成纖維細(xì)胞13因子作用于鈉通道1.7選擇性調(diào)控?zé)嵬?/h1>
2017-01-10 08:20王兵
中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志 2017年4期
·國(guó)外醫(yī)學(xué)動(dòng)態(tài)·
成纖維細(xì)胞13因子作用于鈉通道1.7選擇性調(diào)控?zé)嵬?/p>
當(dāng)前關(guān)于傷害性熱痛的認(rèn)識(shí)主要局限于溫度感受器，如表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)（DRG）傷害性感覺(jué)神經(jīng)元上的瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道(TRPV1)。但是溫度感受器的缺失僅部分地影響熱痛，表明熱痛的產(chǎn)生和調(diào)控還存在未知機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)在小鼠DRG神經(jīng)元中條件性敲除胞漿型成纖維細(xì)胞13因子(FGF)，導(dǎo)致熱痛選擇性缺失；敲除了FGF13的DRG神經(jīng)元，傷害性熱刺激不能誘發(fā)動(dòng)作電位的持續(xù)發(fā)放；FGF13與鈉通道(Nav) 1.7作用可以促進(jìn)熱痛的傳導(dǎo)，增強(qiáng)傷害性熱刺激誘發(fā)的Nav1.7電流并維持Nav1.7上膜過(guò)程，進(jìn)而維持動(dòng)作電位的持續(xù)發(fā)放。打破FGF13 和Nav1.7相互作用抑制了熱刺激誘發(fā)的動(dòng)作電位和痛反射行為。因此，不同于溫度感受器，F(xiàn)GF13 和Nav1.7的相互作用對(duì)于維持熱痛信號(hào)的產(chǎn)生和傳遞是至關(guān)重要的。
研究背景
FGF分為外泌型和胞漿型，外泌型FGF在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但對(duì)胞漿型FGF功能的研究卻很少。FGF13是表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)中的胞漿型因子，在發(fā)育過(guò)程中的腦皮質(zhì)神經(jīng)元上有瞬時(shí)表達(dá)；在從發(fā)育早期到成年DRG中，F(xiàn)GF13一直高水平表達(dá)，其主要有兩個(gè)剪接體亞型，F(xiàn)GF13A具有核定位信號(hào)而入核，而FGF13B只分布在細(xì)胞漿中。
傷害性（疼痛）信號(hào)的傳導(dǎo)需要有相應(yīng)的膜蛋白參與，如當(dāng)溫度高于42℃時(shí)，DRG小神經(jīng)元上表達(dá)的TRPV1就發(fā)揮著溫度感受器的作用。但是，即便是TRPV1基因敲除鼠，當(dāng)給予高于52℃的強(qiáng)熱刺激時(shí)，痛反應(yīng)也只表現(xiàn)出部分減弱；當(dāng)刺激溫度低于48℃時(shí)，痛反應(yīng)則表現(xiàn)正常。表明還存在其他沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)的熱痛感受機(jī)制。
疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)也需要電壓門控鈉通道(Nav)的參與，Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9都表達(dá)在DRG神經(jīng)元中，其中河豚毒素敏感型（TTX-S）Nav1.7通道對(duì)痛覺(jué)的產(chǎn)生和傳遞尤為重要。臨床上發(fā)現(xiàn)， 功能增強(qiáng)型Nav1. 7基因突變導(dǎo)致嚴(yán)重的熱痛敏，功能喪失型Nav1.7基因突變導(dǎo)致完全感受不到疼痛。全身敲除Nav1.7減弱了完全弗氏佐劑（CFA）誘發(fā)的小鼠熱痛敏；在DRG神經(jīng)元中條件性敲除Nav1.7后，急性痛、炎性痛和燒燙傷引起的熱痛敏受到了影響。有研究認(rèn)為胞漿型FGF可以與Nav通道相互作用并調(diào)節(jié)鈉通道的開關(guān)及其電流強(qiáng)度，但表達(dá)在DRG小神經(jīng)元上的FGF13在軀體感覺(jué)中的功能卻不清楚。
在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)條件性敲除DRG神經(jīng)元中的FGF13導(dǎo)致熱痛的選擇性缺失并降低了熱刺激誘發(fā)的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放強(qiáng)度；還發(fā)現(xiàn)FGF13與Nav1.7相互作用，熱刺激增強(qiáng)了二者的相互作用和Nav1.7在膜上的停留時(shí)間，并增強(qiáng)了熱刺激所誘發(fā)的動(dòng)作電位發(fā)放。打破二者的相互作用，會(huì)減少熱刺激所誘發(fā)的動(dòng)作電位并抑制痛反應(yīng)。
主要研究結(jié)果
1. FGF13表達(dá)在機(jī)械/熱傷害性神經(jīng)元中
