徐峰，葉青，王靜，楊永紅

(1天津市第三中心醫(yī)院分院，天津300250；2天津市第三中心醫(yī)院；3天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

178例肝細胞癌患者DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A基因rs1550117位點多態(tài)性檢測及意義

徐峰1，葉青2，王靜3，楊永紅1

(1天津市第三中心醫(yī)院分院，天津300250；2天津市第三中心醫(yī)院；3天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院)

目的 探討DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)基因rs1550117位點多態(tài)性與肝細胞癌發(fā)生的關(guān)系。方法 采用Sequenom MassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)，檢測天津漢族人群178例肝細胞癌患者(觀察組)及188例健康人(對照組)DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性。結(jié)果 觀察組DNMT3A基因rs1550117位點基因型AA、AG、GG頻率分別為4.5%、36.0%、59.5%，等位基因G、A頻率分別為81.3%、18.7%；對照組基因型AA、AG、GG頻率分別為3.2%、29.4%、67.4%，等位基因G、A頻率分別為83.8%、16.2%；兩組比較P均>0.05。結(jié)論 DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與肝細胞癌的發(fā)生無明顯關(guān)系。

肝細胞癌；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A；基因位點多態(tài)性

肝細胞癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生涉及多基因調(diào)控、多信號通路，根源是多基因的異常表達[1～3]。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是導致及反映個體腫瘤遺傳易感差異的重要原因之一[4]。原癌基因激活及抑癌基因失活是肝細胞癌發(fā)生的分子基礎[5]。抑癌基因啟動子區(qū)CpG島的重新甲基化可能是抑癌基因失活的機制之一[6]，其過程由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)家族催化。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)基因是DNMT家族重要成員之一，位于人染色體2p23。研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性參與胃癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其與肝癌的關(guān)系報道較少。本研究分析178例肝細胞癌患者DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性，探討其與肝細胞癌發(fā)生的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月～2015年12月在天津市第三中心醫(yī)院、天津市第三中心醫(yī)院分院和天津市中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院確診的肝細胞癌患者178例(觀察組)，男92例、女86例，年齡(53.7±12.3)歲；肝功能Child-Push分級:A級28例，B級89例，C級61例；AFP>500 ng/mL 40例，200～500 ng/mL 72例，<200 ng/mL 66例；彌漫型41例，結(jié)節(jié)性89例，小肝癌48例；包膜完整52例，有血管浸潤77例，合并門脈癌栓33例。TNM分期：T1～4期分別為19、36、79、44例；N 0、1期分別為127、51例；M0、1期分別為136、42例。患者均根據(jù)臨床表現(xiàn)及影像學檢查、肝穿刺活檢、手術(shù)切除組織病理檢查結(jié)果確診，且臨床資料完整。選取同期體檢健康者188例為對照組，男98例、女90例，年齡(54.6±13.2)歲。兩組性別、年齡具有可比性。兩組均系天津市漢族人群，個體間均無血緣關(guān)系。調(diào)查和取樣均征得患者同意，并經(jīng)過天津市第三中心醫(yī)院分院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性檢測 ① DNA提?。河^察組入院時(均未行放化療或其他抗腫瘤藥物治療)、對照組體檢時均采集外周靜脈血3～4 mL，采用QIAGEN基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細胞基因組DNA，步驟參照試劑盒說明書。采用紫外分光光度計進行DNA濃度測定，標化濃度>25 ng/μL，純度OD260/OD280≥1.7，OD260/OD230≥1，樣本量>20 μL。提取好的DNA保存于-80 ℃冰箱備用。②引物的設計與合成：采用Sequenom MassArray Design3.1軟件設計DNMT3A基因rs1550117位點的PCR引物，其中特異性擴增引物1 st序列為5′-ACGTTGGATGCACCTCTGTCTAATTCCACC-3′，擴增引物2 nd序列為5′-ACGTTGGATGCTGCTGGAGGAGTGAGATG-3′；延伸引物序列為5′-ACGTTGGATGCTGCTGGAGGAGTGAGATG-3′。根據(jù)引物濃度計算加入雙蒸水的量，稀釋單管擴增引物濃度至100 μmol/L，加入雙蒸水混合使各引物濃度為0.5 μmol/L；稀釋單管延伸引物濃度至500 μmol/L，加入雙蒸水混合使各引物濃度為8 μmol/L。③基因分型：利用Sequenom MassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)對DNMT3A基因rs1550117位點進行基因分型。具體方法：a. PCR擴增：5.0 μL PCR反應體系：1.0 μL DNA樣本、1.8 μL水、5.0 μL PCR緩沖液、0.1 μL dNTP、0.4 μL MgCl2、1.0 μL PCR引物及0.2 μL酶；PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共45個循環(huán)，最終72 ℃延伸3 min。b. 堿性磷酸酶反應及單堿基延伸：2.0 μL SAP混合液由1.53 μL水、0.17 μL SAP緩沖液、0.3 μL SAP酶構(gòu)成。SAP反應條件：37 ℃ 40 min，85 ℃ 5 min。堿性磷酸酶處理后針對SNP進行單堿基延伸：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸60 s，共40個循環(huán)；最終72 ℃延伸3 min。c.測序：將分型產(chǎn)物用樹脂脫鹽后經(jīng)自動點樣儀點樣于384孔板PCR儀(384-element Spectro CHIP)上，并用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜進行分析，最終結(jié)果由MassArray RT軟件系統(tǒng)進行實時讀取，分析基因分型。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。采用Hardy-Weinberg平衡軟件進行遺傳平衡檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

