王享利

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410008）

論著

缺氧對前列腺癌細(xì)胞糖酵解及遷移侵襲能力的影響

王享利

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院衛(wèi)生部納米生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410008）

目的探討缺氧狀態(tài)下前列腺癌細(xì)胞糖酵解和體外遷移侵襲能力的改變。方法將前列腺癌細(xì)胞DU145和/或PC-3分別置于常氧及缺氧環(huán)境中培養(yǎng)24和48 h，侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測前列腺癌細(xì)胞體外遷移及侵襲能力改變。分別檢測上清液中葡萄糖含量、乳酸含量；實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)改變。結(jié)果前列腺癌細(xì)胞DU145經(jīng)缺氧處理后，體外遷移及侵襲能力較常氧處理增強(qiáng)。同時缺氧處理后，DU145和PC-3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中葡萄糖含量減少，腫瘤細(xì)胞攝入葡萄糖能力提高，糖酵解代謝產(chǎn)物乳酸在上清液中增加。qRT-PCR結(jié)果表明，缺氧處理后DU145細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因。結(jié)論缺氧處理能增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的體外遷移及侵襲能力，同時通過改變糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，對前列腺癌細(xì)胞的糖酵解過程發(fā)揮調(diào)控作用。

前列腺癌；缺氧；糖酵解；遷移；侵襲

缺氧是大部分實(shí)體腫瘤微環(huán)境改變的主要特征。腫瘤缺氧微環(huán)境能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展，包括引起轉(zhuǎn)移、耐藥及放療抵抗等[1-2]。缺氧是腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展及有利于腫瘤細(xì)胞生存的微環(huán)境重建的關(guān)鍵因素?，F(xiàn)有研究表明，腫瘤細(xì)胞自身存在著對缺血、缺氧的自身調(diào)節(jié)和適應(yīng)機(jī)制，其主要是通過誘導(dǎo)腫瘤新生血管和能量代謝轉(zhuǎn)換來適應(yīng)新的環(huán)境，產(chǎn)生生存優(yōu)勢[3-4]。其中腫瘤細(xì)胞能量代謝轉(zhuǎn)換，主要指腫瘤細(xì)胞通過提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)利用能力，發(fā)生無氧狀態(tài)下的糖酵解，以供腫瘤細(xì)胞生存惡性進(jìn)展所需能量和生物大分子合成所需的原料[5-6]。本研究旨在探討缺氧處理對前列腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，以及糖酵解過程的變化情況。

1 材料與方法

1.1 前列腺癌細(xì)胞培養(yǎng)

本研究所選用的前列腺癌細(xì)胞株有DU145和PC-3細(xì)胞。兩種細(xì)胞均購自中南大學(xué)細(xì)胞生物中心，培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為改良伊格爾培養(yǎng)基/F12（1∶1），外加濃度10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%的雙抗（100 u/ml青霉素和100 u/ml鏈霉素）。上述細(xì)胞常規(guī)處理均在37℃、5%二氧化碳CO2、21%氧氣O2、74%氮?dú)釴2飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所選用細(xì)胞均為對數(shù)生長期、無污染細(xì)胞。

1.2 缺氧處理

將前列腺癌細(xì)胞DU145和PC-3放置于37℃、5%CO2，1%O2、94%N2飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)時間根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。?shí)驗(yàn)所選用細(xì)胞均為對數(shù)生長期、無污染細(xì)胞。

1.3 前列腺癌細(xì)胞缺氧及常氧處理后細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)遷移實(shí)驗(yàn)所用的Transwell小室內(nèi)無需鋪基質(zhì)膠，置于24孔板中。侵襲實(shí)驗(yàn)基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基1∶8稀釋，50 ml/小室均勻鋪于小室底部，于37℃放置2 h后置于24孔板中。將5×105個細(xì)胞（200 ml）接種于上室，下室加入500 ml完全培養(yǎng)基，處理組加入不同藥物。培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)下室和上室細(xì)胞數(shù)，計(jì)算遷移率和侵襲率［下室細(xì)胞數(shù)/（上室細(xì)胞數(shù)+下室細(xì)胞數(shù)）×100%］。

1.4 前列腺癌細(xì)胞缺氧及常氧處理后上清液葡萄糖和乳酸含量檢測

前列腺癌細(xì)胞經(jīng)常氧和缺氧處理24和48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測上清液中葡萄糖含量。采用比色法檢測上清液乳酸含量，試劑盒購自南京建成生物公司。

1.5 實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)