在成年小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)GF13在DRG中高表達(dá)，主要表達(dá)在小神經(jīng)元上，在肽類和非肽類神經(jīng)元上都有表達(dá)；在脊髓背角的I層和II層、來(lái)自DRG的傳入神經(jīng)纖維上也有FGF13表達(dá)，同時(shí)在坐骨神經(jīng)上和皮膚無(wú)毛區(qū)的傳出纖維中也發(fā)現(xiàn)有FGF13表達(dá)。
2. FGF13缺失可以選擇性地消除熱痛
在Nav1.8基因啟動(dòng)的SNS-cre條件性敲除FGF13（CKO）的小鼠，DRG神經(jīng)元、脊髓背角中的傳入纖維和皮膚傳出纖維上表達(dá)的FGF13均顯著減少；而DRG神經(jīng)元的總數(shù)和形態(tài)以及它們向中樞投射的神經(jīng)纖維、脊髓背角中突觸的結(jié)構(gòu)甚或皮膚中的神經(jīng)纖維都沒(méi)有明顯變化；從DRG到脊髓神經(jīng)元的突觸傳遞也是正常的。
但是CKO鼠的熱痛反射行為消失了，而對(duì)于非傷害性溫度刺激和傷害性機(jī)械刺激的反射卻不受影響。CKO鼠在甩尾實(shí)驗(yàn)、熱輻射實(shí)驗(yàn)和熱板實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有表現(xiàn)出痛反應(yīng)；在CFA誘發(fā)的慢性炎性痛模型中，表現(xiàn)對(duì)傷害性熱刺激不敏感；但是對(duì)CFA模型或SNI（坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷）模型誘發(fā)的機(jī)械痛敏卻無(wú)影響。對(duì)冷痛刺激的反應(yīng)也正常，溫度選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CKO鼠依然具有能夠分辨不同的溫度的能力；只是它們對(duì)熱痛的耐受能力有所增強(qiáng)。福爾馬林實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CKO鼠也具有雙相的痛反應(yīng)，只是II相峰出現(xiàn)延后而峰高沒(méi)有變化，表明其化學(xué)痛只受到了輕微的影響。此外，CKO鼠的運(yùn)動(dòng)功能和自主活動(dòng)功能都表現(xiàn)正常。Nav1.8和TRPV1蛋白在CKO鼠的DRG中明顯升高，表明存在著相關(guān)功能基因的代償現(xiàn)象。電生理記錄發(fā)現(xiàn)CKO鼠的DRG中對(duì)辣椒素敏感的小神經(jīng)元比例以及辣椒素誘導(dǎo)電流的幅度有所增高。以上結(jié)果表明，盡管CKO鼠存在一定的TRPV1代償性增強(qiáng)，其仍然表現(xiàn)出熱痛的選擇性缺失。
3. 腦功能磁共振成像（fMRI）顯示CKO鼠對(duì)熱痛誘發(fā)的腦活動(dòng)消失
fMRI研究發(fā)現(xiàn)在FGF13未敲除鼠的對(duì)側(cè)腦區(qū)存在強(qiáng)烈激活信號(hào)，如軀體感覺(jué)S1和S2區(qū)、Retrosplenial granular (RSG)和島葉皮質(zhì)、杏仁核(Amygdala)、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)，紋狀體（尾狀核和殼核）、海馬的CA1區(qū)、丘腦的內(nèi)側(cè)背核以及束旁核等，而CKO鼠的以上大部分腦區(qū)的痛反射消失。
FGF13未敲除鼠顯示對(duì)側(cè)S1區(qū)參與疼痛反射，其他腦區(qū)如Amygdala、S2區(qū)、紋狀體、海馬和島葉等則顯示出雙側(cè)腦區(qū)同等程度激活；而CKO鼠的以上腦區(qū)的激活都減弱。FGF13缺失對(duì)Amygdala的影響最大，然后依次是紋狀體、島葉、S2區(qū)和RSG，對(duì)S1區(qū)皮層的影響最小。
4. FGF13敲除的DRG神經(jīng)元對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生的動(dòng)作電位發(fā)放減少
電生理記錄發(fā)現(xiàn)，CKO鼠與FGF13未敲除鼠對(duì)傷害性熱刺激敏感的DRG神經(jīng)元數(shù)量相近；在未敲除鼠的小神經(jīng)元，動(dòng)作電位發(fā)放速率在42℃時(shí)開始加速，在43℃時(shí)達(dá)到最大，并保持在該水平至45℃；CKO鼠小神經(jīng)元的電發(fā)放在溫度升高時(shí)逐漸降低，在45℃時(shí)趨于停止。在未敲除鼠神經(jīng)元中，動(dòng)作電位遵循“全或無(wú)”規(guī)則、振幅相對(duì)均勻統(tǒng)一；而在CKO鼠神經(jīng)元中，動(dòng)作電位振幅隨著溫度的升高呈現(xiàn)出快速降低。表明雖然CKO的DRG小神經(jīng)元能夠感受到低于42℃的熱刺激，但其對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力受損。
對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，在TRPV1基因敲除鼠盡管一半以上DRG神經(jīng)元喪失了對(duì)熱刺激的反應(yīng)能力，但仍然有相當(dāng)多數(shù)的神經(jīng)元保持著完整的對(duì)熱刺激的敏感性，而FGF13敲除鼠對(duì)傷害性熱刺激依舊敏感的DRG神經(jīng)元沒(méi)有減少，只是刺激溫度增加到傷害性水平時(shí)，其動(dòng)作電位幅度變小，表明FGF13和TRPV1 通過(guò)不同的分子機(jī)制參與熱痛的調(diào)控。
