金閨秀 楊海濤 林毅 鐘惠珍

核糖核苷酸還原酶小亞基M2在宮頸鱗癌組織中的表達及臨床意義

金閨秀 楊海濤 林毅 鐘惠珍

目的 探討核糖核苷酸還原酶小亞基M2（RRM2）在宮頸鱗癌中的表達。方法采用免疫組化法檢測20例宮頸上皮內(nèi)瘤變2～3級組織、68例宮頸鱗癌組織和18例正常宮頸組織中RRM2蛋白表達，并分析與臨床病理參數(shù)及腫瘤標志物之間的關系。結果RRM2在宮頸鱗癌組織中蛋白陽性表達率為82．35%，明顯高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織（55．00%）和正常宮頸組織（11．11%），3組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。不同組織分化程度、血清鱗狀細胞癌抗原（SCC）陽性與否的宮頸鱗癌患者RRM2蛋白陽性表達率差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0．01），即高分化組低于中、低分化組，SCC陽性組高于SCC陰性組。結論RRM2在宮頸鱗癌組織中高表達，且組織分化低、血清SCC陽性者的RRM2蛋白陽性表達率偏高。

宮頸鱗癌 核糖核苷酸還原酶M2 免疫組化 鱗癌相關抗原

核糖核苷酸還原酶（RR）是生物體細胞內(nèi)唯一能夠催化核糖核苷酸轉化為脫氧核糖核苷酸的酶，是DNA通路中合成與修復的限速酶。人RR全酶由大亞基RRM1與小亞基RRM2或RRM2B組成，形成兩種不同形式RR酶，即RRM1/RRM2和RRM1/RRM2B；全酶的活性由RRM2蛋白的表達水平?jīng)Q定[1]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)RRM2在胃癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤中過表達[2-4]，與腫瘤發(fā)生發(fā)展、細胞遷移及侵襲能力、耐藥的產(chǎn)生、預后等相關；但是關于RRM2在宮頸癌中表達的研究較少。因此，筆者采用免疫組化技術檢測68例原發(fā)性宮頸鱗癌組織、20例宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和18例正常宮頸組織中RRM2蛋白表達情況，以探討RRM2表達在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 收集寧波市婦女兒童醫(yī)院2010年2月至2012年9月手術切除的宮頸上皮內(nèi)瘤變2～3級標本20例、宮頸鱗癌病理標本68例為研究對象，均經(jīng)病理學確診。標本采集前所有患者無放化療史和免疫治療史。宮頸上皮內(nèi)瘤變患者年齡29～63歲，中位年齡44歲；宮頸鱗癌患者年齡31～67歲，中位年齡46歲。根據(jù)病理結果判定宮頸鱗癌組織分化程度，高分化19例，中分化42例，低分化7例；根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2000年修訂的標準劃分臨床分期，Ⅰ期48例，Ⅱ期20例；淋巴轉移者9例，無淋巴轉移者59例。選擇同期因良性病變行子宮全切除術的正常宮頸組織18例為對照組，術后病理檢查示宮頸組織無病變，年齡36～58歲，中位年齡47歲。以上所有標本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，用于HE染色和免疫組化檢測，且經(jīng)高年資病理醫(yī)師再次閱片重新核對與明確診斷。

1.2 主要試劑 羊抗人RRM2抗原特異性單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；鏈霉菌抗生物蛋白-過氧化物酶（S-P）免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒等購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。

1.3 方法 采用S-P免疫組化法檢測RRM2蛋白表達，一抗（1∶200稀釋）4℃濕盒過夜，加熱抗原修復法修復抗原，DAB顯色，其余步驟嚴格按照試劑盒說明書操作。以PBS代替一抗作為陰性對照，RRM2已知陽性切片作為陽性對照。免疫組化結果判定標準：參照相關文獻標準[2]，由2名高年資病理醫(yī)師判定結果。RRM2主要表達于細胞質(zhì)中，每張切片隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞。RRM2細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，陽性細胞占總細胞數(shù)的百分比≥10%為RRM2陽性，＜10%為RRM2陰性。68例宮頸鱗癌中血清鱗狀細胞癌抗原（SCC）和癌胚抗原（CEA）相關數(shù)據(jù)為宮頸癌患者入院常規(guī)抽血檢測所得。SCC≥1.5ng/ml為陽性，CEA≥5.0ng/ml為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher’s確切概率法，檢驗標準α取0.05；兩兩比較采用χ2分割法，檢驗標準α取0.0167。

