代謝的作用是引起骨質(zhì)疏松癥的原因之一[4]，而骨硬化蛋白抗體（Scl-Ab）可拮抗該負(fù)向調(diào)節(jié)作用，抑制骨丟失并促進(jìn)骨生成[5]。為了進(jìn)一步研究PTH和Scl-Ab用于臨床防治骨質(zhì)疏松癥的可能性，筆者建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，經(jīng)PTH、Scl-Ab和PTH+Scl-Ab治療后觀察療效，為臨床推廣應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及材料 （1）實驗動物：12周齡SPF級SD雌性大鼠70只，體重225～250g，由上海斯萊克動物公司提供[許可證號：SCXK（滬）2007-0005，合格證號：2007-000548429]。所有大鼠在溫度（24±0.5）℃、濕度45%～ 50%、通風(fēng)良好的環(huán)境下飼養(yǎng)，每周稱重1次。所有大鼠每次手術(shù)后3d給予青霉素肌肉注射（2.5萬U/kg）以預(yù)防感染。（2）材料和儀器：Scl-Ab（美國MSD公司）；PTH（美國GIBCO公司）；Micro-CT（Sky Scan 1176，荷蘭），顯微鏡（Axio Imager M1，德國ZEISS公司），Image-Pro Plus全自動圖像分析儀（美國Media Cybernetics公司），生物力學(xué)實驗機（MTS-858 Mini Bionix，美國）。

1.2 方法

1.2.1 骨質(zhì)疏松大鼠模型的建立 70只大鼠中隨機取65只行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，余下5只作為假手術(shù)對照（僅作切口顯露卵巢脂肪包被組織后縫合，不切除雙側(cè)卵巢）。（1）雙側(cè)卵巢切除術(shù)：按照3ml/kg腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉；在大鼠背部正中線中下1/3處作一長約2cm的縱行切口，向兩側(cè)鈍性分離皮下軟組織，于脊柱旁開0.5cm處鈍性分離肌肉組織，顯露卵巢脂肪包被組織；輕輕提起卵巢，在輸卵管卵巢交界處絲線結(jié)扎，完整摘除雙側(cè)卵巢，逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口。（2）骨質(zhì)疏松大鼠模型的檢驗：70只大鼠在正常環(huán)境下飼養(yǎng)12周，從雙側(cè)卵巢切除的大鼠中隨機選取5只大鼠處死，使用骨密度測量儀檢測脛骨骨密度，以假手術(shù)大鼠為對照，脛骨骨密度下降37.64%（＞30%），證實骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。

1.2.2 分組及治療 將余下60只雙側(cè)卵巢切除的大鼠隨機分成4組：未用藥組15只（其中2只大鼠因傷口感染而死亡）、Scl-Ab組15只（Scl-Ab 25mg/kg皮下注射，2次/周）、PTH組15只（60μg/kg皮下注射，3次/周）、PTH+Scl-Ab組15只（Scl-Ab 25mg/kg皮下注射，2次/周；同時PTH 60μg/kg皮下注射，3次/周）。藥物治療12周后，處死所有存活大鼠，完整取下大鼠雙側(cè)脛骨行Micro-CT、HE組織切片、骨生物力學(xué)檢測。

1.2.3 Micro-CT檢測 取左側(cè)脛骨，剔除周圍軟組織后用0.9%氯化鈉溶液沖洗，使用10%的多聚甲醛固定進(jìn)行Micro-CT檢測。掃描條件：圖像矩陣為2 048×2 048，整合時間為200ms，能量/強度70kVp、114μA、8W。以0°旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行掃描。掃描完成后，選取生長板遠(yuǎn)端1.0mm、層厚2.0mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）進(jìn)行三維重組，最低閾值為160提取圖像信息。獲得大鼠脛骨干骺端ROI骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb Th）、骨小梁數(shù)量（Tb N）、骨小梁分離度（Tb Sp）、連接密度（Conn D）和骨密度（BMD）。

