劉保生， 李彤彤， 張秋菊， 崔萌萌， 段韶彤

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 保定 071002)

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不同光譜法用于藥物與蛋白相互作用的比較研究

劉保生*， 李彤彤， 張秋菊， 崔萌萌， 段韶彤

(河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 河北省分析科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 保定 071002)

在模擬人體生理環(huán)境下，利用熒光猝滅法(FQS)、同步熒光法(SYS)、共振光散射法(RLS)及紫外吸收光譜法(UV)分別研究了298 K下牛血清白蛋白與硫酸粘桿菌素、硫酸頭孢匹羅、頭孢匹胺鈉3種藥物間的相互作用機(jī)理。結(jié)果表明：對于相同的體系，利用4種方法計(jì)算得到的結(jié)合常數(shù)在同一數(shù)量級，猝滅方式均為生成新物質(zhì)的靜態(tài)猝滅，藥物與蛋白作用時(shí)均以1∶1的比例結(jié)合，Hill系數(shù)近似。但對4種方法所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的綜合比較表明，F(xiàn)QS、SYS更適合用于研究蛋白與藥物的反應(yīng)機(jī)理。

牛血清白蛋白； 熒光猝滅法； 同步熒光法； 共振光散射法； 紫外吸收光譜法

1 引 言

在蛋白質(zhì)化學(xué)層面，藥物與血清白蛋白在體外的結(jié)合已被當(dāng)作研究蛋白質(zhì)結(jié)合行為的模型，并在化學(xué)、生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注[1-2]。在藥物與蛋白質(zhì)相互作用的研究領(lǐng)域，熒光光譜法和紫外吸收法是相對較為常用的方法。在熒光光譜法中，通過分析熒光參數(shù)，能夠得到很多有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的信息[3]。熒光光譜包括熒光猝滅光譜、同步熒光光譜和共振光散射光譜，這3種光譜可以通過改變同一臺(tái)熒光光譜儀的參數(shù)值掃描得到。熒光光譜法因其靈敏、快速、簡單的優(yōu)勢[4]，在檢測領(lǐng)域應(yīng)用普遍。紫外吸收法是探討蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化和微環(huán)境變化簡單而有效的方法[5]。利用蛋白質(zhì)與藥物體系的紫外吸收光譜的變化(如位移，峰值變化)，不但能預(yù)測出體系作用機(jī)理，還能計(jì)算體系的結(jié)合常數(shù)[6-7]。

在結(jié)構(gòu)上，牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白有很高的同源性[8]，而且BSA具有穩(wěn)定性高、相對廉價(jià)、容易獲得以及特殊的配體結(jié)合性質(zhì)等特點(diǎn)，所以經(jīng)常被選作模型蛋白來研究藥物與蛋白質(zhì)的相互作用[9]。硫酸粘桿菌素(Colistin sulfate, CLS) 是一種由多粘芽胞桿菌和其相關(guān)的物種的菌株中分離出來的一種多肽抗生素[10]。硫酸頭孢匹羅(Cefpirome Sulfate，CFS)和頭孢匹胺鈉(Cefpiramide Sodium, CFMS)均為頭孢菌素類抗生素。本文利用4種方法研究了BSA與上述3種藥物的相互作用，并對同一體系4種方法所得的結(jié)論進(jìn)行了比較和分析。3個(gè)體系的研究結(jié)果也證明了4種方法的可行性。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 藥品與儀器

牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司)配成濃度為2.0×10-4mol/L的水溶液備用。硫酸粘桿菌素(CLS)、硫酸頭孢匹羅(CFS)、頭孢匹胺鈉(CFMS)的標(biāo)準(zhǔn)品均配制成濃度為1.0×10-4mol/L的水溶液備用。配制內(nèi)含0.15 mol/L的NaCl的0.05 mol/L的 Tris-HCl緩沖溶液(pH =7.40)。以上水溶液均置于冰箱中4 ℃保存，實(shí)驗(yàn)用水均為二次石英蒸餾水。

使用的儀器主要有日本島津RF-5301PC熒光分光光度計(jì)和UV-265紫外可見分光光度計(jì)，南京桑力電子設(shè)備廠生產(chǎn)的SYC-15B型超級恒溫水浴，上海雷磁儀器廠出品的pHS-3C型精密酸度計(jì)。

2.2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.2.1 熒光光譜測試

在一系列10 mL比色管中分別加入1.0 mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0 mL BSA(2.0×10-6mol/L)溶液及不同體積的CLS(CFS或CFMS)溶液，用二次蒸餾水定容，靜置30 min使體系反應(yīng)完全。將樣品置于1 cm石英比色皿中，設(shè)置發(fā)射和激發(fā)狹縫均為5 nm。

