李小芳， 馮小強(qiáng)*， 楊 聲， 朱元成

(1. 天水師范學(xué)院 化工學(xué)院， 甘肅 天水 741001； 2. 定西師專 化學(xué)系， 甘肅 定西 743000)

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席夫堿稀土配合物與DNA的作用方式

李小芳1， 馮小強(qiáng)1*， 楊 聲2， 朱元成1

(1. 天水師范學(xué)院 化工學(xué)院， 甘肅 天水 741001； 2. 定西師專 化學(xué)系， 甘肅 定西 743000)

席夫堿； 稀土； DNA； 循環(huán)伏安法； 光譜法

1 引 言

席夫堿具有碳氮雙鍵的亞胺或甲亞胺基團(tuán)，容易和金屬離子配位得到結(jié)構(gòu)各異的配合物，從而賦予了其豐富的功能活性，是潛在的一種新型抗癌、抗腫瘤和抗氧化藥物[1-3]。近期國(guó)內(nèi)研究者對(duì)席夫堿及配合物的合成和生物活性做了大量研究，如寧夏大學(xué)學(xué)者[4]發(fā)現(xiàn)合成的3,5-二碘水楊醛縮2,6-二氨基吡啶席夫堿金屬配合物對(duì)藤黃微球菌有良好的抑制作用，并且是以插入方式與ct-DNA結(jié)合的；南華大學(xué)學(xué)者[5]合成的2-羥基-1-萘甲醛縮2,6-二氨基吡啶席夫堿以及釷配合物對(duì)枯草桿菌、大腸桿菌、乳酸菌有良好的抑制作用，且配合物的抑菌活性好于席夫堿本身；貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)者[6]以三齒席夫堿配體H2L{1-苯基-3-[(2-羥基苯)亞胺]-1-丁酮}和單齒N-雜環(huán)[咪唑(Himdz)，2-甲基咪唑(Mimdz)]分別與Ni2+配位得到的配合物，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和奇異變形桿菌具有一定的抑菌活性；陜西科技大學(xué)學(xué)者[7]合成雙乙酰基二茂鐵雙肼腙配體，分別與Cu2+、Ni2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+合成的金屬配合物比其配體有更高的抗菌活性。Ejiah等[8]通過體外抑菌法研究發(fā)現(xiàn)，水楊醛縮氨基苯甲酸席夫堿對(duì)細(xì)菌大腸桿菌、綠濃桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌具有很好的抑菌活性。Raman[9]等合成的席夫堿金屬(Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+)配合物對(duì)傷寒沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌4種細(xì)菌和黑曲霉、黃曲霉、紋枯病菌3種真菌有很好的抑制作用，在氧化劑存在下僅有席夫堿銅配合物能夠切割ct-DNA。

研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)抗腫瘤藥物的藥理活性與DNA插入結(jié)合方式有關(guān)。因此，研究藥物小分子與DNA間的作用機(jī)制，有助于揭示抗腫瘤藥效機(jī)理，為尋求新型高效低毒抗腫瘤藥物提供導(dǎo)向。稀土離子能有效地和核酸結(jié)合而優(yōu)于過渡金屬及其配合物。關(guān)于稀土配合物的合成及與生物大分子的相互作用研究較多[10-11]。以糠醛和對(duì)氨基苯磺酸制得的席夫堿為配體，與稀土離子(La3+，Nd3+，Eu3+)反應(yīng)合成配合物，有可能篩選出比原來單一原料更低毒、高效和經(jīng)濟(jì)的抗菌、抗腫瘤藥物。雖然席夫堿稀土配合物的合成和表征有過一些研究，但關(guān)于其與DNA相互作用的研究報(bào)道卻很少?；谙驂A獨(dú)特的生理活性，本文合成了3種糠醛縮對(duì)氨基苯磺酸席夫堿的稀土配合物，通過紫外吸收光譜、熒光光譜和循環(huán)伏安法研究了席夫堿及稀土配合物分別與鯡魚精DNA之間的作用模式。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 材料與儀器

鯡魚精DNA(Sigma公司)。RF-5301型熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)；CHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)。

2.2 糠醛縮對(duì)氨基苯磺酸席夫堿及稀土配合物的制備

對(duì)氨基苯磺酸用40 mL 5%的NaOH溶液溶解，通入氮?dú)猓?0 ℃攪拌下加入等摩爾的糠醛，反應(yīng)溶液即刻由淡黃色變?yōu)榧t棕色，最后變成褐色。繼續(xù)恒溫回流2 h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液減壓濃縮后加入大量無水乙醇，馬上有黃色沉淀產(chǎn)生。抽濾、干燥得土黃色席夫堿，產(chǎn)率85%。

