付艾平，宋慧潔，劉敬臣，藍(lán)雨雁

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

瑞芬太尼誘發(fā)大鼠痛覺過敏的機(jī)制

付艾平，宋慧潔，劉敬臣，藍(lán)雨雁

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 探討瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏的機(jī)制。方法 取24只SD大鼠，右頸靜脈置入靜脈留置針，隨機(jī)分為三組，每組8只。對照組靜脈泵注生理鹽水1.0 μg/(kg·min)，持續(xù)2 h；瑞芬太尼組靜脈泵注瑞芬太尼1.0 μg/(kg·min)，持續(xù) 2 h；A-803467組靜脈注射A-803467 20 mg/kg，10 min后靜脈泵注瑞芬太尼1.0 μg/(kg·min)，持續(xù) 2 h。各組分別于頸靜脈置管前(t0)、頸靜脈置管完成時(t1)，給藥后0.5、1、2 h(t2、t3、t4)及停藥后0.5 h(t5)檢測熱痛覺閾值。最后一次檢測完熱痛覺閾值后取大鼠背根神經(jīng)，采用RT-PCR法檢測Na1.8 mRNA表達(dá)，采用免疫組化法檢測Nav1.8蛋白表達(dá)。結(jié)果 三組t0、t1時熱痛覺閾值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；瑞芬太尼組、A-803467組t2、t3、t4時熱痛覺閾值均高于對照組(P均<0.05)，t5時熱痛覺閾值均低于對照組(P均<0.05)；瑞芬太尼組t5時熱痛覺閾值低于A-803467組(P<0.05)。瑞芬太尼組、A-803467組Nav1.8 mRNA及蛋白表達(dá)均高于對照組(P均<0.05)，兩組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏的機(jī)制可能為激活Nav1.8 通道，增加Nav1.8 通道蛋白表達(dá)。

痛覺過敏；瑞芬太尼；Nav1.8；背根神經(jīng)節(jié)

瑞芬太尼廣泛應(yīng)用于臨床麻醉和鎮(zhèn)痛，但可誘發(fā)痛覺過敏[1]，導(dǎo)致麻醉恢復(fù)期患者躁動及高應(yīng)激反應(yīng)，誘發(fā)心腦血管并發(fā)癥。門控離子通道是可興奮細(xì)胞產(chǎn)生動作電位的基礎(chǔ)，Nav1.8是特異性高表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)初級感覺小神經(jīng)元中的一種電壓門控鈉離子通道，是其所在細(xì)胞產(chǎn)生動作電位去極化期鈉離子電流的主要通道，與疼痛的產(chǎn)生關(guān)系密切。Nav1.8通道蛋白主要表達(dá)于小直徑背根神經(jīng)節(jié)的C纖維上[2]，對正常疼痛和痛覺過敏的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用[3]。2013年4～10月，我們觀察了瑞芬太尼對大鼠熱痛覺閾值及其背根神經(jīng)節(jié) Nav1.8通道蛋白表達(dá)的影響。現(xiàn)分析結(jié)果，探討瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年SD大鼠24只，雄性，體質(zhì)量250～300 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，動物許可證號：SCXK(桂)2003-0005。瑞芬太尼(湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)，Nav1.8通道拮抗劑A-803467(上海西格瑪奧德里齊貿(mào)易有限公司)，兔抗鼠Nav1.8抗體(美國Abcam公司)；XR-YLS-12A鼠尾光照測痛儀(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.2 動物分組及處理 取24只大鼠，腹腔注射5%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后固定于操作臺，沿頸中線偏右側(cè)縱行剪開皮膚，顯露右頸靜脈，置入靜脈留置針，回抽有血后，接好充滿肝素的接頭和肝素帽，頸背部用7號線縫合固定，并用絡(luò)合碘消毒；肝素鹽水沖管(0.5 mL/d)，同時肌注青霉素鈉(10 U/d)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將置管后的大鼠分為對照組、瑞芬太尼組、A-803467組,每組8只。對照組靜脈泵注生理鹽水1.0 μg/(kg·min)，持續(xù)2 h；瑞芬太尼組靜脈泵注瑞芬太尼1.0 μg/(kg·min)，持續(xù) 2 h；A-803467組靜脈注射A-803467 20 mg/kg，10 min后靜脈泵注瑞芬太尼1.0 μg/(kg·min)，持續(xù)2 h。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 熱痛閾值 三組分別于頸靜脈置管前(t0)、頸靜脈置管完成時(t1)，給藥后0.5、1、2 h(t2、t3、t4)及停藥后0.5 h(t5)檢測熱痛覺閾值。具體方法：將大鼠裝入固定器內(nèi)適應(yīng)5 min，使其鼠尾固定不動，條形光束照射鼠尾中外1/3交界處，采用XR-YLS-12A鼠尾光照測痛儀記錄從照射開始到甩尾的時間，即熱痛覺閾值。重復(fù)測定3次，每次間隔1 min，取平均值。

1.3.2 背根神經(jīng)節(jié)Nav1.8 mRNA表達(dá) 最后一次檢測完熱痛覺閾值后，各組隨機(jī)取4只，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg，麻醉后固定于冰上，心臟插管；采用生理鹽水灌注直至流出液澄清。迅速摘取大鼠背根神經(jīng)節(jié)，采用RT-PCR法檢測Na1.8 mRNA表達(dá)。采用TRIzol法提取總RNA，檢測總RNA濃度和純度。使用TIANScript cDNA第1鏈合成試劑盒按說明書操作提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用20 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Nav.18的PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72℃延伸1 min，40個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。β-actin的PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，成像分析系統(tǒng)掃描獲取的電泳圖像，應(yīng)用AlphaView SA系統(tǒng)進(jìn)行分析，以Nav1.8條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為Nav1.8 mRNA的表達(dá)水平。

