張春林，李柳金，李春雷，林季珍，鄧澤義，王科，劉兆輝

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 遵義 563003；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510282）

臨床論著

腺樣體肥大患兒鼻咽部分泌物中胃蛋白酶的檢測(cè)*

張春林1，李柳金1，李春雷1，林季珍1，鄧澤義2，王科1，劉兆輝1

（1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 遵義 563003；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東 廣州 510282）

目的檢測(cè)腺樣體肥大（AH）患兒鼻咽部分泌物中胃蛋白酶的表達(dá)，并探討其與AH的關(guān)系。方法選取AH患兒作為實(shí)驗(yàn)組，收集無(wú)腺樣體和扁桃體肥大的患兒作為對(duì)照組，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)鼻咽部分泌物和腺樣體組織中胃蛋白酶的表達(dá)，并進(jìn)行比較。分別根據(jù)AH合并或不合并扁桃體肥大和腺樣體的肥大程度對(duì)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行分組，比較亞組間胃蛋白酶的表達(dá)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中胃蛋白酶濃度和陽(yáng)性率分別為（2.801±1.544）和（1.074±0.387）ng/ml，55.8%（24/43）和0.0%（0/22），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。實(shí)驗(yàn)組亞組分析，AH不伴扁桃體肥大（A組）和AH伴有扁桃體肥大（B組）的胃蛋白酶濃度和胃蛋白酶陽(yáng)性率分別為（2.907±1.694）和（2.699±1.420）ng/ml，57.1%（12/21）和54.5%（12/22），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.568和0.864）；腺樣體Ⅱ度大亞組（堵塞后鼻孔＞75%）中胃蛋白酶濃度和陽(yáng)性率均高于腺樣體Ⅰ度大亞組（堵塞后鼻孔50%～75%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000和0.046）。結(jié)論部分AH患兒的鼻咽部分泌物中檢測(cè)到胃蛋白酶，胃內(nèi)容物的鼻咽部反流可能與AH有一定的關(guān)系。

腺樣體肥大；胃內(nèi)容物反流；鼻咽反流；胃蛋白酶；

腺樣體肥大（adenoid hypertrophy，AH）是小兒的常見(jiàn)病、多發(fā)病，既往認(rèn)為鄰近器官病變刺激、病原微生物感染及變態(tài)反應(yīng)等都是可能的病因[1]。近些年，胃內(nèi)容物的食管外反流在上呼吸道、消化道病變中的致病作用有逐漸被認(rèn)識(shí)，其中引起損傷的主要是胃酸和胃蛋白酶[2]。有研究提示，小兒鼻竇炎、分泌性中耳炎與胃內(nèi)容物反流進(jìn)入鼻腔、中耳腔有關(guān)[2-5]。由于胃內(nèi)容物反流到鼻腔、中耳腔，必須經(jīng)過(guò)腺樣體表面，刺激淋巴組織免疫應(yīng)答而導(dǎo)致增生，所以腺樣體肥大與胃內(nèi)容物反流的相關(guān)性也逐漸被認(rèn)識(shí)[6]。由于胃蛋白酶僅存在于胃內(nèi)，在其他部位檢測(cè)到胃蛋白酶可以作為胃內(nèi)容物反流的一種方法，本課題通過(guò)檢測(cè)鼻咽部分泌物和腺樣體組織內(nèi)胃蛋白酶的表達(dá)，探討胃內(nèi)容物鼻咽部反流與腺樣體肥大的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2013年5月-2014年10因鼻塞、張口呼吸、打鼾等癥狀就診于本院，經(jīng)鼻咽鏡檢查確診為腺樣體肥大的患兒（腺樣體堵塞后鼻孔＞50%）作為實(shí)驗(yàn)組。選取因耳前瘺管、耳鼻喉科外傷等需行全身麻醉手術(shù)的患兒，并排除合并腺樣體和扁桃體肥大，無(wú)喉咽反流及胃食管反流癥狀作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個(gè)月內(nèi)曾使用質(zhì)子泵抑制劑等抑酸藥物；②患有免疫系統(tǒng)疾病或有其他嚴(yán)重系統(tǒng)疾??；③2周內(nèi)曾發(fā)生過(guò)上呼吸道感染。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)施通過(guò)遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，所有實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的獲得及使用經(jīng)患者家屬書面同意。本研究中實(shí)驗(yàn)組患者43例，男性23例，女性20例；年齡2.5～10.0歲，平均5.4歲；病程3～52個(gè)月，平均16.3個(gè)月。對(duì)照組22例，男性14例，女性8例。年齡2.8～12.0歲，平均6.2歲。兩組患兒在性別、年齡方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.316和0.627）。