1.2.4 HE組織切片 待左側(cè)脛骨標(biāo)本完成Micro-CT檢測后，用4%多聚甲醛固定，EDTA脫鈣液中浸泡，每3～4d換液1次，連續(xù)脫鈣4周后進(jìn)行X線攝片檢查是否脫鈣完全，然后充分水洗，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色。不脫鈣骨組織包埋塊修整后置于硬組織切片機沿脛骨縱軸冠狀面切片，清洗打磨拋光，切片最終厚度30～40μm，置于熒光顯微鏡及光鏡下觀察。使用Image-Pro Plus 6.0全自動圖像分析儀計算骨礦化沉積率。

1.2.5 骨生物力學(xué)測定 取右側(cè)脛骨并置于MTS-858型生物力學(xué)實驗機上，支點跨距17mm，中點為加壓點，加載速度為2mm/min，計算機記錄載荷-位移曲線，根據(jù)曲線計算最大載荷和剛度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT三維重建分析 通過Micro-CT對大鼠左側(cè)脛骨干骺端ROI進(jìn)行三維重建，可見Scl-Ab組、PTH組和PTH+Scl-Ab組骨小梁數(shù)量較未用藥組明顯增多，且骨小梁更粗、聯(lián)系更為緊密，見圖1。

2.2 4組大鼠左側(cè)脛骨干骺端微觀參數(shù)比較 藥物治療12周后，與未用藥組比較，Scl-Ab、PTH、PTH+Scl-Ab組大鼠脛骨干骺端微觀參數(shù)均明顯改善（其中BMD分別較未用藥組增加了19.09%、28.62%和39.26%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；與PTH組、Scl-Ab組比較，PTH+Scl-Ab組脛骨干骺端微觀參數(shù)改善更為明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

圖1 4組大鼠用藥12周后左側(cè)脛骨干骺端ROI Micro-CT三維重建結(jié)果（a：未用藥組；b：Scl-Ab組；c：PTH組；d：PTH+Scl-Ab組）

表1 4組大鼠用藥12周后左側(cè)脛骨干骺端微觀參數(shù)比較

2.3 4組大鼠左側(cè)脛骨HE組織切片所見比較 由圖2可見Scl-Ab組、PTH組和PTH+Scl-Ab組骨小梁之間聯(lián)系緊密，排列規(guī)律，且脛骨干骺端骨量高于未用藥組；未用藥組骨小梁稀疏、纖細(xì)，部分出現(xiàn)斷裂。由圖3可見，與未用藥組比較，Scl-Ab組、PTH組和PTH+Scl-Ab組大鼠脛骨局部骨組織礦化明顯，其中PTH+Scl-Ab組最為明顯。

圖2 4組大鼠用藥12周后左側(cè)脛骨干骺端HE組織切片所見（a：未用藥組；b：Scl-Ab組；c：PTH組；d：PTH+Scl-Ab組）

圖3 4組大鼠用藥12周后左側(cè)脛骨干骺端骨礦化情況（a：未用藥組；b：Scl-Ab組；c：PTH組；d：PTH+Scl-Ab組）

2.4 4組大鼠右側(cè)脛骨骨生物力學(xué)檢測結(jié)果比較 Scl-Ab組、PTH組和PTH+Scl-Ab組最大載荷、剛度值均高于未用藥組（均P＜0.05），其中PTH+Scl-Ab組最大載荷、剛度值分別高于Scl-Ab組和PTH組（均P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠用藥12周后右側(cè)脛骨骨生物力學(xué)檢測結(jié)果

