劉芳，趙杰，陳秀娟，托婭，梁琳，王薩仁

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

不同方案和移植前激素對移植解凍后生長胚胎妊娠結(jié)局的影響*

劉芳，趙杰，陳秀娟，托婭，梁琳，王薩仁

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059）

目的探討在冷凍胚胎復(fù)蘇移植周期中，解凍后過夜培養(yǎng)均生長的胚胎在兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案移植，影響妊娠結(jié)局的因素分析。方法選取在該中心行凍融胚胎移植的患者305例，359個周期的病歷資料為研究對象，并對其進(jìn)行回顧性分析。冷凍胚胎解凍后觀察胚胎生長情況，其中胚胎均有不同程度生長為生長組（191例），胚胎均未見生長的為未生長組（48例），胚胎既有生長的又含有未生長的為生長混合組（120例）。其中生長組按照不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案將其分類，分為自然周期組（90例）和激素替代治療周期組（101例）。比較各組的妊娠率、種植率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率的差別。結(jié)果生長組種植率為26.57%，高于生長混合組的16.78%（χ2=9.135，P=0.002）。自然周期組和激素替代治療周期組移植前雌二醇、孕酮比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.392和3.667，P=0.000和0.006）。在臨床助孕結(jié)局方面，自然周期組和激素替代治療周期組的臨床妊娠率、種植率、異位妊娠率等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而兩組流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.949和5.991，P=0.044和0.020）。結(jié)論胚胎解凍后經(jīng)過夜培養(yǎng)，有卵裂球細(xì)胞生長的胚胎能夠獲得較高的種植率和妊娠率，且移植均生長發(fā)育的胚胎在自然周期方案有較好的妊娠結(jié)局。

凍融胚胎移植；自然周期；激素替代周期；活產(chǎn)率

輔助生殖技術(shù)中冷凍胚胎移植（frozenthawed embryo transfer，F(xiàn)ET）已成為常規(guī)技術(shù)之一。隨著超促排卵技術(shù)、冷凍胚胎復(fù)蘇技術(shù)及移植技術(shù)水平的提高，F(xiàn)ET治療不孕逐漸成為輔助生殖醫(yī)學(xué)的主流方法[1]。凍融胚胎移植與“新鮮”周期移植相比，可以降低成本，而且用時短、操作簡單[2]。目前，提高凍融胚胎移植的妊娠結(jié)局是研究的焦點。如今應(yīng)用較廣泛的玻璃化冷凍技術(shù)，可以防止冰晶體的形成，有效減少細(xì)胞損傷，使胚胎的生殖潛力與新鮮胚胎相似。但在移植解凍后過夜培養(yǎng)均有生長發(fā)育的胚胎，某些因素仍影響胚胎著床，如子宮內(nèi)膜過薄或者過厚，移植前日激素的高、低等[3]。就上述問題，本研究采用回顧性分析法，選取2012年5月-2013年10月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受FET的305例患者的病歷資料為研究對象，比較解凍后過夜培養(yǎng)均發(fā)育生長的胚胎其自然周期和激素替代治療（hormone replacement therapy，HRT）周期兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對FET妊娠結(jié)局的影響。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2012年5月-2013年10月在本中心行凍融胚胎移植的患者305例，共359個周期，不育原因為輸卵管阻塞、排卵障礙、子宮內(nèi)膜異位癥、男方少弱精子或無精子癥等。①控制性超促排卵：新鮮周期根據(jù)患者情況選擇超長方案、長方案、拮抗劑方案、微刺激方案，經(jīng)陰道在超聲引導(dǎo)下穿刺抽吸取卵手術(shù)，取卵后行體外受精/胞漿內(nèi)單精子注射及胚胎培養(yǎng)。②冷凍胚胎選擇：胚胎培養(yǎng)至取卵后第3天，按選擇取卵后第2天細(xì)胞數(shù)≥2個，第3天細(xì)胞數(shù)≥4個；碎片≤50%的胚胎行玻璃化冷凍。

1.2 實驗方法及觀察指標(biāo)

采用玻璃化冷凍/快速解凍的方法。解凍后的胚胎檢查透明帶的完整性、卵漿的透亮程度，如＞50%卵裂球受損，則視為死亡[4]。選用完整和部分受損的存活胚胎，過夜培養(yǎng)觀察胚胎是否生長，將胚胎情況進(jìn)行記錄。根據(jù)其生長情況分為3組：所移植胚胎均有不同程度生長的為生長組（191例），所移植胚胎均未見生長的為未生長組（48例），所移植胚胎既有生長的胚胎又有未生長胚胎的為生長混合組（120例）。