采用microRNA（miRNA）提取試劑盒分別提取各組細(xì)胞總RNA，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。用生化分析儀2100 Bioanalyzer定量，瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性?？俁NA反轉(zhuǎn)錄后的第一鏈互補(bǔ)脫氧核糖核酸為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性20 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，共40個循環(huán)，以U6小核核糖核酸（small nuclear ribonucleic acid，snRNA）作為內(nèi)參，繪制擴(kuò)增融解圖，將樣本miRNA與U6 snRNA基因含量的差值作為評價(jià)miRNAs相對表達(dá)水平的指標(biāo)，據(jù)公式ΔCt=[Ct（miRNA）]-[ct（U6snRNA）]，取ΔCt的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）為檢測結(jié)果。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)或隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧增強(qiáng)前列腺癌DU145細(xì)胞的體外遷移及侵襲能力

缺氧處理48 h后Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，前列腺癌DU145細(xì)胞的遷移和侵襲能力較常氧處理組細(xì)胞提高（P＜0.05），表明前列腺癌DU145細(xì)胞在缺氧處理后，體外遷移及侵襲能力均較常氧情況下提高。見圖1。

圖1 常氧和缺氧條件下DU145遷移和侵襲能力比較

2.2 缺氧降低前列腺癌細(xì)胞上清液中葡萄糖，增加乳酸含量

前列腺癌細(xì)胞DU145和PC-3細(xì)胞分別經(jīng)過24和48 h常氧及缺氧處理，并于不同處理時間收取兩種細(xì)胞的培養(yǎng)液，離心去沉渣后，檢測上清液中殘留的葡萄糖和乳酸含量。結(jié)果表明，前列腺癌細(xì)胞DU145及PC-3經(jīng)缺氧處理后，與常氧處理細(xì)胞細(xì)胞相比，兩種細(xì)胞上清液中的葡萄糖含量下降，而乳酸含量升高。該結(jié)果初步提示缺氧處理后，前列腺癌細(xì)胞利用葡萄糖的能力可能明顯增加，才導(dǎo)致上清液中葡萄糖含量的顯著減少，并導(dǎo)致產(chǎn)生更多的代謝產(chǎn)物乳酸。見表1、2。

表1 缺氧處理后前列腺癌細(xì)胞利用葡萄糖的變化（μg/ml±s）

表1 缺氧處理后前列腺癌細(xì)胞利用葡萄糖的變化（μg/ml±s）

組別24 h 48 h常氧缺氧t值常氧缺氧t值P值DU1450.472±0.0230.175±0.0123.2760.0010.327±0.0610.094±0.0182.8950.002 PC-30.552±0.1340.184±0.0393.6840.0010.415±0.0750.138±0.0521.9760.004 P值

表2 缺氧處理后前列腺癌細(xì)胞利用乳糖的變化（μg/ml±s）

表2 缺氧處理后前列腺癌細(xì)胞利用乳糖的變化（μg/ml±s）

組別24 h 48 h常氧缺氧t值常氧缺氧t值P值DU1450.132±0.0180.449±0.0623.3340.0010.247±0.0890.694±0.1034.7920.001 PC-30.149±0.0260.573±0.1164.4820.0010.288±0.0430.773±0.1265.8290.001 P值

2.3 缺氧調(diào)控前列腺癌細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)

結(jié)果表明，前列腺癌細(xì)胞在缺氧情況下，糖酵解能力顯著提高。因此，筆者進(jìn)一步檢測糖酵解過程相關(guān)基因的表達(dá)。對所有基因qRT-PCR檢測的結(jié)果進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)方差分析發(fā)現(xiàn)，各基因組改變幅度不同（F=13.752，P=0.001），前列腺癌DU145細(xì)胞缺氧處理6、24和48 h，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1改變幅度最大，且在缺氧處理6 h就出現(xiàn)明顯變化（見圖2）。而隨著時間的延長，胃蛋白酶原、磷酸甘油酸激酶、6-磷酸果糖激酶2和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（monocarboxylate transporter-1，MCT1）亦出現(xiàn)顯著升高。表明缺氧處理，通過改變?nèi)毖跸嚓P(guān)代謝酶的表達(dá)水平，進(jìn)而引起腫瘤細(xì)胞無氧糖酵解水平的提高。