熒光猝滅法：設(shè)置儀器激發(fā)波長為280 nm，掃描熒光光譜，記錄各體系在340 nm處的熒光強(qiáng)度；同步熒光法：使發(fā)射波長與激發(fā)波長保持固定差值λem-λex=Δλ(15 nm或60 nm)掃描各體系的同步熒光光譜，讀取最高峰處的熒光強(qiáng)度；共振光散射法：固定λem-λex= 0 nm，測定 220～700 nm范圍內(nèi)3種藥物與BSA的共振光散射光譜并記錄290 nm處的共振光散射光強(qiáng)度。

2.2.2 紫外吸收光譜測試

在一系列10 mL比色管中加入1.0 mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0 mL BSA(2.0×10-5mol/L)溶液及不同體積的CLS(CFS或CFMS)溶液，用二次蒸餾水定容，靜置30 min使體系反應(yīng)完全。以相應(yīng)濃度的藥物溶液為參比，掃描各體系溶液在190～450 nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光光譜分析

圖1所示為3個(gè)體系的熒光光譜。由圖1可知，增加藥物濃度，BSA在340 nm處的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)有規(guī)律的下降趨勢，說明3種藥物均與BSA發(fā)生了相互作用，同時(shí)伴隨有BSA內(nèi)源熒光的猝滅現(xiàn)象[11]。將測得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按Stern-Volmer方程[12]處理，可以進(jìn)一步推斷猝滅機(jī)理：

CBSA= 2.0×10-7mol/L. 1～10:CCLS= (0,0.2,1.0,5.0,8.0,10,15,20,30,40)×10-6mol/L.CCFS=(0,0.4,1.2,4.0,8.0,10,20,30,40,50)×10-6mol/L.CCFMS= (0,0.4,1.2,4.0,8.0,10,20,30,40,50)×10-6mol/L.

圖1 BSA-藥物體系的熒光光譜(T= 298 K)。A: BSA-CLS; B: BSA-CFS; C: BSA-CFMS。

Fig.1 Fluorescence spectra of BSA-drugs system(T= 298 K). A: BSA-CLS. B: BSA-CFS. C: BSA-CFMS.

(1)

以F0/F-[L] 作圖，由擬合直線可得BSA與藥物的猝滅常數(shù)Ksv以及猝滅速率常數(shù)Kq，列于表1。3個(gè)體系的Kq值均比2×1010L/(mol·s)大兩個(gè)數(shù)量級，說明BSA-CLS、BSA-CFS、BSA-CFMS 3個(gè)體系的結(jié)合過程是生成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程[13]，

與圖1中加入藥物使BSA的最大吸收峰發(fā)生紅移現(xiàn)象一致[14]。應(yīng)用方程(2)[15]可以計(jì)算3個(gè)體系的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n：

(2)

以 lg{(F0-F)/F}對 lg{[Lt]-n[Bt](F0-F)/F0} 作圖，由擬合直線的斜率和截距可得Ka和n值，結(jié)果列于表1。結(jié)果顯示，3個(gè)體系的n值均約為1，即藥物與蛋白均以1∶1的比例相結(jié)合[16]。

表1 熒光法猝滅法測得的3個(gè)體系在298 K的猝滅反應(yīng)參數(shù)

r1為方程F0/F-[L]的線性相關(guān)系數(shù)；r2為方程lg[(F0-F)/F]-lg{[Lt]-n[Bt](F0-F)/F0}的線性相關(guān)系數(shù)。

3.2 同步熒光光譜分析

圖2為3種藥物與BSA的同步熒光光譜。BSA-CLS體系：當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，酪氨酸的最大發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移，說明BSA的構(gòu)象發(fā)生改變，酪氨酸周圍極性減小，疏水性增加[17]。當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，同步光譜沒有發(fā)生位移變化，

CBSA=2.0×10-7mol/L. 1～10:CCLS=(0,0.2,1.0,5.0,8.0,10,15,20,30,40)×10-6mol/L.CCFS=(0,0.4,1.2,4.0,8.0,10,20,30,40,50)×10-6mol/L.CCFMS=(0,0.4,1.2,4.0,8.0,10,20,30,40,50)×10-6mol/L.