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低、骨組織結(jié)構(gòu)發(fā)生退變的骨骼疾病，會使骨脆性增加，骨強度下降，從而導(dǎo)致骨折[6]。隨著全球老齡化的進(jìn)展，骨質(zhì)疏松癥患病率不斷升高，骨質(zhì)疏松癥引起的骨折已成為全球難題，如何防治骨質(zhì)疏松癥成為臨床醫(yī)生面臨的一項巨大挑戰(zhàn)[7]。目前抗骨質(zhì)疏松藥物主要有二膦酸鹽類、地諾單抗、雌激素等，臨床治療效果均可，但亦存在一些不利因素，如人體對二膦酸鹽類的吸收率低，不適用于有血栓栓塞性疾病或腎功能不全者[8]；使用地諾單抗時易出現(xiàn)下頜骨壞死[9]；雌激素的使用會增加婦科腫瘤發(fā)病率。間歇性小劑量使用PTH具有促進(jìn)骨合成代謝、改善骨微結(jié)構(gòu)、增加骨量的作用；本實驗結(jié)果證實骨質(zhì)疏松大鼠經(jīng)PTH治療12周后脛骨干骺端微觀參數(shù)明顯改善，骨量增加，與未用藥組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。而Scl-Ab可以負(fù)向調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白活動[10]，亦可與Wnt通路共受體，與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6結(jié)合，從而調(diào)控骨的生長[11]。Scl-Ab可以特異性拮抗Scl的活性來影響骨代謝[12]，在刺激成骨活動的同時又不會刺激破骨活動，即其對骨合成代謝具有明顯刺激作用[13]；此外，Scl-Ab可以降低骨溶解標(biāo)志物血清C端肽水平，具有抑制骨分解的作用[14]。本實驗結(jié)果證實Scl-Ab可以明顯增加大鼠脛骨干骺端骨量，加速骨組織礦化，提高骨強度，與未用藥組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

本實驗使用雌性SD大鼠切除雙側(cè)卵巢12周來建立骨質(zhì)疏松模型，通過使用PTH和Scl-Ab來改變雙側(cè)卵巢切除大鼠的骨代謝，經(jīng)藥物治療12周后處死大鼠取雙側(cè)股骨行Micro-CT、HE組織切片、骨生物力學(xué)檢測。實驗結(jié)果表明相對于未使用藥物、單獨使用PTH或Scl-Ab，PTH+Scl-Ab聯(lián)合使用更能明顯增加脛骨BMD，提高脛骨干骺端微觀參數(shù)，保護(hù)骨小梁的質(zhì)和量，加速骨組織礦化，增加脛骨最大載荷和剛度值；提示聯(lián)合使用PTH和Scl-Ab在骨質(zhì)疏松癥治療中具有互相促進(jìn)、疊加治療的作用。目前具體機制尚未清楚，可能與兩者促進(jìn)骨形成的機制有關(guān)。PTH具有強烈促進(jìn)成骨作用的同時增強破骨細(xì)胞活性，而Scl-Ab具有抑制破骨細(xì)胞的作用但又不影響PTH成骨作用，這與PTH和二膦酸鹽類聯(lián)合使用不同，二膦酸鹽類抑制破骨細(xì)胞活性的同時會影響PTH的成骨效果；而Scl-Ab抑制骨吸收且不影響到破骨細(xì)胞活性[12]，可增加骨形成，因此不會影響PTH的作用，從而說明PTH和Scl-Ab聯(lián)合使用具有疊加治療的作用。

本次實驗從體外證實了聯(lián)合使用PTH和Scl-Ab治療雌性SD大鼠骨質(zhì)疏松癥的療效明顯，為其在臨床推廣使用提供了實驗基礎(chǔ)。但是人體環(huán)境復(fù)雜，仍需進(jìn)一步研究。

[1] Ishtiaq S,Fogelman I,Hampson G.Treatment ofpost-menopausal osteoporosis:beyond bisphosphonates[J].Journal of EndocrinologicalInvestigation,2015,38(1):13-29.

[2] Cairoli E,Zhukouskaya VV,Eller-Vainicher C,et al.Perspectives on osteoporosis therapies[J].Journal of Endocrinological Investigation,2015,38(3):303-311.

[3] Compston J E.Skeletal actions of intermittent parathyroid hormone:effects on bone remodelling and structure[J].Bone,2007, 40(6):1447-1452.

[4] H C.Wnt/beta-catenin signaling in development and disease[J]. Cell,2006,127(3):469-480.

[5] Viaene L,Behets G J,Claes K,et al.Sclerostin:another bone-related protein related to all-cause mortality in haemodialysis?[J]. Nephrology Dialysis Transplantation,2013,28(12):3024-3030.