1.2 胃蛋白酶的檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosor bent assay，ELISA）可以定量檢測(cè)唾液、中耳分泌物等胃液外體液中的胃蛋白酶濃度[7-9]，本研究使用ELISA進(jìn)行鼻咽部分泌和腺樣體組織中胃蛋白酶濃度的定量測(cè)定。所有標(biāo)本的收集于全身麻醉生效后進(jìn)行，鼻內(nèi)鏡下用5 ml注射器連接鼻腔吸管收集鼻咽部分泌物2 ml，置于-80℃凍存?zhèn)溆?。?duì)腺樣體肥大需行腺樣體切除術(shù)的患兒，術(shù)中在鼻內(nèi)鏡直視下切除腺樣體，在保證病理檢查所需組織量后，留取約1 cm2組織置于-80℃冰箱冷凍備用。檢測(cè)鼻咽部分泌物標(biāo)本時(shí)，若分泌物黏稠，則先以0.1%二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DDT）4倍體積充分混勻，37℃水浴10 min。對(duì)于腺樣體組織，用生理鹽水反復(fù)沖洗掉分泌物及血跡，用眼科剪剪碎組織，勻漿，全程冰上操作。所有標(biāo)本均4℃、5 000 r/min離心15 min，取上清液，加入到人胃蛋白酶ELISA試劑盒（北京永輝生物技術(shù)有限公司），用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）檢測(cè)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)品濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得濃度呈現(xiàn)較好的一致性，R2=0.98。由于正常兒童也可能存在生理性的胃內(nèi)容物反流，本研究先用對(duì)照組標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定胃蛋白酶濃度調(diào)零，獲得標(biāo)本的最終胃蛋白酶濃度，根據(jù)工作曲線及參考已發(fā)表文獻(xiàn)[9]，檢測(cè)陽(yáng)性的分界值設(shè)為2.5 ng/ml，即濃度＞2.5 ng/ml說(shuō)明在標(biāo)本中胃蛋白酶為陽(yáng)性，提示可能存在病理性反流。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，滿足正態(tài)分布和方差齊性的用t檢驗(yàn)，不滿足者則用Wilcoxon檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較用Pearson’s χ2檢驗(yàn)或者Fisher’s精確概率法（n＜40或T＜1），檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃蛋白酶的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組鼻咽分泌物中胃蛋白酶濃度和胃蛋白酶陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。實(shí)驗(yàn)組胃蛋白酶濃度和陽(yáng)性率均高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組有3例腺樣體組織中檢測(cè)到胃蛋白酶，該3例患者的鼻咽分泌物中胃蛋白酶濃度與實(shí)驗(yàn)組的濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.030），腺樣體組織中檢測(cè)到胃蛋白酶的患者濃度更高。見(jiàn)表1和圖1。

