邱玉明，李劍雄，李慧

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳518100)

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153例漢族哮喘患者GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性及吸入糖皮質(zhì)激素治療反應(yīng)

邱玉明，李劍雄，李慧

(深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院，廣東深圳518100)

目的 觀察中國漢族哮喘患者糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1(GLCCI1)基因rs37973位點(diǎn)的多態(tài)性，并比較不同基因型患者吸入糖皮質(zhì)激素(ICS)的治療反應(yīng)。方法 選擇中國漢族哮喘患者153例，給予吸入布地奈德200μg、2次/d，治療12周。治療前采集靜脈血，采用PCR法觀察GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性。對(duì)所有患者進(jìn)行哮喘控制測(cè)試評(píng)分(ACT)。分別于治療前及治療后12周進(jìn)行肺功能檢測(cè)，記錄第一秒用力呼氣容積(FEV1)、第一秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1/Pred%)、第一秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC%)，計(jì)算FEV1改善率與ΔFEV1/預(yù)計(jì)值%。結(jié)果 納入患者GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)存在多態(tài)性現(xiàn)象，包括AA基因型36例(23.5%)、AG基因型91例(59.5%)、GG基因型26例(17.0%)。三種基因型患者年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療前ACT評(píng)分、FEV1、FEV1/Pred%、FEV1/FVC%差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)AA、AG、GG型患者ICS治療后FEV1改善率、ΔFEV1/預(yù)計(jì)值%逐漸降低，三組兩兩相比，P均<0.05。結(jié)論 漢族哮喘患者存在GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性現(xiàn)象，其中AA基因型哮喘患者ICS治療后肺功能改善情況優(yōu)于AG、GG基因型哮喘患者。GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性可能與哮喘患者ICS治療反應(yīng)存在一定相關(guān)性。

支氣管哮喘；糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1基因；基因多態(tài)性；吸入糖皮質(zhì)激素

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，以氣道高反應(yīng)性(AHR)為特征。目前支氣管哮喘的發(fā)病原因及機(jī)制尚未完全明確，但哮喘發(fā)病具有家族聚集性特點(diǎn)和明顯的遺傳傾向。全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)為哮喘相關(guān)基因的研究提供了新手段。

Tantisira等[1]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)吸入糖皮質(zhì)激素(ICS)治療反應(yīng)下降的哮喘患者可伴糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1基因(GLCCI1基因)rs37973位點(diǎn)變異。本研究觀察了我國漢族人群GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性情況，并比較不同基因型患者ICS的治療反應(yīng)，以期通過GLCCI1基因型為哮喘患者的個(gè)體化治療方案選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年7月～2015年6月就診的漢族哮喘患者153例納入研究，男91例、女62例，年齡18～70歲。所有患者均根據(jù)《支氣管哮喘防治指南》確診，均為初診病例或既往診斷哮喘但未規(guī)范治療，近4周內(nèi)未全身使用激素或吸入糖皮質(zhì)激素，近2周未使用白三烯調(diào)節(jié)劑類藥物，入選前4周無呼吸道感染。給予吸入布地奈德200 μg、2次/d，共治療12周，期間可根據(jù)病情按需吸入快速緩解藥沙丁胺醇?xì)忪F劑?；颊呔炇鹬橥鈺?。

1.2 GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性觀察 治療前采集患者抗凝靜脈血2 mL、離心、吸取白細(xì)胞層，提取基因組DNA。GLCCI1基因上游引物序列為5′-TGTACGTGAAAGTGACCCCTG-3′，下游引物序列為5′-AGCTGAGTTTTCGTGACCAGT -3′，產(chǎn)物擴(kuò)增長度為576 bp。PCR反應(yīng)總體系為50 μL，含提取基因組DNA 1 μL、10×Buffer緩沖液25 μL、Tap DNA聚合酶1.25 U、2.5 mmol/L的脫氧核糖核苷酸(dNTP)混合物10 μL、上游引物和下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸40 s，共38個(gè)循環(huán)，72 ℃終末延伸10 min。使用3730測(cè)序儀進(jìn)行雙向PCR產(chǎn)物測(cè)序反應(yīng)，并將測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件與數(shù)據(jù)庫中已登錄的序列進(jìn)行同源性分析。