5. 給予外源性FGF13可以逆轉(zhuǎn)CKO鼠的熱痛缺失
用表達(dá)FGF13B的融合蛋白孵育CKO鼠的DRG神經(jīng)元，可以逆轉(zhuǎn)其對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生的電發(fā)放降低，并改善45℃時(shí)的動(dòng)作電位振幅，表明DRG小神經(jīng)元要保持對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生持續(xù)電發(fā)放的能力，F(xiàn)GF13是必須的。
野生鼠鞘內(nèi)注射FGF13B-TAT融合蛋白后，發(fā)現(xiàn)DRG和脊髓背角中融合蛋白的峰值位于注射后20～60分鐘之間。當(dāng)CKO鼠鞘內(nèi)注射融合蛋白時(shí)，在一段時(shí)間內(nèi)可以逆轉(zhuǎn)CKO鼠的熱痛缺失。鞘內(nèi)注射后在DRG和后爪的足底皮膚中都可以檢測(cè)到該融合蛋白。以上結(jié)果表明，無(wú)論是CKO造成DRG小神經(jīng)元的電發(fā)放降低還是在體的熱痛缺失都可以通過(guò)給予外源性FGF13而逆轉(zhuǎn)。
6. FGF13直接作用于Nav1.7蛋白
FGF13和Nav1.7的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF13與Nav1.7相互作用強(qiáng)，與Nav1.6相互作用相對(duì)弱。與Nav1.7最強(qiáng)的相互作用出現(xiàn)在FGF13B-TAT融合蛋白注射后的20～60分鐘內(nèi)，這與在CKO鼠鞘內(nèi)給藥進(jìn)而逆轉(zhuǎn)熱痛缺失的最佳效應(yīng)時(shí)間相一致；而FGF13幾乎不與Nav1.8或Nav1.9發(fā)生作用；沒(méi)有檢測(cè)到FGF13與TRPV1或TRPV2之間存在明顯的相互作用。分子水平研究發(fā)現(xiàn)FGF13和Nav1.7羧基端存在直接的相互作用，Nav1.7羧基端的1,876-1,896位氨基酸是FGF13的主要結(jié)合位點(diǎn)；對(duì)于FGF13，似乎不存在與Nav1.7羧基端相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，因?yàn)橹挥腥L(zhǎng)的FGF13才能結(jié)合Nav1.7羧基端。
7. FGF13增加了Nav1.7電流密度
把表達(dá)Nav1.7和表達(dá)FGF13B的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FGF13B增加了Nav1.7電流密度，沒(méi)有形成明顯電壓依賴性的Nav1.7激活偏移；Nav1.7的電壓依賴性失活也沒(méi)有發(fā)生變化。在CKO鼠的DRG小神經(jīng)元，F(xiàn)GF13缺失可以使TTX-S鈉電流減小而不影響電壓依賴的Nav通道激活或失活。表明FGF13增加了Nav1.7電流密度，而不影響其激活和失活的電生理特性。
8. 溫度刺激強(qiáng)化了FGF13和 Nav1.7的相互作用，并維持了Nav1.7的上膜
將培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元用熱水浴處理后立即放冰上冷卻，瞬時(shí)維持Nav1.7在神經(jīng)元膜上，發(fā)現(xiàn)FGF13未敲除神經(jīng)元膜上的Nav1.7水平在熱處理后沒(méi)有發(fā)生變化，而CKO神經(jīng)元膜上的Nav1.7水平卻是降低的。在沒(méi)有熱刺激的時(shí)候，敲除FGF13不影響Nav1.7的上膜；在FGF13缺失的情況下，傷害性熱刺激誘發(fā)DRG神經(jīng)元Nav1.7上膜減少，表明維持一定數(shù)量的Nav1.7上膜的需要FGF13的存在。
9. 打破FGF13和Nav1.7相互作用可以減輕熱痛
可透膜的Nav1.7CT-TAT融合蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)性肽可以競(jìng)爭(zhēng)性阻斷內(nèi)源性FGF13和Nav1.7的相互作用。在培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中，Nav1.7CT-TAT能夠競(jìng)爭(zhēng)性阻斷DRG神經(jīng)元中的內(nèi)源性FGF13和Nav1.7的相互作用。
在甩尾實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射Nav1.7CT-TAT呈劑量依賴性地延長(zhǎng)了甩尾潛伏期，此效應(yīng)在最后一次注射后的4～6小時(shí)達(dá)到高峰；注射后，小鼠脊髓背角傳入纖維中的內(nèi)源性FGF13和Nav1.7相互作用明顯減少，但DRG中的未見(jiàn)減少，可能是由于DRG表達(dá)大量的FGF13和Nav1.7競(jìng)爭(zhēng)性抑制了Nav1.7CT-TAT的作用。
討論
1. FGF13/Nav1.7復(fù)合物對(duì)于維持熱痛功能是必要的