表1 兩組患兒鼻咽部分泌物中胃蛋白酶表達(dá)量的比較

圖1 各組患者胃蛋白酶的表達(dá)水平

2.2腺樣體肥大胃蛋白酶表達(dá)的亞組分析

以扁桃體超出腭舌弓與懸雍垂連線的中線位置作為扁桃體肥大的標(biāo)準(zhǔn)，將實(shí)驗(yàn)組進(jìn)一步分為兩個(gè)亞組，即：腺樣體肥大不伴扁桃體肥大（A組，21例）；腺樣體肥大伴有扁桃體肥大（B組，22例）。A組和B組胃蛋白酶平均濃度分別為（2.907±1.694）和（2.699± 1.420）ng/ml，胃蛋白酶陽(yáng)性率分別為57.1%（12/21），54.5%（12/22），亞組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.568和0.864）。本研究進(jìn)一步進(jìn)行鼻咽部胃蛋白酶表達(dá)水平與腺樣體肥大程度的亞組分析，根據(jù)腺樣體堵塞后鼻孔的程度，腺樣體肥大分為2度：Ⅰ度肥大堵塞后鼻孔50%～75%，35例；Ⅱ度肥大堵塞后鼻孔＞75%，8例。腺樣體Ⅱ度大亞組中胃蛋白酶濃度和胃蛋白酶陽(yáng)性率均高于腺樣體Ⅰ度大亞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000和0.046）。見(jiàn)表2和圖1、2。

表2 兩組患兒鼻咽部分泌物中胃蛋白酶陽(yáng)性率的比較

圖2 腺樣體堵塞后鼻孔不同程度患者的胃蛋白酶表達(dá)水平（±s）

3 討論

胃蛋白酶是由胃主細(xì)胞分泌的胃蛋白酶原在胃酸的作用下活化而來(lái)。正常生理狀態(tài)下，胃蛋白酶僅存在于胃液內(nèi)，而病理狀態(tài)下可以進(jìn)入上呼吸道和消化道，從而引起局部病變。有研究報(bào)道，在上呼吸道、消化道檢測(cè)到胃內(nèi)容物成分，如唾液、淚眼、中耳分泌物、鼻腔分泌物[3，7-9]，說(shuō)明胃內(nèi)容物反流可能是引起耳鼻喉科多種疾病的可能病因?，F(xiàn)在多數(shù)研究采用24 h pH酸度計(jì)檢測(cè)上呼吸道、消化道反流，但是24 h pH酸度計(jì)為有創(chuàng)檢查，多數(shù)患兒家屬難以接受。此外，由于胃內(nèi)容物反流包括酸性反流，膽汁（堿性）反流及中性反流，24 h pH酸度計(jì)對(duì)堿性反流或中性反流診斷意義較小。由于胃蛋白酶僅存在于胃內(nèi)，在其他部位檢測(cè)到胃蛋白酶可以作為胃內(nèi)容物反流的一種方法，SAMUELS等[10]對(duì)文獻(xiàn)綜合回顧分析，認(rèn)為檢測(cè)胃蛋白酶是診斷胃內(nèi)容物反流的敏感性高、無(wú)創(chuàng)、快速、方便的客觀診斷方法，KNIGHT等[11]發(fā)現(xiàn)，胃蛋白酶的診斷敏感性為100%，特異性為89%，可以應(yīng)用于監(jiān)測(cè)咽喉部反流事件。本研究通過(guò)檢測(cè)鼻咽部分泌物中胃蛋白酶來(lái)診斷胃內(nèi)容物的反流，發(fā)現(xiàn)腺樣體肥大患兒的鼻咽部胃蛋白酶陽(yáng)性率為55.8%，與KELES等[12]報(bào)道的通過(guò)24 h pH酸度計(jì)檢測(cè)的結(jié)果基本一致，證實(shí)檢測(cè)鼻咽部分泌物中的胃蛋白酶表達(dá)是檢測(cè)鼻咽反流事件簡(jiǎn)便、快捷的客觀檢查方法。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶的表達(dá)與腺樣體的肥大程度相關(guān)，說(shuō)明胃內(nèi)容物的鼻咽部反流可能與腺樣體肥大的發(fā)病相關(guān)。腺樣體肥大往往可以導(dǎo)致小兒鼾癥，而上呼吸道阻塞造成的呼吸努力產(chǎn)生過(guò)大的胸腔內(nèi)壓，加重胃內(nèi)容物反流，而過(guò)度的胃內(nèi)容物反流又可以進(jìn)一步刺激腺樣體增生，從而造成一個(gè)惡性循環(huán)[13]。本研究還發(fā)現(xiàn)，腺樣體肥大合并扁桃體肥大患兒的胃蛋白酶表達(dá)低于腺樣體肥大不合并扁桃體的患者，雖然由于納入病例數(shù)的限制，結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，筆者推測(cè)可能是扁桃體肥大患者造成口咽部的阻塞，阻礙胃內(nèi)容物進(jìn)入到鼻咽部，具體原因仍需進(jìn)一步研究明確。本研究還在3例腺樣體組織中檢測(cè)到胃蛋白酶的表達(dá)，提示胃蛋白酶可通過(guò)主動(dòng)或被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入到腺樣體組織中，進(jìn)而激發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，從而造成淋巴細(xì)胞增生。腺樣體上皮為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，包括M細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，構(gòu)成腺樣體的上皮屏障。滯留在腺樣體隱窩內(nèi)的胃內(nèi)容物反流物可以損傷腺樣體上皮，從而形成持續(xù)炎癥。JOHNSTON等[14]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，喉黏膜上皮細(xì)胞的囊泡中有共存的胃蛋白酶與轉(zhuǎn)鐵蛋白，證實(shí)胃蛋白酶可以通過(guò)受體介導(dǎo)的胞飲而進(jìn)入喉黏膜上皮，闡明胃蛋白酶介導(dǎo)的喉黏膜損傷的機(jī)制，但是腺樣體黏膜上皮是否也存在類似的機(jī)制仍需后續(xù)的研究進(jìn)一步研究。也有研究在部分腺樣體肥大患兒的腺樣體組織中檢測(cè)到幽門螺桿菌[4]，所以胃蛋白酶是否與胃內(nèi)容物中其他成分有協(xié)同致病效應(yīng)尚不明確，仍需更進(jìn)一步研究。

