方朝東，邱文娜，李 磊，饒 玲，熊吉濱，李健峰

（江蘇泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，江蘇 泰州 225300）

疫苗生產(chǎn)中純化水與注射用水的質(zhì)量控制研究

方朝東，邱文娜，李 磊，饒 玲，熊吉濱，李健峰

（江蘇泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)疫苗工程中心，江蘇 泰州 225300）

目的 研究純化水和注射用水作為生物制品生產(chǎn)中主要原輔料的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法 分別在純化水和注射用水不同水點(diǎn)取樣，按2015年版《中國(guó)藥典（二部）》最新規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)3周對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)。結(jié)果純化水和注射用水的各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合規(guī)定。結(jié)論 該水系統(tǒng)制備出來(lái)的純化水和注射用水質(zhì)量?jī)?yōu)良，可用于疫苗生物制品生產(chǎn)。

疫苗生產(chǎn)；純化水；注射用水；質(zhì)量控制

純化水和注射用水是疫苗等生物制品乃至藥物制劑行業(yè)中用途最廣、用量巨大的一種原輔料，其質(zhì)量好壞將直接影響終產(chǎn)品的質(zhì)量[1-2]。2015年版《中國(guó)藥典（二部）》對(duì)純化水、注射用水、滅菌注射用水的檢測(cè)方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分別都有明確規(guī)定[3]，并修訂了純化水和注射用水微生物限度檢查項(xiàng)目。將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基修訂為低營(yíng)養(yǎng)的R2A瓊脂培養(yǎng)基，提高了微生物的檢出率，與《歐洲藥典》（EP）一致[4-5]。與EP不同的是，《中國(guó)藥典》暫未對(duì)純化水中細(xì)菌內(nèi)毒素作明確要求。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者主要研究純化水或注射用水中微生物限度或制水工藝方面[6-9]，尚缺乏對(duì)純化水和注射用水進(jìn)行全面質(zhì)量研究的報(bào)道。為保證疫苗生產(chǎn)工藝用水質(zhì)量，筆者依據(jù)《中國(guó)藥典》要求對(duì)整個(gè)純化水和注射用水系統(tǒng)進(jìn)行了全面質(zhì)量監(jiān)測(cè)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

二級(jí)反滲透純化水制備系統(tǒng)（山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司）；純化水分配系統(tǒng)、多效蒸餾水機(jī)和注射用水分配系統(tǒng)（吉林省華通制藥設(shè)備有限公司）；1300 A2型生物安全柜（Thermo Fisher）；S230-B型電導(dǎo)率儀（Mettler Toledo）；5000Toci型總有機(jī)碳（TOC）分析儀（MettlerToledo）；TAL-40D型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DK-S26型恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；LS-O610型烘箱（Fisher Labserv）；pH700型酸度計(jì)（Eutech）；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋（Tomy）、三聯(lián)過(guò)濾器（Sartorius，Combisart）。

1．2 試藥

鰲試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)為1412242）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為160006-201401）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為 150601-201478）；R2A瓊脂培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20151112）；pH＝7．0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)為20150208）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 純化水與注射用水的制備與分配

原水先后經(jīng)石英砂和活性炭過(guò)濾器后，進(jìn)入一級(jí)反滲透和二級(jí)反滲透膜，制備純化水（在線電導(dǎo)率儀檢測(cè)電導(dǎo)小于2 μs／cm），放行進(jìn)入純化水罐，通過(guò)純化水分配系統(tǒng)送至各使用點(diǎn)。注射水機(jī)采用五效蒸餾器，以純化水為水源，制備的注射用水進(jìn)入注射用水水罐，通過(guò)注射用水分配系統(tǒng)送至各使用點(diǎn)。純化水和注射用水分配系統(tǒng)總送與總回分別設(shè)有取樣閥。水系統(tǒng)可采取自動(dòng)控制和手動(dòng)控制兩種模式，一般采取自動(dòng)控制模式，且水系統(tǒng)持續(xù)運(yùn)行。

2．2 取樣計(jì)劃

純化水和注射用水的總進(jìn)水口、總送水口與總回口均為每周必須監(jiān)測(cè)點(diǎn)，每周取樣1批次，純化水和注射用水每批次均選擇2個(gè)使用點(diǎn)取樣，連續(xù)3周即覆蓋所有使用水點(diǎn)。