圖2 前列腺癌DU145細(xì)胞經(jīng)缺氧處理后糖酵解代謝相關(guān)基因的表達(dá)（±s）

3 討論

糖代謝是細(xì)胞的主要能量來源。葡萄糖在體內(nèi)經(jīng)糖酵解和氧化磷酸化兩條主要途徑氧化分解。糖酵解過程首先通過胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)入胞內(nèi)，通過糖酵解途徑生成丙酮酸，這一過程稱為糖酵解。丙酮酸在缺氧條件下轉(zhuǎn)化成乳酸，而在有氧條件下經(jīng)三羧酸循環(huán)和線粒體氧化磷酸化代謝途徑產(chǎn)生能量。細(xì)胞活性與自身能量代謝狀態(tài)緊密相關(guān)。惡性腫瘤細(xì)胞生長迅速，常伴有攝入胞內(nèi)的葡萄糖量增高、糖酵解活性提高和乳酸堆積等能量代謝轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象。除此以外，腫瘤細(xì)胞糖代謝另外一個重要特點(diǎn)，即使在常氧及有氧狀況下，腫瘤細(xì)胞均可以利用糖酵解過程為自身所用。在供氧充足的情況，葡萄糖依舊向乳酸轉(zhuǎn)換，腫瘤細(xì)胞的該種糖代謝方式稱為有氧酵解或Warburg效應(yīng)。相對而言，在缺氧狀態(tài)下，發(fā)生的糖酵解過程，則稱為無氧糖酵解[7]。

在缺氧狀態(tài)下及線粒體功能紊亂情況下，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)糖酵解的能量轉(zhuǎn)換容易理解，且該種能量轉(zhuǎn)換方式對腫瘤細(xì)胞的生存很重要。然而在有氧狀態(tài)下，腫瘤細(xì)胞同樣可以出現(xiàn)糖酵解。腫瘤細(xì)胞自身常伴隨著線粒體損傷及線粒體氧化磷酸化缺陷。線粒體DNA突變能影響與其氧化磷酸化相關(guān)酶的功能及活性，包括與三羧酸循環(huán)相關(guān)的酶，如琥珀酸脫氫酶，延胡索酸脫氫酶及異檸檬酸脫氫酶[8]。另外，腫瘤細(xì)胞糖酵解、三羧酸循環(huán)及氧化磷酸化途徑相關(guān)酶基因的突變，可造成腫瘤細(xì)胞能量代謝重組。例如，琥珀酸脫氫酶基因的突變，其會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞琥珀酸的積聚，進(jìn)而抑制脯氨酰羥化酶的活性，穩(wěn)定低氧誘導(dǎo)因子-1，這被稱為偽組織缺氧。由此可見，腫瘤細(xì)胞線粒體功能缺陷可導(dǎo)致其能量代謝的轉(zhuǎn)變，在促腫瘤惡性進(jìn)展過程中具有重要作用。但值得一提的是，線粒體DNA基因突變是把雙刃劍，發(fā)生線粒體DNA基因突變及功能紊亂的腫瘤細(xì)胞，其體外克隆形成能力及體內(nèi)成瘤能力明顯減弱，從該方面發(fā)揮抑瘤作用。

較多研究表明，糖酵解過程在惡性腫瘤細(xì)胞的多種惡性生物學(xué)行為進(jìn)展中發(fā)揮重要作用：①糖酵解增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的放療抵抗能力。MEIJER等[9]研究證實(shí)缺氧情況下的糖酵解能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗氧化殺傷能力，因此多層面同時靶向抑制關(guān)鍵缺氧應(yīng)答因子低氧誘導(dǎo)因子-1α及腫瘤的糖酵解過程，能降低腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力，影響腫瘤微環(huán)境，提高腫瘤細(xì)胞的放療敏感性。MENG等[10]亦在體內(nèi)外研究中闡明，抑制丙酮酸激酶M2能提高非小細(xì)胞肺癌的放療敏感性。②糖酵解能使腫瘤細(xì)胞對紫杉醇、5氟尿嘧啶、順鉑等多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性[11]。③最新研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境中的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞競爭微環(huán)境中的葡萄糖。而腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)的糖酵解能力，使其在競爭中具有明顯優(yōu)勢，因而造成包括T細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞發(fā)生功能缺陷，處于免疫抑制狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12-13]。④至于糖酵解在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的近年來報(bào)道較多，均表明糖酵解過程在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮積極作用。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞在缺氧處理后，出現(xiàn)遷移及侵襲能力的相應(yīng)提高，該過程中伴隨著前列腺癌細(xì)胞糖酵解過程的提高。提示缺氧可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，與ZOU等[14]在喉癌中的報(bào)道一致?，F(xiàn)有研究多表明，缺氧可引起相關(guān)癌基因的表達(dá)，從而參與到腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧處理情況下，前列腺癌細(xì)胞對葡萄糖的攝入和對乳酸的排出水平均提高。乳酸作為糖酵解過程的主要產(chǎn)物，是一種抗氧化劑，在腫瘤惡性進(jìn)展中亦發(fā)揮重要作用：①能保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受內(nèi)源性活性氧物質(zhì)及細(xì)胞毒性藥物治療的損。②乳酸能穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子-1α，而低氧誘導(dǎo)因子-1α由缺氧及促腫瘤信號途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生并穩(wěn)定，其活化同時能增加其他糖酵解基因的表達(dá)。③腫瘤組織內(nèi)乳酸的增加能促進(jìn)腫瘤血管新生并促進(jìn)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。④乳酸能損傷抗腫瘤免疫反應(yīng)，主要通過增加髓源性抑制細(xì)胞和減少NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。⑤乳酸可被耗氧腫瘤細(xì)胞利用，提供能量。CURRY等[16]在口腔癌中的研究發(fā)現(xiàn)，富含線粒體增殖能力旺盛的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)MCT1，MCT1則調(diào)控腫瘤細(xì)胞對乳酸的攝入能力。同時上述腫瘤細(xì)胞周圍存在線粒體不足增殖能力弱的腫瘤細(xì)胞，則高表達(dá)MCT4，MCT4則主要是被動地從糖酵解腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)出乳酸。因此，筆者提出Metabolic compartmentalization模型，認(rèn)為腫瘤組織中增殖能力弱，發(fā)生糖酵解的腫瘤細(xì)胞能釋放乳酸，以供增殖能力旺盛富含線粒體的腫瘤細(xì)胞利用，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。然而，有關(guān)該模型尚存在爭議。