本課題通過(guò)檢測(cè)鼻咽部分泌物中胃蛋白酶，發(fā)現(xiàn)部分腺樣體肥大患兒中存在胃內(nèi)容物反流到鼻咽部，胃蛋白酶濃度與腺樣體的肥大程度有一定的關(guān)系，筆者推測(cè)，胃內(nèi)容物的鼻咽部反流可能與腺樣體肥大有關(guān)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1]BRAMBILLA I,PUSATERI A,PAGELLA F,et al.Adenoids in children:advances in immunology,diagnosis,and surgery[J].Clin Anat,2014,27(3):346-352.

[2]ADHAMI T,GOLDBLUM J R,RICHTER J E,et al.The role of gastric and duodenal agents in laryngeal injury:an experimental canine model[J].Am J Gastroenterol,2004,99(11):2098-2106.

[3]LUO H N,YANG Q M,SHENG Y,et al.Role of pepsin and pepsinogen:linkinglaryngopharyngealrefluxwithotitismedia with effusion in children[J].Laryngoscope,2014,124(7):294-300.

[4]AYDIN E,AYDOGAN F,TASTAN E,et al.Does helicobacter pylori have a role in the etiology of adenoid hypertrophy[J].Indian J Otolaryngol Head Neck Surg,2014,66(Suppl 1):65-70.

[5]PHIPPS C D,WOOD W E,GIBSON W S,et al.Gastroesophageal refluxcontributingtochronicsinusdiseaseinchildren:a prospective analysis[J].Arch Otolaryngol Head Neck Surg,2000, 126(7):831-836.

[6]HARRIS P K,HUSSEY D J,WATSON D I,et al.Reflux changes in adenoidal hyperplasia:a controlled prospective study to investigate its aetiology[J].Clin Otolaryngol,2009,34(2):120-126.