2．3 取樣方法

在車間正常生產(chǎn)和水機(jī)正常運(yùn)行情況下，檢驗(yàn)人員按取樣計(jì)劃負(fù)責(zé)取樣。取樣前用75%乙醇棉球擦拭取樣口內(nèi)外壁，打開(kāi)取樣閥排水至少3 min，滅菌玻璃瓶取水前需用水樣進(jìn)行潤(rùn)洗至少3次。每個(gè)取水點(diǎn)取3瓶平行樣品，每份取樣量不少于 300 mL，取樣結(jié)束立即蓋好瓶蓋。用于TOC檢測(cè)的水樣在取樣時(shí)應(yīng)盡量取滿，以減少水面上部空氣對(duì)水樣的影響。另外，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用取樣試管應(yīng)提前采取高溫措施以去除熱原。

2．4 檢測(cè)項(xiàng)目及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

純化水和注射用水的檢測(cè)項(xiàng)目及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1，參照2015年版《中國(guó)藥典（二部）》規(guī)定進(jìn)行檢測(cè)。理化檢查項(xiàng)目當(dāng)天完成，純化水細(xì)菌內(nèi)毒素檢查與注射用水同法操作，采用凝膠試驗(yàn)法。進(jìn)行電導(dǎo)率檢測(cè)前，先將水樣溫度加溫至25℃，再用離線式電導(dǎo)率儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。微生物限度檢查（薄膜過(guò)濾法）應(yīng)在取樣結(jié)束2 h內(nèi)進(jìn)行，取純化水水樣10 mL，用pH＝7．0的無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL，配制成供試液，取10 mL供試液加入已加100 mL緩沖液的濾杯通過(guò)薄膜過(guò)濾，接著用緩沖液沖洗濾杯及膜3次（每次100 mL），取出濾膜，菌面朝上，貼于R2A瓊脂培養(yǎng)基表面（Φ＝90 mm），同時(shí)取緩沖液100 mL薄膜過(guò)濾，作為陰性對(duì)照，每個(gè)樣品平行做2個(gè)皿，置32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至少120 h。注射用水微生物限度檢查則取注射用水水樣100 mL直接進(jìn)行薄膜過(guò)濾，其他操作步驟同純化水檢測(cè)。

表1 2015年版《中國(guó)藥典（二部）》中純化水和注射用水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2．5 結(jié)果

2．5．1 純化水和注射用水的檢測(cè)結(jié)果

連續(xù)3批次純化水和注射用水的性狀、酸堿度（pH）、硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨、不揮發(fā)物和重金屬檢查項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均合格，其細(xì)菌內(nèi)毒素、電導(dǎo)率、總有機(jī)碳和微生物限度檢查檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，純化水和注射用水系統(tǒng)制備和分配循環(huán)的純化水和注射用水各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)均符合藥典規(guī)定。

2．5．2 純化水不同溫度、不同貯存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果

純化水按取樣標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程取樣密封后，分別在4℃和30℃條件下（綜合季節(jié)氣候變化考慮，冬天最低水溫4℃，夏天最高水溫30℃）貯存不同時(shí)間，對(duì)其電導(dǎo)率、TOC和微生物主要指標(biāo)進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)純化水中細(xì)菌內(nèi)毒素進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，純化水在4℃條件下貯存72 h電導(dǎo)率、TOC和微生物限度各項(xiàng)指標(biāo)均合格，細(xì)菌內(nèi)毒素均小于0．25 EU／mL。隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，其電導(dǎo)率波動(dòng)變化不大，TOC僅呈緩慢上升趨勢(shì)。與4℃條件下比較，在30℃條件下貯存，不同點(diǎn)主要體現(xiàn)在微生物方面，純化水貯存48 h仍合格，但貯存72 h微生物總數(shù)超標(biāo)。

2．5．3 注射用水不同溫度、不同貯存時(shí)間檢測(cè)結(jié)果

注射用水取樣結(jié)束后立即密封，分別在4℃、30℃和70℃不同溫度下貯存72 h，注射用水中細(xì)菌內(nèi)毒素、電導(dǎo)率、TOC和微生物各項(xiàng)指標(biāo)仍合格，隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，電導(dǎo)率和TOC在不同溫度下并無(wú)明顯變化趨勢(shì)，均未檢出微生物。見(jiàn)表4。