在席夫堿水溶液中緩慢加入等摩爾量的稀土氯化物，40 ℃恒溫反應(yīng)5 h，然后用5%NaOH調(diào)pH至弱堿性，即刻有沉淀產(chǎn)生。靜置抽濾，干燥得稀土配合物。

2.3 席夫堿稀土配合物與鯡魚精DNA的作用

DNA在金電極表面的自組裝參看文獻(xiàn)[12]，電化學(xué)實(shí)驗(yàn)過程參看文獻(xiàn)[13]；紫外光譜和熒光光譜法研究稀土配合物與DNA相互作用的具體實(shí)驗(yàn)過程參看文獻(xiàn)[14]。

3 結(jié)果與討論

3.1 配合物表征

3.2 紫外光譜法研究配合物與DNA的作用

席夫堿配體及3種稀土配合物的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)及圖如表1和圖1所示。席夫堿在246.5 nm和200.5 nm處產(chǎn)生2個(gè)很強(qiáng)的吸收峰。與稀土離子配位形成配合物后，吸收峰較席夫堿在246.5 nm和200.5 nm的吸收峰分別紅移11～16 nm和藍(lán)移5 nm。配合物除了出現(xiàn)配體的一些峰外，還在213～216 nm附近產(chǎn)生新的吸收峰。紫外光譜表明席夫堿與稀土離子配位成鍵形成了新的配合物。合成的3種稀土配合物的紫外光譜相似，說明它們的結(jié)構(gòu)也相似。

席夫堿及3種稀土配合物在加入DNA前后的紫外光譜如圖2所示。隨著DNA不斷加入到配合物溶液中，所引起的光譜擾動(dòng)相對(duì)較大，吸收峰的形狀雖然幾乎沒有變化，但吸光度逐漸下降，即出現(xiàn)了減色效應(yīng)，在195 nm處的吸收峰峰位稍有紅移趨勢(shì)。吸光度降低，是由于配合物與DNA的磷酸基團(tuán)發(fā)生了相互作用，使得DNA鏈的纏繞性增大，DNA的空間結(jié)構(gòu)趨于縮攏，發(fā)色基團(tuán)被部分內(nèi)陷包裹，吸收躍遷偶極矩減小，導(dǎo)致發(fā)生減色效應(yīng)。小分子吸收光譜出現(xiàn)減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象是該小分子與DNA發(fā)生嵌插作用的依據(jù)。從圖2紫外吸收光譜的變化可判斷3種稀土配合物及席夫堿均以嵌入方式與鯡魚精DNA發(fā)生相互作用，從而形成了新的化合物[15]。此外，減色效應(yīng)的大小與插入程度正相關(guān)，吸光度下降程度的大小也反映了小分子與DNA之間結(jié)合能力的強(qiáng)弱，一般而言，小分子的吸收峰強(qiáng)度下降越大，則與DNA的作用能力越強(qiáng)。在濃度相同的這3種配合物及席夫堿中，席夫堿-Eu和席夫堿-La分別與DNA作用后的減色程度更為明顯，而席夫堿-Nd較小，席夫堿最小。這說明席夫堿-Eu和席夫堿-La插入程度較大，而席夫堿-Nd插入程度較小，席夫堿與DNA的插入程度最小，即與DNA間的作用能力順序?yàn)椋篍u (Ⅲ)>La(Ⅲ)>Nd(Ⅲ)>席夫堿。這可能是席夫堿配體與DNA發(fā)生作用的同時(shí)，稀土離子也參與了與帶負(fù)電荷的DNA作用，最終導(dǎo)致DNA主鏈線電荷密度減小，纏繞增大，進(jìn)而增強(qiáng)了與DNA的結(jié)合作用。

圖1 席夫堿及3種稀土配合物的紫外吸收光譜

Fig.1 UV spectra of Schiff base and three kinds of complexes

表1 席夫堿及3種稀土配合物的紫外光譜數(shù)據(jù)

c(complex)=0.5 mg·mL-1, c(DNA)=0.1 mg·mL-1 (20 μL per scan, 1～10: 0～180 μL)

圖2 DNA加入前后席夫堿及稀土配合物的紫外吸收光譜。(a) Eu配合物；(b) Nd配合物；(c) La配合物； (d) 席夫堿。

Fig.2 UV absorption spectra of Schiff base and complexes before and after DNA addding. (a) Eu complex. (b) Nd complex. (c) La complex.(d) Schiff.