兩組等位基因和基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，均具有群體代表性。兩組DNMT3A基因rs1550117位點基因型及等位基因分布差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 兩組DNMT3A基因rs1550117位點基因型和等位基因分布[例(%)]

3 討論

SNP是在基因組水平上由單個核苷酸變異(置換、顛換、缺失和插入)引起的一種DNA序列多態(tài)性，已經(jīng)被作為第3代遺傳標志[7]。Sequenom MassArray質(zhì)譜陣列技術(shù)其基本原理為基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，具有高通量的檢測系統(tǒng)，可以高效自動化篩查SNP，適合大規(guī)模篩查的需要。

DNMT3A是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族中重要的從頭甲基化酶，其通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)甲基化過程而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。DNMT3A基因rs1550117位點位于CpG啟動子區(qū)，該位點基因突變與腫瘤的相關(guān)性研究國內(nèi)外已有報道，尤其是與胃癌的關(guān)系報道較多，但結(jié)論差異較大。Fan等[8]發(fā)現(xiàn)，在中國江蘇漢族人群中，DNMT3A啟動子區(qū)rs1550117位點多態(tài)性與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有明顯的相關(guān)性，其潛在機制可能和G>A變異型的高度活躍有關(guān)，提示DNMT3A多態(tài)性可以作為胃癌基因易感性的指標。Wang等[9]對吉林胃癌人群的研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A基因rs1550117位點AG或AA基因型患者比GG基因型患者具有更短的生存期及更高的死亡風險，提示rs1550117基因多態(tài)性與胃癌患者預后相關(guān)，其可能是預測胃癌患者總生存期的潛在生物標記物。Cao等[10]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A基因rs1550117位點AA基因型人群幽門螺桿菌感染風險較GG、AG基因型人群明顯增加，但未發(fā)現(xiàn)其基因多態(tài)性和萎縮性胃炎及胃癌有明顯相關(guān)性。Yang等[11]在針對廣州人群的研究未發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與胃癌相關(guān)。上述結(jié)果提示，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與胃癌的關(guān)系可能存在地域的差異性，且DNMT3A活性改變和rs1550117位點錯義突變之間的潛在關(guān)聯(lián)尚待明確。

另外，研究者們還對DNMT3A基因多態(tài)性與卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等的關(guān)系進行研究，結(jié)論差異亦較大。例如，波蘭人群DNMT3A基因包括rs1550117在內(nèi)的5個位點多態(tài)性和卵巢癌的發(fā)病、發(fā)展無明顯相關(guān)性[12]，但rs1550117多態(tài)性位點可能是避免機體患系統(tǒng)性紅斑狼瘡的原因之一[13]；Szczepańska等[14]研究未發(fā)現(xiàn)DNMT3A 基因rs1550117等5個位點多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥及子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的不孕癥有關(guān)；Sun等[15]研究未發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因rs1550117等6個位點多態(tài)性與乳腺癌有相關(guān)性；Zhao等[16]報道，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性和結(jié)直腸癌的基因易感性有關(guān)，其可能作為預測結(jié)直腸癌發(fā)病的分層指標，尤其適用于50歲以上的男性個體；Ling等[17]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A基因rs1550117位點AA基因型個體罹患遲發(fā)性阿爾茨海默病的風險是GG基因型的2.08倍，是GG+GA基因型的2.05倍，表明DNMT3A基因多態(tài)性在遲發(fā)性阿爾茨海默病的發(fā)病中發(fā)揮一定作用，可以作為預測個體對遲發(fā)性阿爾茨海默病易感性的分層標記物。上述研究結(jié)果提示，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與不同疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系不同，可能與種族的遺傳背景、飲食結(jié)構(gòu)及環(huán)境暴露等因素不同有關(guān)。