3 討論

純化水和注射用水是疫苗生產(chǎn)中用量巨大的輔料，《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）》建議：“純化水采取循環(huán)，注射用水采取70℃以上保溫循環(huán)[10]。其在制備、貯存和使用過(guò)程中微生物容易繁殖，微生物或其代謝產(chǎn)物會(huì)嚴(yán)重影響藥品質(zhì)量”[11]，因此加強(qiáng)對(duì)工藝用水的質(zhì)量控制顯得尤為重要。藥典自2005年版增加微生物限度檢查項(xiàng)目，2010年版新增電導(dǎo)率、TOC項(xiàng)目，以及 2015年版的修訂，且 2016年版《美國(guó)藥典》（USP39）將接受應(yīng)用微生物在線檢測(cè)儀對(duì)制藥用水中微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的方法，均體現(xiàn)國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥衛(wèi)生管理部門一直致力于逐步提高純化水和注射用水的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，改進(jìn)檢測(cè)方法以利于快速并準(zhǔn)確地對(duì)水質(zhì)情況進(jìn)行監(jiān)控。

表2 純化水和注射用水檢測(cè)結(jié)果

表3 純化水不同溫度下貯存檢測(cè)結(jié)果

表4 注射用水不同溫度下貯存檢測(cè)結(jié)果

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化水中微生物極少，其微生物限度值已十分接近注射用水的微生物限度值，電導(dǎo)率平均值不到1．20 μs／cm，遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定的5．1 μs／cm；TOC平均值不超過(guò)10 ppb，也是遠(yuǎn)低于藥典規(guī)定的500 ppb；純化水各指標(biāo)（包括細(xì)菌內(nèi)毒素）均達(dá)到我國(guó)藥典關(guān)于注射用水的要求，實(shí)際使用中能否當(dāng)注射用水使用有待進(jìn)一步驗(yàn)證研究。注射用水的電導(dǎo)率和TOC同樣遠(yuǎn)低于藥典的規(guī)定；另外，與純化水TOC比較，注射用水TOC略高，可能與注射用水的蒸餾工藝有關(guān)，尚無(wú)明確的解釋。結(jié)果提示，經(jīng)二級(jí)反滲透制得的純化水及由其蒸餾而制得的注射用水非常優(yōu)質(zhì)，可放心應(yīng)用于疫苗等生物制品的生產(chǎn)。4℃低溫貯存純化水明顯能抑制水中細(xì)菌的繁殖，在常溫下保存時(shí)間最好不超過(guò)48 h。TOC隨貯存時(shí)間的增加呈緩慢上升趨勢(shì)，與孫晶晶等[12]結(jié)果一致，在一定程度上反映了純化水中微生物的情況。30℃條件下，72 h純化水中微生物超標(biāo)，但細(xì)菌內(nèi)毒素和TOC均未超標(biāo)，可能與水中微生物暫未分解有關(guān)，純化水中微生物超標(biāo)可大大增加注射用水中細(xì)菌內(nèi)毒素不合格的幾率。與純化水不同，注射用水在不同溫度下貯存72 h仍合格，可能因注射用水中無(wú)微生物，檢測(cè)時(shí)可考慮增加樣品取樣量對(duì)其進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，在生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)通過(guò)測(cè)定純化水和注射用水的電導(dǎo)率、TOC、細(xì)菌內(nèi)毒素和微生物總數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)，定期對(duì)設(shè)備進(jìn)行檢查、維護(hù)和更新[13]，以便系統(tǒng)掌握水質(zhì)基本情況。綜合驗(yàn)證數(shù)據(jù)和長(zhǎng)年積累的數(shù)據(jù)，建立切合實(shí)際的電導(dǎo)率、TOC、微生物等指標(biāo)的警戒限和糾偏限，以全面控制其質(zhì)量及水系統(tǒng)的持續(xù)有效運(yùn)行，最大限度降低因水質(zhì)量問(wèn)題而導(dǎo)致產(chǎn)品不合格的風(fēng)險(xiǎn)。

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Quality Control of Purified Water and Water for Injection in Vaccine Production

Fang Chaodong,Qiu Wenna,Li Lei,Rao Ling,Xiong Jibin,Li Jianfeng
(Vaccine Engineering Center of Taizhou Medical Hi-Tech Development Zone,Taizhou,Jiangsu,China 225300)

Objective To analyze the quality control standard of purified water and water for injection used in biological products as raw materials．M ethods The samples were collected from different sampling points respectively and examined referring to the latest regulations of ChP 2015 edition,and the quality of water was detected for 3 weeks．Results The quality index of the pure water and water for injection all accorded with the standard．Conclusion Excellent quality of water can be prepared by the water system and fits for the biological products．

vaccine production;purified water;water for injection;quality control

TQ460．6＋3

A

1006－4931(2016)11－0069－04

方朝東（1985-），男，江蘇泰州人，碩士研究生，主管藥師，主要從事生物制品研發(fā)及檢測(cè)工作，（電話）0523-86200368。

2015－10－14)