本研究表明，CKO鼠選擇性喪失了對(duì)熱痛的反射能力，但保留對(duì)其他模式刺激如非傷害性溫度刺激和傷害性機(jī)械刺激的痛反應(yīng)功能。FGF13缺陷可以迅速終止DRG小神經(jīng)元對(duì)溫度高于43℃的熱刺激誘發(fā)的電發(fā)放，表明熱痛的傳遞是選擇性需要FGF13存在的。
TRPV1主要功能在于參與炎癥引起的熱痛敏和部分高溫（＞ 52℃）的熱痛敏，即使CKO鼠DRG神經(jīng)元中TRPV1有代償性增加，熱痛仍然缺失；CKO鼠的DRG熱敏神經(jīng)元數(shù)量并沒(méi)有減少，但是刺激溫度達(dá)到引起熱痛水平時(shí)，動(dòng)作電位不能持續(xù)發(fā)放，表明FGF13在熱痛中的作用與TRPV1不同。溫度感受器在啟動(dòng)動(dòng)作電位后，F(xiàn)GF13/Nav1.7復(fù)合體在傷害性溫度刺激期間用來(lái)維持電發(fā)放，即充當(dāng)保持持續(xù)電發(fā)放能力的助推器。低劑量的外源性FGF13足以補(bǔ)救CKO鼠DRG神經(jīng)元的電發(fā)放受損和熱痛缺失，表明這種機(jī)制是非常高效的。
2. 熱刺激強(qiáng)化了FGF13和Nav1.7相互作用是Nav1.7參與熱痛調(diào)控的選擇機(jī)制之一
Nav1.7對(duì)于熱痛和機(jī)械痛都很重要，Nav1.7的功能獲得性突變導(dǎo)致病人嚴(yán)重的熱痛敏，而失能性突變又導(dǎo)致完全無(wú)痛。Nav1.7缺失會(huì)導(dǎo)小鼠致急性痛、炎癥或燒傷引起的熱痛敏減輕，Nav1.7還參與了小鼠的機(jī)械痛。在所有參與痛覺(jué)調(diào)控的鈉通道中，Nav1.7是最重要的。
但小鼠缺乏Nav1.7只表現(xiàn)為部分熱痛喪失，與人類的完全不痛表現(xiàn)不同， 這種差異可能是由于小鼠的其他鈉通道的適應(yīng)性代償而導(dǎo)致的。CKO鼠熱痛的缺失比Nav1.7基因敲除鼠以及Nav1.7和Nav1.8雙基因敲除鼠的熱痛缺失更嚴(yán)重，表明FGF13的功能是不能被代償?shù)?。盡管Nav1.7本身不具有感覺(jué)模式的特異性或選擇性，但CKO鼠的熱痛缺失而機(jī)械痛正常，表明熱刺激促進(jìn)的FGF13和Nav1.7相互作用可能是神經(jīng)感受熱痛的選擇性機(jī)制。
3. 發(fā)現(xiàn)了傷害性熱刺激特異性激活的腦區(qū)
疼痛是一種涉及感覺(jué)和情緒變化的復(fù)雜體驗(yàn)，在已經(jīng)被證明了介導(dǎo)傷害性信息的感覺(jué)辨別和情感動(dòng)機(jī)方面的區(qū)域，例如丘腦的內(nèi)側(cè)背核和束旁核以及S1區(qū)、S2區(qū)和島狀皮質(zhì)等，CKO鼠的fMRI信號(hào)減弱；CKO鼠的fMRI信號(hào)在Amygdala、海馬、尾狀核、和RSG等區(qū)域降低，直接證明了邊緣系統(tǒng)和涉及記憶以及情緒反應(yīng)的腦區(qū)也參與熱痛信息的處理過(guò)程。對(duì)傷害性熱刺激反應(yīng)的弱化在不同的腦區(qū)是不同的，表明FGF13缺陷DRG神經(jīng)元產(chǎn)生的痛覺(jué)信號(hào)是通過(guò)不同的上行傳導(dǎo)通路上傳到不同的腦區(qū)；痛反應(yīng)信號(hào)在調(diào)控痛覺(jué)下行通路的關(guān)鍵區(qū)域PAG也是減弱的。
4. FGF13在病理感覺(jué)障礙中的潛在作用
CKO鼠對(duì)來(lái)自外周組織炎癥誘導(dǎo)的熱痛敏是缺失的，可能與Nav1.7的在膜上停留時(shí)間有關(guān)。由于DRG神經(jīng)元中FGF13和Nav1.7在外周神經(jīng)損傷后表達(dá)降低，所以我們推測(cè)FGF13可能主要參與炎性痛、而不參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控。根據(jù)我們的研究結(jié)果，F(xiàn)GF13基因突變的病人可能對(duì)熱痛刺激不敏感。因此，測(cè)試這些病人的軀體感覺(jué)功能將幫助我們理解和認(rèn)識(shí)這些疾病及其病理機(jī)制，可能讓醫(yī)生盡早應(yīng)對(duì)來(lái)保護(hù)病人免受潛在危害。
(Yang L,et al. Neuron, 2017, 22: 806 ～ 821. 王 兵 譯 劉興君 校）
編者按：科學(xué)家們一直試圖發(fā)現(xiàn)特異性調(diào)控某種痛覺(jué)的某一類神經(jīng)元（包括初級(jí)傷害性感覺(jué)神經(jīng)元和脊髓的中間神經(jīng)元或投射神經(jīng)元）或某一特定分子，并期望這樣的神經(jīng)元或分子是存在的。但從節(jié)省能量的角度來(lái)看，多模式（Polymodel）神經(jīng)元或分子更符合進(jìn)化論原則。中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所的張旭院士團(tuán)隊(duì)近期的研究成果卻開啟了一個(gè)新思路，有這樣一類分子如胞漿型FGF13，通過(guò)調(diào)節(jié)多模式分子如Nav1.7，進(jìn)而調(diào)控某一特定的痛覺(jué)如熱痛。就像細(xì)胞內(nèi)某一信號(hào)通路，位于信號(hào)中間的分子總是被激活的（如磷酸化），但導(dǎo)致下游的生物學(xué)效應(yīng)在不同的細(xì)胞、甚或不同的條件下可能是完全不同，這取決于最上游的信號(hào)是來(lái)自于哪一種受體或通道分子，取決于它的開關(guān)允許什么樣的信號(hào)進(jìn)入。是的，確實(shí)存在這樣的開關(guān)分子，那是否還有調(diào)節(jié)機(jī)械痛的開關(guān)分子呢？我們拭目以待！