1.3 分組及相應(yīng)子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案

按照不同的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案，為排除因不同發(fā)育階段的胚胎冷凍和冷凍方法對妊娠結(jié)局的影響[5]，選取玻璃化冷凍胚胎解凍后過夜培養(yǎng)后均有生長發(fā)育的共191個周期進(jìn)一步分析。將納入研究的周期根據(jù)內(nèi)膜分為自然周期組（90例），HRT周期組（101例）。自然周期組受試者方案為：對于月經(jīng)規(guī)律者，于月經(jīng)周期第10～12天開始超聲監(jiān)測排卵，同時配合使用排卵試紙，當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑≥16～18 mm時，尿LH（+），肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺素（珠海麗珠制藥公司）5 000～10 000 IU，以誘導(dǎo)排卵。排卵后當(dāng)天開始使用注射用黃體酮20 mg、1次/d，3 d后胚胎移植。HRT周期組采雌、孕激素方案：于月經(jīng)第2天開始服用戊酸雌二醇片2 mg/d，2次/d，7 d后超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜厚度，根據(jù)內(nèi)膜厚度調(diào)整雌激素劑量，最大劑量為6 mg/次，2次/d，當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時，加用孕激素類藥物黃體酮40～60 mg，于給予黃體酮的第5天胚胎移植。移植前1 d所有患者測定血清雌二醇（Estradiol，E2）和孕酮（Progesterone，P）水平，并根據(jù)血清孕酮水平調(diào)整黃體酮的劑量[6]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，3組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以率表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胚胎生長情況對妊娠結(jié)局的影響

共解凍移植356個周期，無取消周期；解凍胚胎843個，存活798個，存活率為94.66%；移植胚胎778個，種植175個，種植率為22.49%；妊娠145個周期，平均妊娠率為40.38%。過夜培養(yǎng)后，生長組191個周期，種植率為26.57%，妊娠率為46.07%，未生長組48個周期，妊娠率為33.33%，種植率為17.65%；生長混合組120個周期，妊娠率為34.16%，種植率為16.78%。3組年齡、獲卵數(shù)、移植數(shù)比較，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）。3組妊娠率、種植率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。生長組與生長混合組種植率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=9.135，P=0.002），生長組高于生長混合組（見表2）。

表1 按胚胎生長情況進(jìn)行分組的基本資料

表2 胚胎生長情況對妊娠結(jié)局的影響例（%）

2.2 不同子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案移植解凍后生長胚胎的比較

過夜培養(yǎng)胚胎均生長的共191個周期，其中自然周期組90個，HRT周期組101個。兩組年齡、不孕年限、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)比較，經(jīng)獨立樣本t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；兩組移植前E2、P水平比較，經(jīng)獨立樣本t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.392和3.667，P=0.000和0.006），HRT周期組移植前E2、P水平高于自然周期組；兩組D2內(nèi)膜厚度比較，經(jīng)獨立樣本t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.228，P=0.000），自然周期組D2內(nèi)膜厚度高于HRT周期組。兩組流產(chǎn)率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=3.949，P=0.044），HRT周期組流產(chǎn)率高于自然周期組；兩組活產(chǎn)率比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2= 5.991，P=0.020），自然周期組活產(chǎn)率高于HRT周期組（見表3）。

表3 不同子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案移植解凍后生長胚胎的比較

3 討論

凍融胚胎移植臨床妊娠主要取決于解凍后胚胎的發(fā)育潛能、子宮內(nèi)膜的容受性及相互作用[7]。子宮內(nèi)膜著床窗口的形成除受卵巢激素控制外，胚胎也起重要作用。子宮內(nèi)膜在著床開始，分泌細(xì)胞因子，同時胚胎也分泌某種或多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜的成熟，促進(jìn)胚胎與子宮內(nèi)膜的附著[8]。提前解凍胚胎，過夜培養(yǎng)后觀察復(fù)蘇后胚胎是否繼續(xù)生長，對評價胚胎種植潛能有重要意義。van DER ELST等[9]認(rèn)為，復(fù)蘇后卵裂球繼續(xù)發(fā)育可能對于著床時胚胎與子宮內(nèi)膜的同步性更有利。此外，LAVERGE等[10]對復(fù)蘇后培養(yǎng)未生長的胚胎進(jìn)行熒光原位雜交，發(fā)現(xiàn)這些胚胎表現(xiàn)染色體異常，包括單倍體、三倍體、四倍體和嵌合體的發(fā)生，僅20%左右的為正常的二倍體，因此建議復(fù)蘇后培養(yǎng)，觀察胚胎生長情況，并建議不移植無進(jìn)一步生長的胚胎。本研究發(fā)現(xiàn)，胚胎解凍后過夜培養(yǎng)，所移植胚胎均有生長的生長組種植率高于未生長組及生長混合組，因此在排除胚胎質(zhì)量差異的情況下，移植生長組胚胎分析子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育的同步性，即凍融胚胎的移植時機(jī)成為最后的關(guān)鍵。子宮內(nèi)膜容受性是子宮內(nèi)膜能允許胚胎著床的能力，是特定時期的一種狀態(tài)，即著床窗期。在這特定的時期，子宮內(nèi)膜在雌、孕激素作用下發(fā)生一系列與胚胎發(fā)育同步、有利于胚胎著床的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，對胚胎具有容受性，能使胚胎順利著床[11-12]。有研究認(rèn)為，子宮內(nèi)膜是雌激素、孕激素作用最直接的靶器官，合適的E2、P是刺激著床前子宮內(nèi)膜呈容受狀態(tài)的重要因素[13]。本研究中，自然周期與HRT周期移植前雌二醇和孕酮值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，HRT周期高于自然周期，不同的內(nèi)膜準(zhǔn)備中足夠的雌激素、孕酮攝入是獲得正常分泌期內(nèi)膜所必需的，也是內(nèi)膜準(zhǔn)備必不可少的，但兩種內(nèi)膜準(zhǔn)備所需激素有不同，所以移植前應(yīng)檢測各自雌、孕激素，及時調(diào)整用藥。