2 結果

2.1 RRM2在不同宮頸組織中的蛋白表達 免疫組化檢測結果顯示RRM2蛋白主要定位于細胞質(zhì)，表現(xiàn)為棕黃色顆粒，見圖1。RRM2蛋白在正常宮頸組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變2～3級組織和宮頸鱗癌組織中陽性表達率分別為11.11%（2/18）、55.00%（11/20）和82.35%（56/ 68），3組差異有統(tǒng)計學意義（χ2=32.90，P＜0.05）；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌組織RRM2蛋白表達陽性率高于正常宮頸組織和宮頸上皮內(nèi)瘤變組織（均P＜0.0167），宮頸上皮內(nèi)瘤變組織RRM2蛋白表達陽性率高于正常宮頸組織（P＜0.0167）。

圖1 RRM2在不同宮頸組織中的蛋白表達（A：RRM2在正常宮頸組織中呈陰性表達；B：RRM2在宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中的表達；C：RRM2在宮頸鱗癌組織中的表達；免疫組化染色，×400）

2.2 宮頸鱗癌中RRM2蛋白表達與臨床病理參數(shù)及腫瘤標志物的關系 不同年齡、臨床分期、有無淋巴結轉移、腫瘤標志物CEA陽性與否等宮頸鱗癌患者的RRM2蛋白陽性表達率差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；但在宮頸鱗癌組織分化程度、血清SCC方面差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），即RRM2蛋白陽性表達率高分化組低于中、低分化組，SCC陽性組高于SCC陰性組，見表1。

3 討論

RR是DNA通路中合成與修復的關鍵酶，對細胞增殖、生長和分化具有重要作用?？焖僭鲋呈悄[瘤細胞的重要特征之一，它可以調(diào)控RR酶活性和表達，提供比正常細胞更多的脫氧核糖核苷酸進行DNA合成。大亞基RRM1在增殖細胞的整個細胞周期中表達水平相對恒定；小亞基RRM2的表達則有細胞周期依賴性，它在G1晚期開始合成，在S期達到高峰[5]。

有研究顯示RRM2在很多腫瘤中過表達，從而促進腫瘤浸潤和細胞轉化，對腫瘤轉移、預后和耐藥均產(chǎn)生影響[6]。有文獻報道采用基因表達譜芯片技術，發(fā)現(xiàn)妊娠滋養(yǎng)細胞疾病葡萄胎組織、絨毛癌細胞中RRM2表達水平分別高于正常胎盤組織、絨毛細胞[7]。Wang等[4]通過免疫組化法和RT-PCR法證實RRM2蛋白、MicroRNA在上皮性卵巢癌組織中表達上調(diào)，RRM2表達水平與卵巢癌臨床分期、預后相關，隨訪結果顯示卵巢癌RRM2低表達患者5年生存率高于RRM2高表達者。Aird等[8]亦證實RRM2在上皮性卵巢癌細胞中表達高于正常卵巢上皮細胞、輸卵管細胞，RRM2表達水平與腫瘤分期、分級相關，RRM2高表達者預示著更低的生存率，下調(diào)RRM2表達可促進腫瘤細胞死亡。Morikawa等[2]研究發(fā)現(xiàn)RRM2蛋白在胃癌組織中高表達，與胃癌分期、EB病毒感染、分子標記物如Survivin、DNMT1等相關；RRM2與胃癌的進展相關；同時發(fā)現(xiàn)通過RNA干擾技術下調(diào)RRM2表達，可抑制胃癌細胞增殖。其他腫瘤包括肝癌、結直腸癌、乳腺癌和胰腺癌等也存在RRM2高表達[3,6,9-10]。基礎研究發(fā)現(xiàn)，RRM2與一系列癌基因如v-fms、v-src、A-raf、v-fes和c-myc等協(xié)同促進細胞轉化和腫瘤形成等[11]。此外，RRM2過表達會增強腫瘤細胞的侵襲力，其機制主要是通過激活NF-κB，從而促進基質(zhì)金屬蛋白酶9表達增多[12]；而基質(zhì)金屬蛋白酶9在促進腫瘤侵襲和轉移中具有重要作用[13]。