1.3.3 背根神經(jīng)節(jié)Nav1.8蛋白表達(dá) 取三組剩余大鼠(每組4只)，參照1.3.2方法摘取背根神經(jīng)節(jié)，常規(guī)石蠟包埋后切片，采用免疫組化法測定Nav1.8蛋白表達(dá)。在切片中加入兔抗大鼠Nav1.8多克隆抗體50 μL，4 ℃冰箱過夜；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育15 min；中性樹膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察切片染色情況，在400倍鏡下拍攝；采用Image-Pro Plus6.0軟件計算陽性染色(細(xì)胞著黃色)區(qū)域的積分光密度值。

2 結(jié)果

2.1 三組熱痛閾值比較 三組t0、t1時熱痛閾值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；瑞芬太尼組、A-803467組t2、t3、t4時熱痛覺閾值均高于對照組(P均<0.05)，t5時熱痛覺閾值均低于對照組(P均<0.05)；瑞芬太尼組t5時熱痛覺閾值低于A-803467組( P<0.05)。見表1。

表1 三組各時間點(diǎn)熱痛覺閾值比較

注：與對照組同時間點(diǎn)比較，*P<0.05； 與瑞芬太尼組同時間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.2 三組背根神經(jīng)節(jié)Nav1.8 mRNA及其蛋白表達(dá)比較 瑞芬太尼組、A-803467組Nav1.8 mRNA及蛋白相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.05)，兩組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 三組背根神經(jīng)節(jié)Nav1.8 mRNA及其蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

術(shù)中使用阿片類藥物尤其是大劑量使用是誘發(fā)術(shù)后痛覺過敏的重要原因[4]。瑞芬太尼是超短效阿片受體激動劑，具有鎮(zhèn)痛起效迅速、作用時間短、不依賴肝腎代謝、 無蓄積作用等優(yōu)點(diǎn)[5]， 但其消除半衰期為3～10 min，停藥后很快出現(xiàn)痛覺過敏，停藥后30 min痛閾值降至最低；其誘發(fā)痛覺過敏作用較其他阿片類藥物更為顯著[6～8]。目前對中樞致敏的研究主要集中在脊髓，研究發(fā)現(xiàn)熱痛刺激感受器在脊髓。本研究結(jié)果顯示，三組t0、t1時點(diǎn)熱痛覺閾值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，排除了頸靜脈置管對熱痛覺閾值的影響；瑞芬太尼組、A-803467組t2、t3、t4時點(diǎn)熱痛覺閾值均高于對照組，提示瑞芬太尼具有鎮(zhèn)痛作用。本研究t5時瑞芬太尼組熱痛覺閾值低于對照組，表明持續(xù)泵入瑞芬太尼可誘發(fā)大鼠痛覺過敏；t5時瑞芬太尼組較A-803467組熱痛閾值降低，說明阻滯Nav1.8通道后瑞芬太尼仍可誘發(fā)痛覺過敏，但作用明顯減弱。

河豚毒素不敏感型電壓門控鈉通道亞型Nav1.8主要表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)小直徑C纖維神經(jīng)元上，該通道的開放直接導(dǎo)致動作電位的產(chǎn)生[11,12]，在感受傷害的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元動作電位的電位生成中占據(jù)主導(dǎo)地位[13]，在傷害性感受器外周致敏過程中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，瑞芬太尼組、A-803467組背根神經(jīng)節(jié)Nav1.8 mRNA及相對表達(dá)量均高于對照組，A-803467組與瑞芬太尼組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；提示瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏與Nav1.8過表達(dá)有關(guān)。瑞芬太尼停藥后可導(dǎo)致μ受體很快與抑制型G蛋白解偶聯(lián)，使第二信使cAMP反射性升高，導(dǎo)致Nav1.8表達(dá)增多；另外，瑞芬太尼活化可以興奮G蛋白，直接改變背根神經(jīng)節(jié)離子通道的數(shù)量和狀態(tài)，使Nav1.8蛋白表達(dá)增多[9]。瑞芬太尼誘發(fā)大鼠痛覺過敏時激活Nav1.8通道，引起背根神經(jīng)節(jié)上電壓門控Na離子的數(shù)量、種類、分布及電生理學(xué)活性發(fā)生改變，導(dǎo)致背根神經(jīng)元興奮性升高、放電頻率增多或產(chǎn)生異位放電[3,14,15]，這些變化可以進(jìn)一步引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的敏化，從而誘發(fā)痛覺過敏。

綜上所述，瑞芬太尼誘發(fā)大鼠痛覺過敏的機(jī)制為激活其背根神經(jīng)節(jié)上 Nav1.8 通道，使 Nav1.8 通道蛋白表達(dá)增加。

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廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2011GXNSFA018222)；廣西研究生教育創(chuàng)新計劃資助項(xiàng)目(YCSZ2012039)。

藍(lán)雨雁(E-mail: blueyuyan@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.013

R614.2

A

1002-266X(2016)44-0040-03

2015-12-31)