選擇適當(dāng)子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案是較重要，盡管目前報道關(guān)于最佳的內(nèi)膜準(zhǔn)備方案仍有爭議[14]，關(guān)于凍融胚胎移植內(nèi)膜準(zhǔn)備妊娠結(jié)局的研究缺乏共識。很多研究認(rèn)為，NC周期與HRT周期臨床妊娠率相當(dāng)[15]。也有些作者建議，HRT周期較優(yōu)勢，可以調(diào)整E2、P，控制性強(qiáng)；另一些學(xué)者研究認(rèn)為，使用激素替代周期持續(xù)的妊娠率需要進(jìn)一步更大的前瞻性研究證實[13]，但子宮內(nèi)膜的準(zhǔn)備應(yīng)與胚胎發(fā)育同步。在本研究中，筆者比較兩種子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備的妊娠結(jié)局，雖然替代周期的妊娠率高于自然周期，但流產(chǎn)率較高，而最終活產(chǎn)率低于自然周期（P＜0.05），提示自然周期方案的冷凍胚胎移植最終妊娠結(jié)局較好，有較高的活產(chǎn)率，這也是助孕最終所需要達(dá)到的目標(biāo)。

總之，凍融胚胎移植確實增加患者一次取卵的妊娠率，使患者累計妊娠率提高，根據(jù)患者情況可采用個體化方案，嚴(yán)格控制冷凍、解凍操作過程的每一細(xì)節(jié)，以獲得高質(zhì)量的胚胎。同時，移植前日恰當(dāng)?shù)拇圃屑に厮绞窃u價是否獲得良好治療結(jié)局的關(guān)鍵。對凍融胚胎移植結(jié)局進(jìn)行預(yù)測的研究，能為生殖醫(yī)學(xué)帶來更大的擴(kuò)展空間。

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（童穎丹 編輯）

Impact of different programs and hormones on pregnancy outcome in advanced frozen-thawed embryos transfer cycles*

Fang Liu,Jie Zhao,Xiu-juan Chen,Ya Tuo,Lin Liang,Sa-ren Wang
(Reproductive Center,the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot,Inner Mongolia 010059,China)

Objective To analyze the impact of resumption growth overnight culture and two kinds of endometrial preparation for growth of embryos on the outcome of frozen-thawed embryos transfer(FET). Methods A total of 305 cases transfered with frozen-thawed embryos in the center were enrolled into the study.The medical records of 359 cycles were studied and analyzed retrospectively.The growth of the embryos were observed after thawing.The cycles were divided into three groups.In group A1(n=191),the embryos continued to grow after overnight culture.In group A2(n=48),the embryos did not continue to cleave after overnight culture.In group A3(n=120),there were embryos with and without further cleavage. According to different endometrial preparation programs the group A1 was grouped into the natural cycle group(n=90)and hormone replacement therapy(HRT)group(n=101).The planting rate,pregnancy rate, abortion rate and live-birth rate were compared between the groups.Results The embryo planting rate of the group A1(26.57%)was significantly higher than that(16.78%)of the group A3(χ2=9.135,P=0.002).The estradiol(E2)and progesterone(P)levels before transplantation were statistically different between the natural cycle and HRT groups(t=12.392 and 3.667,P=0.000 and 0.006).The pregnancy rate,planting rate orectopic pregnancy rate had no statistical significant difference between the two groups;while the rates of abortion and live-birth had significant difference between the natural cycle group and the HRT group(χ2= 3.949 and 5.991,P=0.044 and 0.020).Conclusions After overnight culture of thawed embryos,high pregnancy rate and planting rate can be obtained in the embryos with blastomere growth.Post-planting growing embryos have good pregnancy outcomes in natural cycle.

frozen embryo transfer;natural cycle;hormone replacement cycle;live-birth rate

R714.8

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.23.019

1005-8982（2016）23-0095-04

2016-02-17

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)科技百萬工程（No：YKD2015KJBW023）；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)研究項目（No：NJZY16118）

趙杰，E-mail：zhaojie981224@163.com