與產(chǎn)生三磷酸腺甘（adenosine triphosphate，ATP）多的線粒體氧化磷酸化能量代謝方式比較，腫瘤細(xì)胞為何選用產(chǎn)能少的糖酵解代謝途徑？現(xiàn)有研究給筆者提出以下解釋：①糖酵解雖單次產(chǎn)生的ATP相對線粒體氧化磷酸化能量代謝方式產(chǎn)能少。然而腫瘤細(xì)胞糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸的循環(huán)速度快，產(chǎn)生的總體ATP高。糖酵解能量代謝的ATP生成速度比線粒體氧化磷酸化能量代謝方式快＞100倍。②除給腫瘤細(xì)胞提供足夠的ATP外，糖酵解途徑給腫瘤細(xì)胞提供細(xì)胞生物合成所需的必要代謝中間產(chǎn)物和前體。糖酵解代謝產(chǎn)物促進(jìn)磷酸戊糖途徑，生成還原型輔酶Ⅱ（triphosphopyridine nucleotide，NADPH）和核糖-5-磷酸，這兩種物質(zhì)均是脂肪及核酸合成所必需的。③有氧糖酵解促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療耐藥和放療抵抗。NADPH能給腫瘤細(xì)胞提供足夠的抗氧化劑還原型谷胱甘肽，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受化療藥物殺傷作用。④除影響糖酵解外，糖酵解過程相關(guān)酶及代謝中間產(chǎn)物可發(fā)揮癌基因作用，參與腫瘤進(jìn)展。1，6-果糖二磷酸能保持細(xì)胞色素C的還原非活化狀態(tài)，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用。同樣，丙酮酸促進(jìn)耐藥基因p-糖蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生。單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白除介導(dǎo)乳酸進(jìn)出入細(xì)胞外，還可誘導(dǎo)CD147的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。乳酸脫氫酶沉默能下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子人附睪蛋白4抑制胃癌的成瘤。

綜上所述，前列腺癌細(xì)胞在缺氧情況下，出現(xiàn)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)改變及糖酵解程度增強(qiáng)，同時體外侵襲轉(zhuǎn)移能力提高。前列腺癌細(xì)胞糖酵解及侵襲轉(zhuǎn)移之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)有待于進(jìn)一步研究。

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（童穎丹 編輯）

Hypoxia regulates glycolysis and metastasis of prostatic cancerin vitro

Xiang-li Wang
(Key Laboratory of Nanobiological Technology of Chinese Ministry of Health,Xiangya Hospital of Central South University,Changsha,Hunan 410008,China)

Objective To investigate the changes of glycolysis and metastasis of prostatic cancer under hypoxia.Methods DU145 and PC-3 cells were cultured in normoxia and hypoxia for 24 hours and 48 hours, respectively.Then,Transwell invasion assay was used to detect the changes of migration and invasion.The content of glucose and lactate in the supernatant of each group was examined by commercial kits.Finally, genes associated with glycolysis were quantified by qRT-PCR.Results The migratory and invasive abilities of DU145 cells were significantly increased after hypoxia treatment.Meantime,compared with the cells cultured in normoxia,DU145 and PC-3 cells treated with hypoxia showed decreased supernatant glucose,enhanced glucose uptaking ability and lactate secretion.qRT-PCR results demonstrated that genes associated with glucose metabolism were correspondingly changed under hypoxia.Conclusions Hypoxia promotes the migration and invasion of prostatic cancer cellsin vitro.Meantime,hypoxia can regulate the glycolysis of prostatic cancer cells via modulating expression of the genes associated with glycolysis.

prostatic cancer;hypoxia;glycolysis;migration;invasion

R736.8

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.007

1005-8982（2016）23-0032-05

2016-06-02