10.3969/j.issn.1006-9852.2017.04.002
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當(dāng)前關(guān)于傷害性熱痛的認(rèn)識(shí)主要局限于溫度感受器，如表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)（DRG）傷害性感覺(jué)神經(jīng)元上的瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道(TRPV1)。但是溫度感受器的缺失僅部分地影響熱痛，表明熱痛的產(chǎn)生和調(diào)控還存在未知機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)在小鼠DRG神經(jīng)元中條件性敲除胞漿型成纖維細(xì)胞13因子(FGF)，導(dǎo)致熱痛選擇性缺失；敲除了FGF13的DRG神經(jīng)元，傷害性熱刺激不能誘發(fā)動(dòng)作電位的持續(xù)發(fā)放；FGF13與鈉通道(Nav) 1.7作用可以促進(jìn)熱痛的傳導(dǎo)，增強(qiáng)傷害性熱刺激誘發(fā)的Nav1.7電流并維持Nav1.7上膜過(guò)程，進(jìn)而維持動(dòng)作電位的持續(xù)發(fā)放。打破FGF13 和Nav1.7相互作用抑制了熱刺激誘發(fā)的動(dòng)作電位和痛反射行為。因此，不同于溫度感受器，F(xiàn)GF13 和Nav1.7的相互作用對(duì)于維持熱痛信號(hào)的產(chǎn)生和傳遞是至關(guān)重要的。
研究背景
FGF分為外泌型和胞漿型，外泌型FGF在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但對(duì)胞漿型FGF功能的研究卻很少。FGF13是表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)中的胞漿型因子，在發(fā)育過(guò)程中的腦皮質(zhì)神經(jīng)元上有瞬時(shí)表達(dá)；在從發(fā)育早期到成年DRG中，F(xiàn)GF13一直高水平表達(dá)，其主要有兩個(gè)剪接體亞型，F(xiàn)GF13A具有核定位信號(hào)而入核，而FGF13B只分布在細(xì)胞漿中。
傷害性（疼痛）信號(hào)的傳導(dǎo)需要有相應(yīng)的膜蛋白參與，如當(dāng)溫度高于42℃時(shí)，DRG小神經(jīng)元上表達(dá)的TRPV1就發(fā)揮著溫度感受器的作用。但是，即便是TRPV1基因敲除鼠，當(dāng)給予高于52℃的強(qiáng)熱刺激時(shí)，痛反應(yīng)也只表現(xiàn)出部分減弱；當(dāng)刺激溫度低于48℃時(shí)，痛反應(yīng)則表現(xiàn)正常。表明還存在其他沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)的熱痛感受機(jī)制。
疼痛信號(hào)的傳導(dǎo)也需要電壓門控鈉通道(Nav)的參與，Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9都表達(dá)在DRG神經(jīng)元中，其中河豚毒素敏感型（TTX-S）Nav1.7通道對(duì)痛覺(jué)的產(chǎn)生和傳遞尤為重要。臨床上發(fā)現(xiàn)， 功能增強(qiáng)型Nav1. 7基因突變導(dǎo)致嚴(yán)重的熱痛敏，功能喪失型Nav1.7基因突變導(dǎo)致完全感受不到疼痛。全身敲除Nav1.7減弱了完全弗氏佐劑（CFA）誘發(fā)的小鼠熱痛敏；在DRG神經(jīng)元中條件性敲除Nav1.7后，急性痛、炎性痛和燒燙傷引起的熱痛敏受到了影響。有研究認(rèn)為胞漿型FGF可以與Nav通道相互作用并調(diào)節(jié)鈉通道的開關(guān)及其電流強(qiáng)度，但表達(dá)在DRG小神經(jīng)元上的FGF13在軀體感覺(jué)中的功能卻不清楚。
在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)條件性敲除DRG神經(jīng)元中的FGF13導(dǎo)致熱痛的選擇性缺失并降低了熱刺激誘發(fā)的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放強(qiáng)度；還發(fā)現(xiàn)FGF13與Nav1.7相互作用，熱刺激增強(qiáng)了二者的相互作用和Nav1.7在膜上的停留時(shí)間，并增強(qiáng)了熱刺激所誘發(fā)的動(dòng)作電位發(fā)放。打破二者的相互作用，會(huì)減少熱刺激所誘發(fā)的動(dòng)作電位并抑制痛反應(yīng)。
主要研究結(jié)果
1. FGF13表達(dá)在機(jī)械/熱傷害性神經(jīng)元中
在成年小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中，F(xiàn)GF13在DRG中高表達(dá)，主要表達(dá)在小神經(jīng)元上，在肽類和非肽類神經(jīng)元上都有表達(dá)；在脊髓背角的I層和II層、來(lái)自DRG的傳入神經(jīng)纖維上也有FGF13表達(dá)，同時(shí)在坐骨神經(jīng)上和皮膚無(wú)毛區(qū)的傳出纖維中也發(fā)現(xiàn)有FGF13表達(dá)。