3.3 熒光光譜法研究配合物與DNA的作用

游離態(tài)的中性紅(NR)自身的熒光很弱，但當(dāng)NR分子以嵌插方式與DNA結(jié)合后，體系的熒光強(qiáng)度會(huì)大幅度增大。但是，當(dāng)有一個(gè)能取代鍵合的NR或能破壞DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的分子加入時(shí)，NR-DNA體系的熒光會(huì)發(fā)生猝滅或部分猝滅[16]。以550 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)得DNA-NR體系在596 nm處有一強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，如圖3所示。逐漸滴加席夫堿或稀土配合物時(shí)，明顯看到在596 nm處的熒光強(qiáng)度也隨之逐漸降低，峰位并沒有明顯的移動(dòng)。這說明席夫堿及稀土配合物能夠猝滅DNA-NR體系的熒光，即席夫堿及稀土配合物與NR一樣，和DNA存在相同的作用機(jī)理，導(dǎo)致席夫堿及稀土配合物與NR競(jìng)爭(zhēng)與DNA的結(jié)合，使得NR在DNA的結(jié)合位點(diǎn)上逐漸被置換出來，溶液中游離態(tài)的NR分子數(shù)增多，熒光較DNA-NR減弱。但席夫堿及稀土配合物的濃度增大到一定程度時(shí)，熒光強(qiáng)度下降幅度很小，說明此時(shí)席夫堿及稀土配合物、NR和DNA三者之間的作用達(dá)到平衡，與DNA的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到飽和。因此，可以推斷出席夫堿及稀土配合物都能夠與DNA以插入方式發(fā)生鍵合。此外，熒光強(qiáng)度的下降程度能夠說明小分子與DNA作用強(qiáng)度，從圖3的變化程度來看，滴加配合物后的DNA-NR體系的熒光強(qiáng)度下降程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于席夫堿，說明席夫堿形成配合物后與DNA的作用強(qiáng)度強(qiáng)于席夫堿本身，這主要是稀土離子在起作用。

3.4 循環(huán)伏安法研究配合物與DNA的相互作用

圖3 席夫堿及稀土配合物對(duì)DNA-NR體系熒光光譜的影響。(a) La配合物；(b) Eu配合物；(c) Nd配合物；(d) 席夫堿。

Fig.3 Effect of Schiff base and complex on the fluorescence spectra of DNA-NR. (a) La complex. (b) Eu complex. (c) Nd complex. (d) Schiff.

圖4 席夫堿配合物存在下，K4Fe(CN)6在Au/DNA電極上的循環(huán)伏安曲線。(a)Nd配合物；(b)La配合物；(c)Eu配合物。

Fig.4 CV curves of K4Fe(CN)6in Schiff base complex solution. (a) Nd complex. (b) La complex. (c) Eu complex.

圖5 席夫堿配合物存在下，掃速對(duì)K4Fe(CN)6在Au/ DNA電極上循環(huán)伏安曲線的影響。(a) Eu配合物；(b) La配合物；(c) Nd配合物。

Fig.5 Effect of scan rate on CV curves of K4Fe(CN)6in Schiff base complex solution. (a) Eu complex. (b) La complex. (c) Nd complex.

4 結(jié) 論

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李小芳(1983-)，女，甘肅甘谷人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，2009年于蘭州大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事功能高分子及有機(jī)稀土配位的研究。

E-mail: tslxffxq@163.com

馮小強(qiáng)(1979-)，男，甘肅華亭人，碩士，副教授，2007年于蘭州大學(xué)獲得碩士學(xué)位，主要從事功能高分子方面的研究。

E-mail: fengxiaoqiang1979@163.com

Interaction of Schiff Base Rare Earth Complexes with Herring Sperm DNA

LI Xiao-fang1, FENG Xiao-qiang1*, YANG Sheng2, ZHU Yuan-cheng1

(1.CollegeofChemicalEngineeringandTechnology,TianshuiNormalUniversity,Tianshui741001China;2.ChemistryDepartment,DingXiTeachers’College,Dingxi743000,China)

Schiff base; rare earth complex; DNA; cyclic voltammetry; spectra method

2016-03-08；

2016-04-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(51063006)； 天水師范學(xué)院“青藍(lán)”人才工程和中青年教師科研項(xiàng)目(TSA1508)資助

1000-7032(2016)07-0873-08

O657.3

A

10.3788/fgxb20163707.0873

*CorrespondingAuthor,E-mail:fengxiaoqiang1979@163.com