[7]FORMANEK M,KOMINEK P,MATOUSEK P,et al.Comparison of Three methods used in the diagnosis of extraesophageal reflux in children with chronic otitis media with effusion[J].Gastroenterol Res Pract,2015,2015:547959.

[8]李湘平,陳順金,王路,等.唾液中胃蛋白酶檢測(cè)對(duì)咽喉反流的診斷價(jià)值[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2009,44(2):99-104.

[9]IANNELLA G,DI NARDO G,PLATEROTI R,et al.Investigation of pepsin in tears of children with laryngopharyngeal reflux disease[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2015,79(12):2312-2315.

[10]SAMUELS T L,JOHNSTON N.Pepsin as a marker of extraesophageal reflux[J].Ann Otol Rhinol Laryngol,2010,119(3): 203-208.

[11]KNIGHT J,LIVELY M O,JOHNSTON N,et al.Sensitive pepsin immunoassay for detection of laryngopharyngeal reflux[J]. Laryngoscope,2005,115(8):1473-1478.

[12]KELES B,OZTURK K,ARBAG H,et al.Frequency of pharyngeal reflux in children with adenoid hyperplasia[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2005,69(8):1103-1107.

[13]NORONHA A C,de BRUIN V M,NOBRE E,et al.Gastroesophageal reflux and obstructive sleep apnea in childhood[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol,2009,73(3):383-389.

[14]JOHNSTON N,WELLS C W,SAMUELS T L,et al.Pepsin in nonacidic refluxate can damage hypopharyngeal epithelial cells[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol,2009,118(9):677-685.

（童穎丹 編輯）

Detection of pepsin in nasopharyngeal secretions in children with adenoid hypertrophy*

Chun-lin Zhang1,Liu-jin Li1,Chun-lei Li1,Ji-zhen Lin1, Ze-yi Deng2,Ke Wang1,Zhao-hui Liu1
(1.Department of Otorhinolaryngology,Head and Neck Surgery,the Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi,Guizhou 563003,China;2.Department of Otorhinolaryngology,Head and Neck Surgery,Zhujiang Hospital of South Medical University,Guangzhou,Guangdong 510282,China)

Objective To detect pepsin in the nasopharyngeal secretions in children with adenoid hypertrophy(AH),and then to explore its association with AH.Methods The pediatric AH patients and the pediatric patients without AH or tonsil hypertrophy(TH)were collected as experiment group and control group,respectively.The pepsin level in the nasopharyngeal secretions and adenoid tissues was detected using an enzyme linked immunosorbent assay kit,and then compared between the experiment group and the control group. Moreover,the experimental group was divided into subgroups according to the combination with TH(subgroup B)or not(subgroup A)and the degree of adenoid hypertrophy,respectively.The pepsin level was compared between the subgroups.Results The expression level and the positive rate of pepsin in the nasopharyngeal secretions in the experiment group and the control group were(2.801±1.544)and(1.074±0.387)ng/ml,and 55.8%(24/43)and 0.0%(0/22),respectively,the differences were statistically significant(P=0.000).In the experiment group,the pepsin level and positive rate in the subgroup A and the subgroup B were(2.907±1.694)and(2.699±1.420)ng/ml,and 57.1%(12/21)and 54.6%(12/22)respectively,there were no significant differences(P=0.568 and 0.864).Compared with the subgroup of degree I adenoid hypertrophy(50%-75% posterior nose blockage),significantly higher concentration and positive rate of pepsin were found in the subgroup of degreeⅡadenoid hypertrophy(＞75%posterior nose blockage,P=0.1913 and 0.3211). Conclusions Pepsin in the nasopharyngeal secretions is found in a relatively high proportion of AH patients, and there is most likely an association between the nasopharyngeal reflux of gastric contents and AH.

adenoid hypertrophy;gastric contents;nasopharyngeal reflux;pepsin

R765

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.014

1005-8982（2016）23-0068-04