1.3 哮喘控制測(cè)試評(píng)分(ACT)方法 詢問患者過去4周內(nèi)哮喘控制情況(包括哮喘發(fā)作次數(shù)、夜間哮喘、哮喘對(duì)日常生活的影響等多個(gè)方面)并進(jìn)行計(jì)分，總分25分，分?jǐn)?shù)越高表明哮喘控制越好，癥狀越輕。ACT 25分為完全控制，ACT 20～24分為良好控制，ACT<20分為未控制。

1.4 肺功能檢測(cè) 治療前及治療后12周進(jìn)行肺功能檢測(cè)，記錄第一秒用力呼氣容積(FEV1)、第一秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值的百分比(FEV1/Pred%)、第一秒用力呼氣容積占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC%)。根據(jù)公式計(jì)算FEV1改善率與ΔFEV1/預(yù)計(jì)值%：FEV1改善率=(ΔFEV1治療后數(shù)值-治療前數(shù)值/FEV1治療前數(shù)值)×100%；ΔFEV1/預(yù)計(jì)值%=治療后數(shù)值-治療前數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。組間等位基因型或等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性 納入患者GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)存在多態(tài)性現(xiàn)象，包括AA基因型36例(23.5%)，男21例、女15例，年齡(43.5±2.9)歲；AG基因型91例(59.5%)，男55例、女36例，年齡(43.3±4.0)歲；GG基因型26例(17.0%)，男15例、女11例，年齡(46.7±5.0)歲。三種基因型患者年齡、性別、BMI相比，P均>0.05；治療前ACT評(píng)分、FEV1、FEV1/Pred%、FEV1/FVC%，P均>0.05。詳見表1。

表1 不同基因型哮喘患者治療前BMI、ACT評(píng)分、FEV1、FEV1/Pred%、FEV1/FVC%比較

2.2 不同基因型哮喘患者ICS治療反應(yīng)比較 GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)AA、AG、GG型患者ICS治療后FEV1改善率、ΔFEV1/預(yù)計(jì)值%逐漸降低，三組兩兩相比，P均<0.05。詳見表2。

表2 不同基因型哮喘患者肺功能改變情況比較

3 討論

ICS是最常用的、有效的控制哮喘發(fā)作的藥物[2]。哮喘患者對(duì)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)有個(gè)體差異性。部分患者盡管規(guī)范使用ICS甚至使用高劑量ICS，病情仍遷延反復(fù)，肺功能逐漸下降，研究[3～6]表明這些個(gè)體差異性與遺傳因素相關(guān)。GLCCI1基因位于7p21.3，包含8個(gè)外顯子。GLCCI1的功能目前還不完全清楚。Tantisira等[1]通過全基因組關(guān)聯(lián)分析和藥物基因組學(xué)研究得出：在白種人中，GLCCI1基因的啟動(dòng)子rs37972位點(diǎn)與rs37973位點(diǎn)存在完全連鎖不平衡。rs37973位點(diǎn)存在基因多態(tài)性，表現(xiàn)為AA、AG、GG三種基因型。表型為AA型的哮喘患者在經(jīng)過4～8周ICS治療后FEV1/預(yù)計(jì)值%的改善值比GG型明顯升高。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)rs37973位點(diǎn)突變型GG與熒光素酶活性顯著下降相關(guān)，即與GLCCI1的表達(dá)減少相關(guān)。因此，可能正是GLCCI1表達(dá)的減少，減弱了哮喘患者對(duì)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，我國漢族哮喘患者也存在GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性，我們分析文獻(xiàn)[7]數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，我國漢族哮喘患者與非西班牙裔白人哮喘患者GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)的3種基因型頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs37973位點(diǎn)多態(tài)性存在于不同地域和不同種群的哮喘患者中。我們發(fā)現(xiàn)，哮喘組3種基因型患者的治療前ACT評(píng)分、FEV1、FEV1/Pred%、FEV1/FVC%差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs37973位點(diǎn)多態(tài)性可能與哮喘發(fā)病無相關(guān)性。

有學(xué)者[8]通過對(duì)哮喘進(jìn)行患者研究得出，GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘患者對(duì)ICS的治療反應(yīng)相關(guān)。2014年Izuhara等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GLCCI1基因rs37973多態(tài)性與長期接受ICS治療的哮喘患者肺功能下降有關(guān)，認(rèn)為GLCCI1基因rs37973多態(tài)性有助于預(yù)測(cè)哮喘患者對(duì)ICS治療的反應(yīng)。而有學(xué)者[10]通過對(duì)來自7個(gè)臨床研究的1 916例哮喘患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在白種人群中，GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性與ICS的治療反應(yīng)無相關(guān)性。