2. FGF13缺失可以選擇性地消除熱痛
在Nav1.8基因啟動(dòng)的SNS-cre條件性敲除FGF13（CKO）的小鼠，DRG神經(jīng)元、脊髓背角中的傳入纖維和皮膚傳出纖維上表達(dá)的FGF13均顯著減少；而DRG神經(jīng)元的總數(shù)和形態(tài)以及它們向中樞投射的神經(jīng)纖維、脊髓背角中突觸的結(jié)構(gòu)甚或皮膚中的神經(jīng)纖維都沒(méi)有明顯變化；從DRG到脊髓神經(jīng)元的突觸傳遞也是正常的。
但是CKO鼠的熱痛反射行為消失了，而對(duì)于非傷害性溫度刺激和傷害性機(jī)械刺激的反射卻不受影響。CKO鼠在甩尾實(shí)驗(yàn)、熱輻射實(shí)驗(yàn)和熱板實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有表現(xiàn)出痛反應(yīng)；在CFA誘發(fā)的慢性炎性痛模型中，表現(xiàn)對(duì)傷害性熱刺激不敏感；但是對(duì)CFA模型或SNI（坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷）模型誘發(fā)的機(jī)械痛敏卻無(wú)影響。對(duì)冷痛刺激的反應(yīng)也正常，溫度選擇實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CKO鼠依然具有能夠分辨不同的溫度的能力；只是它們對(duì)熱痛的耐受能力有所增強(qiáng)。福爾馬林實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CKO鼠也具有雙相的痛反應(yīng)，只是II相峰出現(xiàn)延后而峰高沒(méi)有變化，表明其化學(xué)痛只受到了輕微的影響。此外，CKO鼠的運(yùn)動(dòng)功能和自主活動(dòng)功能都表現(xiàn)正常。Nav1.8和TRPV1蛋白在CKO鼠的DRG中明顯升高，表明存在著相關(guān)功能基因的代償現(xiàn)象。電生理記錄發(fā)現(xiàn)CKO鼠的DRG中對(duì)辣椒素敏感的小神經(jīng)元比例以及辣椒素誘導(dǎo)電流的幅度有所增高。以上結(jié)果表明，盡管CKO鼠存在一定的TRPV1代償性增強(qiáng)，其仍然表現(xiàn)出熱痛的選擇性缺失。
3. 腦功能磁共振成像（fMRI）顯示CKO鼠對(duì)熱痛誘發(fā)的腦活動(dòng)消失
fMRI研究發(fā)現(xiàn)在FGF13未敲除鼠的對(duì)側(cè)腦區(qū)存在強(qiáng)烈激活信號(hào)，如軀體感覺(jué)S1和S2區(qū)、Retrosplenial granular (RSG)和島葉皮質(zhì)、杏仁核(Amygdala)、導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)，紋狀體（尾狀核和殼核）、海馬的CA1區(qū)、丘腦的內(nèi)側(cè)背核以及束旁核等，而CKO鼠的以上大部分腦區(qū)的痛反射消失。
FGF13未敲除鼠顯示對(duì)側(cè)S1區(qū)參與疼痛反射，其他腦區(qū)如Amygdala、S2區(qū)、紋狀體、海馬和島葉等則顯示出雙側(cè)腦區(qū)同等程度激活；而CKO鼠的以上腦區(qū)的激活都減弱。FGF13缺失對(duì)Amygdala的影響最大，然后依次是紋狀體、島葉、S2區(qū)和RSG，對(duì)S1區(qū)皮層的影響最小。
4. FGF13敲除的DRG神經(jīng)元對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生的動(dòng)作電位發(fā)放減少
電生理記錄發(fā)現(xiàn)，CKO鼠與FGF13未敲除鼠對(duì)傷害性熱刺激敏感的DRG神經(jīng)元數(shù)量相近；在未敲除鼠的小神經(jīng)元，動(dòng)作電位發(fā)放速率在42℃時(shí)開始加速，在43℃時(shí)達(dá)到最大，并保持在該水平至45℃；CKO鼠小神經(jīng)元的電發(fā)放在溫度升高時(shí)逐漸降低，在45℃時(shí)趨于停止。在未敲除鼠神經(jīng)元中，動(dòng)作電位遵循“全或無(wú)”規(guī)則、振幅相對(duì)均勻統(tǒng)一；而在CKO鼠神經(jīng)元中，動(dòng)作電位振幅隨著溫度的升高呈現(xiàn)出快速降低。表明雖然CKO的DRG小神經(jīng)元能夠感受到低于42℃的熱刺激，但其對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位的能力受損。
對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，在TRPV1基因敲除鼠盡管一半以上DRG神經(jīng)元喪失了對(duì)熱刺激的反應(yīng)能力，但仍然有相當(dāng)多數(shù)的神經(jīng)元保持著完整的對(duì)熱刺激的敏感性，而FGF13敲除鼠對(duì)傷害性熱刺激依舊敏感的DRG神經(jīng)元沒(méi)有減少，只是刺激溫度增加到傷害性水平時(shí)，其動(dòng)作電位幅度變小，表明FGF13和TRPV1 通過(guò)不同的分子機(jī)制參與熱痛的調(diào)控。