圖2 BSA-藥物體系的同步熒光光譜(T = 298 K)。 (A)Δλ=15 nm；(B)Δλ=60 nm。

r1為方程F0/F-[L]的線性相關(guān)系數(shù)；r2為方程lg[(F0-F)/F]-lg{[Lt]-n[Bt](F0-F)/F0}的線性相關(guān)系數(shù)。

說明色氨酸周圍極性沒有因加入CLS而發(fā)生改變。BSA-CFS體系：當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，酪氨酸的最大發(fā)射波長向短波長方向發(fā)生移動(dòng)，說明酪氨酸周圍極性發(fā)生改變。當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，色氨酸最大發(fā)射波長向長波長移動(dòng)，說明色氨酸周圍的極性增加，疏水性降低[18]。BSA-CFMS體系：當(dāng)Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時(shí)，色氨酸和酪氨酸的光譜圖均發(fā)生一定紅移，說明CFMS的加入使色氨酸和酪氨酸周圍環(huán)境均發(fā)生改變。對于同步熒光法，利用方程(1)、(2)分別對3個(gè)體系的同步熒光法所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果列于表2。比較表1與表2 的數(shù)據(jù)可以看出，同步熒光法與熒光猝滅法所得的猝滅機(jī)理相同，猝滅參數(shù)非常接近，說明同步熒光法應(yīng)用于計(jì)算猝滅參數(shù)是可取的。

3.3 共振光散射光譜(RLS)分析

圖3為BSA-CLS和BSA-CFS兩個(gè)體系的RLS光譜，體系BSA-CFMS的RLS譜圖因與體系BSA-CFS相似，故沒有列出。由圖3可知，單獨(dú)的BSA在290 nm處有較強(qiáng)的RLS信號。當(dāng)加入藥物濃度增加時(shí)，BSA的RLS信號發(fā)生規(guī)律性降低，并有新峰形成。取BSA在290 nm處的最大散射峰變化，按方程(1)、(2)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，求得3個(gè)體系的Ksv、Kq、Ka列于表3。由表3可知，RLS法所得的結(jié)果與采用熒光猝滅方法所得的結(jié)果在同一個(gè)數(shù)量級。因?yàn)楣舱窆馍⑸涔庾V法也屬于熒光光譜的一種，所以，前兩種方法的分析公式同樣也適用于共振光光譜的分析。通過比較表1、2、3可知，同一體系的3種熒光法所得到的猝滅參數(shù)很接近。說明RLS法可以應(yīng)用于測定藥物與蛋白質(zhì)的相互作用。

CBSA = 2.0×10-7 mol/L. 1～10: CCLS = (0,0.2,1.0,5.0,8.0,10,15,20,30,40)×10-6 mol/L.

SystemKq/(L·mol-1·s-1)Ksv/(L·mol-1)r1Ka/(L·mol-1)nr2BSA?CLS1．60×10121．60×1040．99431．53×1040．840．9957BSA?CFS2．80×10122．80×1040．99432．39×1040．900．9931BSA?CFMS2．38×10122．38×1040．99862．34×1040．860．9981

r1為方程F0/F-[L]的線性相關(guān)系數(shù)；r2為方程lg[(F0-F)/F]-lg{[Lt]-n[Bt](F0-F)/F0}的線性相關(guān)系數(shù)。

3.4 紫外吸收光譜分析

圖4為3個(gè)體系的紫外吸收譜圖。由圖4可知，在3個(gè)體系中，隨著藥物濃度的增加，BSA在波長210 nm附近的最大吸收峰強(qiáng)度降低且伴有峰位紅移現(xiàn)象，說明3個(gè)體系在相互作用時(shí)均生成了新的物質(zhì)，這也再次表明3種藥物與蛋白的結(jié)合過程為靜態(tài)猝滅[19]。蛋白與藥物小分子的Kb可以通過公式(3)[20]得到：

CBSA= 2.0×10-6mol/L. 1～7:CCLS=(0,4,10,20,30,40,50)×10-6mol/L.CCFS=(0,4,10,20,30,40,50)×10-6mol/L.CCFMS=(0,4,10,20,30,40,50)×10-6mol/L.

圖4 BSA-藥物體系的紫外吸收光譜 (T=298 K)。A: BSA-CLS; B: BSA-CFS; C: BSA-CFMS。

Fig.4 Absorption spectra of BSA-drugs systems (T=298 K). A: BSA-CLS. B: BSA-CFS. C: BSA-CFMS.