Tantisira等[1]研究顯示，GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)表型為野生純合型(AA)患者在ICS治療后FEV1/預(yù)計(jì)值%的變化為9.4%±0.26%，而突變純合型(GG)變化值僅是野生純合型的三分之一(3.2%±1.6%)。本研究結(jié)果顯示rs37973位點(diǎn)表型為AA型患者ICS治療后ΔFEV1/預(yù)計(jì)值%為9.10%±1.10%，GG型患者為4.10%±0.14%。我們還對(duì)不同rs37973位點(diǎn)基因型的哮喘患者的ΔFEV1、FEV1改善率、ΔFEV1/預(yù)計(jì)值%進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA、AG、GG型患者ICS治療后FEV1改善率、ΔFEV1/預(yù)計(jì)值%逐漸降低，三組兩兩相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明AA基因型哮喘患者ICS治療后肺功能改善情況優(yōu)于AG及GG基因型患者，提示在中國漢族人群，GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性也有助于預(yù)測(cè)哮喘患者對(duì)ICS治療的反應(yīng)。該位點(diǎn)變異可能通過GLCCI1的表達(dá)減少，而起到減弱ICS改善肺功能的作用。GLCCI1可能是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞凋亡的早期信號(hào)[11]，該位點(diǎn)變異可能通過抑制炎癥細(xì)胞凋亡，減弱了ICS治療效果。值得注意的是，本研究樣本量較小，可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)效力不強(qiáng)，仍需擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步研究，證實(shí)GLCCI1基因rs37973位點(diǎn)多態(tài)性與ICS治療反應(yīng)的關(guān)系。

[1] Tantisira KG, Lasky-Su J, Harada M, et al. Genomewide association between GLCCI1 and response to glucocorticoid therapy in asthma[J]. N Engl J Med, 2011,365(13):1173-1183.

[2] Expert Panel Report 3. Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma-Summary Report 2007[J]. J Allergy Clin Immunol, 2007,120(5 Suppl):S94-138.

[3] Tantisira KG, Lake S, Silverman ES, et al. Corticosteroid pharmacogenetics: association of sequence variants in CRHR1 with improved lung function in asthmatics treated with inhaled corticosteroids[J]. Hum Mol Genet, 2004,13(13):1353-1359.

[4] Hawkins GA, Lazarus R, Smith RS, et al. The glucocorticoid receptor hetero complex gene STIP1 is associated with improved lung function in asthmatic subjects treated with inhaled corticosteroids[J]. J Allergy Clin Immunol, 2009,123(6):1376-1383.

[5] Pascual RM, Bleecker ER. Pharmacogenetics of asthma[J]. Curr Opin Pharmacol, 2010,10(3):226-235.

[6] Li X, Howard T, Moore W, et al. Importance of hedgehog interacting protein and other lung function genes in asthma[J]. J Allergy Clin Immunol, 2011,127(6):1457-1465.

[7] Hosking L,Bleecker E, Ghosh S, et al. GLCCI1 rs37973 does not influence treatment response to inhaled corticosteroids in white subjects with asthma[J]. J Allergy Clin Immunol, 2014,133(2):587-589.

[8] McGeachie MJ, Wu AC, Chang HH, et al. Predicting Inhaled Corticosteroid Response in Asthma with Two Associated SNPs[J]. Pharmacogenomics J, 2013,13(4):306-311.

[9] Izuhara Y, Matsumoto H, Kanemistu Y, et al. GLCCI1 variant accelerates pulmonary function decline in patients with asthma receiving inhaled corticosteroids[J]. Allergy, 2014,69(5):668-673.

[10] Szalai R,Matyas P,Varszegi D, et al. Admixture of beneficial and unfavourable variants of GLCCI1 and FCER2 in Roma samples can implicate different clinical response to corticosteroids[J]. Mol Biol Rep, 2014,41(11):7665-7669.

[11] Chapman MS, Askew DJ, Kuscuoglu U, et al.Transcriptional control of steroid-regulated apoptosis in murine thymoma cells[J]. Mol Endocrinol, 1996,10(8):967-978.

深圳市寶安區(qū)科技局課題(2014018)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.032

R562.2

B

1002-266X(2016)39-0094-03

2016-07-04)