表1 宮頸鱗癌組織中RRM2表達與臨床病理參數(shù)及腫瘤標志物的關系[例（%）]

Kunos等[14]采用免疫組化法檢測18對宮頸良性組織和Ib2期宮頸癌組織中RR各亞基表達情況，結果顯示RRM2在宮頸良性組織中低表達（0～1+），而在宮頸癌組織中有16例呈強陽性表達（3+）。我們之前研究采用qPCR法定量檢測45例宮頸癌組織及相應癌旁組織中RRM2 MicroRNA表達情況，結果顯示宮頸癌組織中RRM2 MicroRNA表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義[15]。RR表達水平的變化可顯著影響細胞生物學特性，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。本研究采用免疫組化法檢測不同宮頸組織中RRM2蛋白表達情況，并分析宮頸鱗癌中RRM2蛋白陽性表達率與臨床病理特征、血清腫瘤標志物的關系。結果表明RRM2蛋白在宮頸鱗癌組織中的陽性表達率明顯高于正常宮頸組織和宮頸上皮內(nèi)瘤變2～3級組織，提示宮頸細胞增殖能力較強。此外，高分化組中RRM2蛋白陽性表達率明顯低于中、低分化組，提示RRM2表達增多可能對宮頸鱗癌進展起著一定作用，RRM2可能與宮頸鱗癌細胞的侵襲性有關。由此可見，RRM2的高表達可能與宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展有關。

目前宮頸癌的血清腫瘤標志物包括SCC、CEA、細胞角蛋白19片段抗原、血清中可溶性CD44等，其中SCC特異性較高，對宮頸鱗癌輔助診斷、療效評價和預后監(jiān)測具有重要臨床意義[16]。相關研究表明，血清SCC水平與宮頸鱗癌的臨床分期、腫瘤大小、組織分化程度、肌層浸潤深度、淋巴結轉移相關[17]。SCC高水平意味著宮頸癌患者對化療的靈敏度差，易復發(fā)等[18]。但是，宮頸癌早期SCC陽性率較低，不宜作為早期篩查的指標。本研究結果顯示宮頸鱗癌組織中RRM2蛋白表達水平與血清SCC有關，但有待進一步研究驗證。

綜上所述，RRM2在宮頸鱗癌組織中高表達，且組織分化低、血清SCC陽性者的RRM2蛋白陽性表達率偏高。但是，RRM2在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制以及聯(lián)合RRM2與SCC的診斷價值尚待進一步研究。

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Expression of ribonucleotide reductase subunit M2 in cervical squamous-cell carcinoma tissues

JIN Guixiu. YANG Haitao. LIN Yi. et al. Department of Obstetrics and Gymecology. Taizhou First People's Hospital. Taizhou 318020. China

ObjectiveTo investigate protein expression of ribonucleotide reductase subunit M2(RRM2)in cervical squamous-cell carcinoma．MethodsThe expression of RRM2 was detected by immunohistochemistry staining in 68 specimens of cervical squamous-cell carcinoma,20 specimens of cervical intraepithelial neoplasm(CIN)and 18 specimens of normal cervical tissue．The relationship of RRM2 expression with clinicopathology features and tumor biomarkers was analyzed．ResultsThe positive RRM2 expression rate in cervical squamous-cell carcinoma tissue(82．35%)was significantly higher than that in CIN (55．00%)and normal cervical tissue(11．11%)(P＜0．05)．The positive expression rate of RRM2 in well-differentiated carcinoma was lower than that in moderately-and poorly-differentiated carcinoma．The expression of RRM2 in serum squamous cell carcinoma antigen(SCCA)positive group was higher than that in SCCA negative group(P＜0．01)．ConclusionThe overexpression of RRM2 is found in cervical squamous-cell carcinoma,in particular,in those with lower differentiation degree and with positive serum SCCA．

Cervical squamous neoplasm RRM2 Immunohistochemistry Squamous cell carcinoma-related antigen

2015-10-14）

（本文編輯：陳丹）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃（2014KYB241）

318020 臺州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科（金閨秀）；寧波市臨床病理診斷中心（楊海濤）；寧波市婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科（林毅、鐘惠珍）

鐘惠珍，E-mail：nbfeyyzhz@163.com