5. 給予外源性FGF13可以逆轉(zhuǎn)CKO鼠的熱痛缺失
用表達(dá)FGF13B的融合蛋白孵育CKO鼠的DRG神經(jīng)元，可以逆轉(zhuǎn)其對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生的電發(fā)放降低，并改善45℃時(shí)的動(dòng)作電位振幅，表明DRG小神經(jīng)元要保持對(duì)傷害性熱刺激產(chǎn)生持續(xù)電發(fā)放的能力，F(xiàn)GF13是必須的。
野生鼠鞘內(nèi)注射FGF13B-TAT融合蛋白后，發(fā)現(xiàn)DRG和脊髓背角中融合蛋白的峰值位于注射后20～60分鐘之間。當(dāng)CKO鼠鞘內(nèi)注射融合蛋白時(shí)，在一段時(shí)間內(nèi)可以逆轉(zhuǎn)CKO鼠的熱痛缺失。鞘內(nèi)注射后在DRG和后爪的足底皮膚中都可以檢測(cè)到該融合蛋白。以上結(jié)果表明，無(wú)論是CKO造成DRG小神經(jīng)元的電發(fā)放降低還是在體的熱痛缺失都可以通過(guò)給予外源性FGF13而逆轉(zhuǎn)。
6. FGF13直接作用于Nav1.7蛋白
FGF13和Nav1.7的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF13與Nav1.7相互作用強(qiáng)，與Nav1.6相互作用相對(duì)弱。與Nav1.7最強(qiáng)的相互作用出現(xiàn)在FGF13B-TAT融合蛋白注射后的20～60分鐘內(nèi)，這與在CKO鼠鞘內(nèi)給藥進(jìn)而逆轉(zhuǎn)熱痛缺失的最佳效應(yīng)時(shí)間相一致；而FGF13幾乎不與Nav1.8或Nav1.9發(fā)生作用；沒(méi)有檢測(cè)到FGF13與TRPV1或TRPV2之間存在明顯的相互作用。分子水平研究發(fā)現(xiàn)FGF13和Nav1.7羧基端存在直接的相互作用，Nav1.7羧基端的1,876-1,896位氨基酸是FGF13的主要結(jié)合位點(diǎn)；對(duì)于FGF13，似乎不存在與Nav1.7羧基端相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，因?yàn)橹挥腥L(zhǎng)的FGF13才能結(jié)合Nav1.7羧基端。
7. FGF13增加了Nav1.7電流密度
把表達(dá)Nav1.7和表達(dá)FGF13B的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FGF13B增加了Nav1.7電流密度，沒(méi)有形成明顯電壓依賴性的Nav1.7激活偏移；Nav1.7的電壓依賴性失活也沒(méi)有發(fā)生變化。在CKO鼠的DRG小神經(jīng)元，F(xiàn)GF13缺失可以使TTX-S鈉電流減小而不影響電壓依賴的Nav通道激活或失活。表明FGF13增加了Nav1.7電流密度，而不影響其激活和失活的電生理特性。
8. 溫度刺激強(qiáng)化了FGF13和 Nav1.7的相互作用，并維持了Nav1.7的上膜
將培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元用熱水浴處理后立即放冰上冷卻，瞬時(shí)維持Nav1.7在神經(jīng)元膜上，發(fā)現(xiàn)FGF13未敲除神經(jīng)元膜上的Nav1.7水平在熱處理后沒(méi)有發(fā)生變化，而CKO神經(jīng)元膜上的Nav1.7水平卻是降低的。在沒(méi)有熱刺激的時(shí)候，敲除FGF13不影響Nav1.7的上膜；在FGF13缺失的情況下，傷害性熱刺激誘發(fā)DRG神經(jīng)元Nav1.7上膜減少，表明維持一定數(shù)量的Nav1.7上膜的需要FGF13的存在。
9. 打破FGF13和Nav1.7相互作用可以減輕熱痛
可透膜的Nav1.7CT-TAT融合蛋白作為競(jìng)爭(zhēng)性肽可以競(jìng)爭(zhēng)性阻斷內(nèi)源性FGF13和Nav1.7的相互作用。在培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元中，Nav1.7CT-TAT能夠競(jìng)爭(zhēng)性阻斷DRG神經(jīng)元中的內(nèi)源性FGF13和Nav1.7的相互作用。
在甩尾實(shí)驗(yàn)中，腹腔注射Nav1.7CT-TAT呈劑量依賴性地延長(zhǎng)了甩尾潛伏期，此效應(yīng)在最后一次注射后的4～6小時(shí)達(dá)到高峰；注射后，小鼠脊髓背角傳入纖維中的內(nèi)源性FGF13和Nav1.7相互作用明顯減少，但DRG中的未見(jiàn)減少，可能是由于DRG表達(dá)大量的FGF13和Nav1.7競(jìng)爭(zhēng)性抑制了Nav1.7CT-TAT的作用。
討論
1. FGF13/Nav1.7復(fù)合物對(duì)于維持熱痛功能是必要的
本研究表明，CKO鼠選擇性喪失了對(duì)熱痛的反射能力，但保留對(duì)其他模式刺激如非傷害性溫度刺激和傷害性機(jī)械刺激的痛反應(yīng)功能。FGF13缺陷可以迅速終止DRG小神經(jīng)元對(duì)溫度高于43℃的熱刺激誘發(fā)的電發(fā)放，表明熱痛的傳遞是選擇性需要FGF13存在的。