目前，國內(nèi)外關(guān)于DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與肝細胞癌的關(guān)系報道較少。本研究兩組DNMT3A基因rs1550117位點的基因型及等位基因分布頻率的差異均無統(tǒng)計學意義，提示肝細胞癌的發(fā)生與DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性無明顯相關(guān)性。但本研究樣本量較小，且受試對象來源地域單一，結(jié)果有待增加樣本量、擴大研究地域，多中心、分層研究明確。

綜上所述，DNMT3A基因rs1550117位點多態(tài)性與肝癌的發(fā)生無明顯關(guān)系。

[1] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[2] Rivière L, Ducroux A, Buendia MA. The oncogenic role of hepatitis B virus[J]. Recent Results Cancer Res, 2014(193):59-74.

[3] Ma S, Wu J, Wu J, et al. Relationship between HLA-DRB1 allele polymorphisms and familial aggregations of hepatocellular carcinoma[J]. Curr Oncol, 2016,23(1):e1-7.

[4] 房克華,常曉天.單核苷酸多態(tài)性與腫瘤遺傳易感性的研究進展[J].中華腫瘤防治雜志,2011,18(2):151-155.

[5] Kanda M, Suqimoto H, Kodera Y. Genetic and epigenetic aspects of initiation and progession of hepatocellular carcinoma[J]. World Gastroenterol, 2015,21(37):10584-10597.

[6] Yuan P, Han J, Guo G, et al. Eset partners with Oct4 to restrict extraembryonic trophoblastlineage potential in embryonic stem cells[J]. Genes Dev, 2009,23(21):2507-2520.

[7] Divne AM, Allen M. A DNA micro-array system for forensic SNP analysis[J]. Forensic Sci Int, 2005,154(2-3):111-121.

[8] Fan H, Liu D, Qiu X, et al. A functional polymorphism in the DNA methyltransferase-3A promoter modifies the susceptibility in gastric cancer but not in esophageal carcinoma[J]. BMC Med, 2010(8):12.

[9] Wang C, Jia Z, Ma H, et al. DNA methyltransferase 3a rs1550117 genetic polymorphism predicts poor survival in gastriccancer patients[J]. Int Clin Exp Pathol, 2015,8(11):14864-14874.

[10] Cao XY, Jia ZF, Cao DH, et al. DNMT3a rs1550117 polymorphism association with increased risk of Helicobacter pylori infection[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2013,14(10):5713-5718.

[11] Yang XX, He XQ, Li FX, et al. Risk-association of DNA methyltransferases polymorphisms with gastric cancer in the southern Chinese population[J]. Int J Mol Sci, 2012,13(7):8364-8378.

[12] Mostowska A, Sajdak S, Pawlik P, et al. DNMT1, DNMT3A and DNMT3B gene variants in relation to ovarian cancer risk in the Polish population[J]. Mol Biol Rep, 2013,40(8):4893-4899.

[13] Piotrowski P, Grobelna MK, Wudarski M, et al. Genetic variants of DNMT3A and systemic lupus erythematosus susceptibility[J]. Mod Rheumatol, 2015,25(1):96-99.

[14] Szczepańska M, Mostowska A, Wirstlein P, et al. Polymorphic variants of DNMT3A and the risk of endometriosis[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2013,166(1):81-85.

[15] Sun MY, Yang XX, Xu WW, et al. Association of DNMT1 and DNMT3B polymorphismswith breast cancer in Han Chinese women from South China[J]. Genet Mol Res, 2012,11(4):4330-4341.

[16] Zhao Z, Li C, Song Y, et al. Association of the DNMT3A-448A>G polymorphism withgenetic susceptibility to colorectal cancer[J]. Oncol Lett, 2012,3(2):450-454.

[17] Ling C, Fangyu D, Wanhua H, et al.DNMT3A rs1550117 polymorphism is associated with late-onset Alzheimer′s disease in Chinese population[J]. Am J Alzheimers Dis Other Demen, 2016,31(3):278-281.

楊永紅(E-mail: 754156284@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.44.026

R735.7

B

1002-266X(2016)44-0072-03

2016-03-24)