[6] Kawate H,Takayanagi R.Efficacy and safety of bazedoxifene for postmenopausal osteoporosis[J].Clinical Interventions in Aging, 2010,6(1):151-160.

[7] Burge R,Dawson-hughes B,Solomon D H,et al.Incidence and economic burden of osteoporosis-related fractures in the United States,2005-2025[J].Journal of Bone&Mineral Research,2007, 22(3):465-475.

[8] Warriner A H,Saag K G.Osteoporosis diagnosis and medical treatment[J].Orthopedic Clinics of North America,2013,44(2): 125-135.

[9] Yee A J,Raje N S.Denosumab,a RANK ligand inhibitor,for the management of bone loss in cancer patients[J].ClinicalInterventions in Aging,2012,7(12):331-338.

[10] Moester MJ C,Papapoulos S E,Lo wik C WG M,et al.Sclerostin: current knowledge and future perspectives[J].Calcified Tissue International,2010,87(2):99-107.

[11] Ellies D L,Viviano B,Mccarthy J,et al.Bone density ligand,sclerostin,directly interacts with LRP5 but not LRP5G171Vto modu-late wnt activity[J].JournalofBone&MineralResearch,2006,21 (21):1738-1749.

[12] Gamie Z,Korres N,Leonidou A,et al.Sclerostin monoclonal antibodies on bone metabolism and fracture healing[J].Expert Opinion on InvestigationalDrugs,2012,21(10):1523-1534.

[13] Okazaki R.Anti-sclerostin antibodies[J].Clinical Calcium,2011, 21(1):94-98.

[14] Padhi D,Jang G,Stouch B,et al.Single-dose,placebo-controlled,randomized study of AMG 785,a sclerostin monoclonal antibody[J].Journal of Bone and Mineral Research the Official Journal of the American Society for Bone&Mineral Research, 2011,26(1):19-26.

Effect of combined treatment with parathyroid hormone and sclerostin antibody capsules in the treatment of osteoporosis in female SD rats

CHEN Xin,PAN Yuehao,JIN Guohua,et al.Department of Orthopaedics,Yiwu Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Yiwu 322000,China

【 Abstract】 Objective To investigate the efficacy of parathyroid hormone(PTH)and sclerostin antibody (Scl-Ab)for treatment of osteoporosis in female SD rats. Methods Female SD rats underwent bilateral ovariectomy (OVX,n=65)or sham-operation(sham,n=5).Five overiectomized rats were randomly selected and bone mass density(BMD)of tibia was measured to approve the success of osteoporosis model.The remaining overiectomized rats were randomly divided into 4 groups with 15 in each group.PTH(60μg/kg,3/wk),Scl-Ab(25mg/kg,2/wk)and PTH(60μg/kg,3/wk)plus Scl-Ab(25mg/kg,2/wk)were injected subcutaneously for 12 wks to rats in PTH,Scl-Ab and PTH+Scl-Ab groups respectively,no drugs were given to rats in OVX group.The tibial metaphyseals of rats were harvested for evaluation.The results of treatment for osteoporosis were evaluated by micro-computerized tomography (micro-CT),histological examination and biomechanical measurement. Results Comparison with OVXgroup,the tibial metaphyseals from groups Scl-Ab,PTH and PTH+Scl-Ab showed a higher BMD, BV/TV,Tb Th,Tb N,Conn D,maximum load,stiffness and a lower Tb Sp,and the effects were strongest in PTH+Scl-Ab group. The effect of Scl-Ab or PTH alone was significantly lower than that of combined use in prevention and treatment of osteoporosis of ovariectomized rats. Conclusion The results indicate that Scl-Ab plus PTH had an additive effect on osteoporosis in overiectomized rat.

OVXrats Parathyroid hormone Osteoporosis Sclerostin antibody

2016-07-19）

（本文編輯：陳丹）

322000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬義烏醫(yī)院（義烏市中心醫(yī)院）骨科

陳欣，E-mail：ywchenxin@163.com