TRPV1主要功能在于參與炎癥引起的熱痛敏和部分高溫（＞ 52℃）的熱痛敏，即使CKO鼠DRG神經(jīng)元中TRPV1有代償性增加，熱痛仍然缺失；CKO鼠的DRG熱敏神經(jīng)元數(shù)量并沒(méi)有減少，但是刺激溫度達(dá)到引起熱痛水平時(shí)，動(dòng)作電位不能持續(xù)發(fā)放，表明FGF13在熱痛中的作用與TRPV1不同。溫度感受器在啟動(dòng)動(dòng)作電位后，F(xiàn)GF13/Nav1.7復(fù)合體在傷害性溫度刺激期間用來(lái)維持電發(fā)放，即充當(dāng)保持持續(xù)電發(fā)放能力的助推器。低劑量的外源性FGF13足以補(bǔ)救CKO鼠DRG神經(jīng)元的電發(fā)放受損和熱痛缺失，表明這種機(jī)制是非常高效的。
2. 熱刺激強(qiáng)化了FGF13和Nav1.7相互作用是Nav1.7參與熱痛調(diào)控的選擇機(jī)制之一
Nav1.7對(duì)于熱痛和機(jī)械痛都很重要，Nav1.7的功能獲得性突變導(dǎo)致病人嚴(yán)重的熱痛敏，而失能性突變又導(dǎo)致完全無(wú)痛。Nav1.7缺失會(huì)導(dǎo)小鼠致急性痛、炎癥或燒傷引起的熱痛敏減輕，Nav1.7還參與了小鼠的機(jī)械痛。在所有參與痛覺(jué)調(diào)控的鈉通道中，Nav1.7是最重要的。
但小鼠缺乏Nav1.7只表現(xiàn)為部分熱痛喪失，與人類的完全不痛表現(xiàn)不同， 這種差異可能是由于小鼠的其他鈉通道的適應(yīng)性代償而導(dǎo)致的。CKO鼠熱痛的缺失比Nav1.7基因敲除鼠以及Nav1.7和Nav1.8雙基因敲除鼠的熱痛缺失更嚴(yán)重，表明FGF13的功能是不能被代償?shù)?。盡管Nav1.7本身不具有感覺(jué)模式的特異性或選擇性，但CKO鼠的熱痛缺失而機(jī)械痛正常，表明熱刺激促進(jìn)的FGF13和Nav1.7相互作用可能是神經(jīng)感受熱痛的選擇性機(jī)制。
3. 發(fā)現(xiàn)了傷害性熱刺激特異性激活的腦區(qū)
疼痛是一種涉及感覺(jué)和情緒變化的復(fù)雜體驗(yàn)，在已經(jīng)被證明了介導(dǎo)傷害性信息的感覺(jué)辨別和情感動(dòng)機(jī)方面的區(qū)域，例如丘腦的內(nèi)側(cè)背核和束旁核以及S1區(qū)、S2區(qū)和島狀皮質(zhì)等，CKO鼠的fMRI信號(hào)減弱；CKO鼠的fMRI信號(hào)在Amygdala、海馬、尾狀核、和RSG等區(qū)域降低，直接證明了邊緣系統(tǒng)和涉及記憶以及情緒反應(yīng)的腦區(qū)也參與熱痛信息的處理過(guò)程。對(duì)傷害性熱刺激反應(yīng)的弱化在不同的腦區(qū)是不同的，表明FGF13缺陷DRG神經(jīng)元產(chǎn)生的痛覺(jué)信號(hào)是通過(guò)不同的上行傳導(dǎo)通路上傳到不同的腦區(qū)；痛反應(yīng)信號(hào)在調(diào)控痛覺(jué)下行通路的關(guān)鍵區(qū)域PAG也是減弱的。
4. FGF13在病理感覺(jué)障礙中的潛在作用
CKO鼠對(duì)來(lái)自外周組織炎癥誘導(dǎo)的熱痛敏是缺失的，可能與Nav1.7的在膜上停留時(shí)間有關(guān)。由于DRG神經(jīng)元中FGF13和Nav1.7在外周神經(jīng)損傷后表達(dá)降低，所以我們推測(cè)FGF13可能主要參與炎性痛、而不參與神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)控。根據(jù)我們的研究結(jié)果，F(xiàn)GF13基因突變的病人可能對(duì)熱痛刺激不敏感。因此，測(cè)試這些病人的軀體感覺(jué)功能將幫助我們理解和認(rèn)識(shí)這些疾病及其病理機(jī)制，可能讓醫(yī)生盡早應(yīng)對(duì)來(lái)保護(hù)病人免受潛在危害。
(Yang L,et al. Neuron, 2017, 22: 806 ～ 821. 王 兵 譯 劉興君 校）
編者按：科學(xué)家們一直試圖發(fā)現(xiàn)特異性調(diào)控某種痛覺(jué)的某一類神經(jīng)元（包括初級(jí)傷害性感覺(jué)神經(jīng)元和脊髓的中間神經(jīng)元或投射神經(jīng)元）或某一特定分子，并期望這樣的神經(jīng)元或分子是存在的。但從節(jié)省能量的角度來(lái)看，多模式（Polymodel）神經(jīng)元或分子更符合進(jìn)化論原則。中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所的張旭院士團(tuán)隊(duì)近期的研究成果卻開啟了一個(gè)新思路，有這樣一類分子如胞漿型FGF13，通過(guò)調(diào)節(jié)多模式分子如Nav1.7，進(jìn)而調(diào)控某一特定的痛覺(jué)如熱痛。就像細(xì)胞內(nèi)某一信號(hào)通路，位于信號(hào)中間的分子總是被激活的（如磷酸化），但導(dǎo)致下游的生物學(xué)效應(yīng)在不同的細(xì)胞、甚或不同的條件下可能是完全不同，這取決于最上游的信號(hào)是來(lái)自于哪一種受體或通道分子，取決于它的開關(guān)允許什么樣的信號(hào)進(jìn)入。是的，確實(shí)存在這樣的開關(guān)分子，那是否還有調(diào)節(jié)機(jī)械痛的開關(guān)分子呢？我們拭目以待！
10.3969/j.issn.1006-9852.2017.04.002
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