(3)

由(A0-A)-1對[L]-1作圖計(jì)算得到的3個(gè)體系的紫外吸收法的結(jié)合常數(shù)Kb列于表4。比較表1、2、3、4數(shù)據(jù)可知，利用公式(3)計(jì)算得到的紫外吸收法的結(jié)合常數(shù)與熒光法利用公式 (1)、(2)計(jì)算得到的在同一個(gè)數(shù)量級，說明采用紫外吸收法計(jì)算蛋白質(zhì)-藥物體系的結(jié)合常數(shù)是可取的。數(shù)值上微小的差別是因?yàn)樽贤馕辗ㄅc熒光法計(jì)算參數(shù)時(shí)利用的公式不同。

3.5 Hill系數(shù)的計(jì)算

由Hill方程[21]的系數(shù)nH可以判斷具有多重配體結(jié)合部位的蛋白質(zhì)與配體相結(jié)合時(shí)，各結(jié)合部位之間的相互影響情況：

表4 紫外吸收光譜法測得的3個(gè)體系在298 K的結(jié)合常數(shù)

r3是方程(A0-A)-1-[L]-1的線性相關(guān)系數(shù)。

(4)

其中，Y是結(jié)合飽和分?jǐn)?shù)，K是結(jié)合常數(shù)，nH是Hill系數(shù)。nH=1表示零協(xié)同作用，nH>1表示正協(xié)同作用，nH<1表示負(fù)協(xié)同作用。

(5)

其中，對于熒光光譜法，Q=(F0-F)/F0；對于紫外吸收法，Q=(A0-A)/A0。1/Qm是以1/Q對1/[L]作直線圖的截距。各體系各方法得到的數(shù)值nH列于表5。由表5可見，各體系的nH均約等于1，表明在藥物在與蛋白質(zhì)結(jié)合過程中，3種藥物(CLS，CFS，CFMS)對之后的配體再與BSA結(jié)合不會(huì)產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為零協(xié)同作用[22]。同一個(gè)體系中的4種方法所得的數(shù)據(jù)相同，也說明在計(jì)算Hill系數(shù)時(shí)4種方法都是可取的。

表5 3個(gè)體系的Hill系數(shù)

r4為曲線lg[Y/(1-Y)]-lg[L]的相關(guān)系數(shù)。FQS：熒光猝滅法；SYS同步熒光法；RLS：共振光散射法。

4 結(jié) 論

利用4種方法分別研究了BSA-CLS、BSA-CFS、BSA-CFMS 3個(gè)體系之間的相互作用，且在每個(gè)體系中利用4種方法的數(shù)據(jù)計(jì)算實(shí)驗(yàn)參數(shù)時(shí)，

擬合方程的線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。對同一體系，4種方法所得到的藥物與蛋白作用機(jī)理相同。對于體系結(jié)合常數(shù)，熒光法、同步熒光法所得相近且數(shù)值較高，共振熒光法偏低，紫外吸收法最小。這可能是共振熒光法所受干擾較大而紫外吸收法靈敏度較低所致。因此，熒光法、同步熒光法更適于用于藥物與蛋白結(jié)合反應(yīng)的研究。

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劉保生(1963-)，男，河北保定人，研究員，1992年于河北大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用的研究。

E-mail: lbs@hbu.edu.cn

Multi-spectrophotometric Methods for The Investigation of The Interactions of Bovine Serum Albumin and Drugs

LIU Bao-sheng*, LI Tong-tong, ZHANG Qiu-ju, CUI Meng-meng, DUAN Shao-tong

(KeyLaboratoryofAnalyticalScienceandTechnologyofHebeiProvince,CollegeofChemistry&EnvironmentalScience,HebeiUniversity,Baoding071002,China)

The interactions between colistin sulfate(CLS), cefpirome sulfate(CFS), cefpiramide sodium(CFMS) and bovine serum albumin(BSA) were investigated by fluorescence quenching spectroscopy (FQS), synchronous fluorescence spectroscopy (SYS), resonance light scattering (RLS) and UV absorption spectroscopy at 298 K with the simulated physiological condition of the body. The results show that the binding constants of BSA-CLS, BSA-CFS and BSA-CFMS obtained from four methods are at the same order of magnitude, and the quenching mechanism is a static quenching process. The number of binding site (n) in the three system is approximately equal to 1, and the values of Hill’s coefficients in the three system are approximately consistent. The comparison to the experimental data for four methods indicates that FQS, SYS seem to be more suitable for the studying of the reaction mechanism of protein and drug.

bovine serum albumin; fluorescence quenching spectroscopy; synchronous fluorescence spectroscopy; resonance light scattering spectroscopy; UV-Vis absorption spectroscopy

1000-7032(2016)07-0866-07

2016-01-28；

2016-04-13

國家自然科學(xué)基金(21375032)資助項(xiàng)目

O657.3

A

10.3788/fgxb20163707.0866

*CorrespondingAuthor,E-mail:lbs@hbu.edu.cn