李雨津

1.山西省大同市渾源縣第六中學，山西 渾源 037400；2.山西師范大學教育科學研究院，山西 臨汾 041000

SOD與CAT的共固定化及其研究

李雨津1，2*

1.山西省大同市渾源縣第六中學，山西 渾源 037400；2.山西師范大學教育科學研究院，山西 臨汾 041000

用包埋法對SOD和CAT進行共固定化。計算固定化后酶活回收率。對固定后酶催化反應的最適反應溫度(T)、酸堿度(pH)以及固定化酶的操作穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性進行研究。結果顯示：固定化酶具有很好的操作穩(wěn)定性和貯存穩(wěn)定性。

SOD；CAT；共固定化

一、引言

(一)SOD與CAT的簡介

SOD是種蛋白類的金屬酶，主要是催化超氧陰離子自由基(O2-·)反應生成過氧化氫和氧氣的，它可以抗輻射，防衰老，在防治腫瘤和抗炎等方面也有一定作用。

CAT是過氧化物酶的一種，是一種酶類清除劑，別稱觸酶，分布廣泛，是生物防御系統(tǒng)中的關鍵酶之一。能催化過氧化氫分解為水和氧氣，具有消毒作用的。

(二)固定化酶研究狀況

SOD是1969年被發(fā)現(xiàn)和提取出來的，至今在我們的日常生活中應用廣泛，但是SOD的穩(wěn)定性較差，太易失去生物活性，不方便進一步加工等，對此人們想了許多改進方法，如固定化等。

CAT是1892年被證實其存在，1901年命名的，發(fā)現(xiàn)后人們先是研究其性質，后又將其慢慢的應用于生活中。但由于其性質或其他方面的一些缺點不能夠滿足人們的要求，大家想了許多辦法改變，如固定化法等。

固定化酶不僅僅能夠保持游離酶的優(yōu)點，而且還變其缺點為優(yōu)點，如使酶的催化效率得以提高、其穩(wěn)定性也有增加、又可以反復的使用多次以及容易和反應后的產物分開等。

關于SOD與CAT的固定化均有許多人研究過，但是關于它們的共固定化沒有查到相關文獻材料，本文主要研究將兩種酶同時固定在一起它們的一些性質有什么變化，研究溫度、酸堿度的變化對其的影響程度，以及固定后它們的穩(wěn)定性如何變化。

二、結果

(一)酶活回收率

用海藻酸鈉和氯化鈣作為載體，對SOD和CAT兩種酶進行共固定，然后測定兩種酶的活力回收率，結果得出：SOD的酶活回收率是21.5%，CAT的酶活回收率是38.7%。

(二)最適pH的確定

在其它反應條件不變的情況下，在pH5-11范圍0.1mol/L的Tris-HCl緩沖液中，每隔1測一次兩種固定化酶的活性，結果如圖1所示。

圖1 pH對酶活力影響圖 圖2 溫度對酶活力影響圖

(三)最適溫度的確定

在其他的反應條件不變的情況下，在pH=8.2的Tris-HCl緩沖液中，在20℃-50℃的范圍內每隔5℃測一次兩種酶的活性，結果如圖2所示。

(四)操作穩(wěn)定性

SOD操作穩(wěn)定性測定是用4.5mmol/L的鄰苯三酚溶液作為底物，在pH=8.2的Tris-HCl緩沖液中，溫度是40℃的環(huán)境中，一天內連續(xù)的進行6次反應，并測定每次反應后的酶活力；同樣CAT是用0.1mol/L的H2O2溶液作為底物，在pH=7.8的Tirs-HCl緩沖液中，溫度是35℃的反應條件下，一天內6次的連續(xù)反應，測定每次反應后的酶活力。以第一次測定的酶活力作為100%算，結果如圖3所示。

圖3 操作穩(wěn)定性圖 圖4 貯存穩(wěn)定性圖

(五)貯存穩(wěn)定性

將制備好的固定化酶放在4℃的冰箱里，并在每天的同一時間(晚上20：00)測一次酶活力，連續(xù)測定20天，以第一天所測定的酶活力作為100%，所得結果如圖4所示。

三、討論

(一)該實驗采用的材料較常見、成本較低，但SOD固定化后的酶活力的回收率較低，可能是由于固定化材料中的海藻酸鈉是帶負電荷的，而SOD底物也帶負電荷，它們相互排斥使底物難以進入包埋小球接觸不到酶而致，所以固定化材料有待進一步的研究。

(二)實驗中酶活力會隨著pH和溫度的變化而變化，原因是pH和溫度影響了酶的空間結構。隨著操作次數的增多酶活力下降，可能是用玻璃棒攪拌破壞了載體小球的結構使酶泄漏導致的。相較于沒固定的酶，固定后酶活力受酸堿度的影響較小，可能是因為有載體的保護，也可能是固定后改變了酶的空間結構，使其穩(wěn)定性增加。

(三)相對于游離酶的一次性使用和存放時間短而言，酶固定后便于回收利用，并能多次的連續(xù)使用，節(jié)省了材料和酶從而成本低了，還便于貯存，可能是有了載體的保護，酶的空間結構不易破壞，受外界環(huán)境影響小，因此穩(wěn)定性提高。

四、結論

(一)本實驗采用的固定化載體材料常見易得成本較低.

(二)SOD固定化后的酶活回收率較低只有21.5%，CAT的酶活回收率是38.7%。

(三)SOD固定化后催化反應的最適pH是8，最適反應溫度是40℃，CAT的最適pH是9，溫度是35℃，相較于游離態(tài)固定后受溫度與酸堿度的影響較小，固定后在6次的連續(xù)反應后SOD仍有69.3%的相對活力，CAT也有63.5%的相對活力，相比于游離酶的一次性使用，固定化酶更具成本低，產物易于分離純化的優(yōu)勢，固定化酶的貯存時間較游離酶長，在4℃的環(huán)境下貯存16天后仍有良好的酶活力，SOD保持了80%，而CAT也保持了74%的相對活力。

(四)SOD的主要作用是能清除生物體內的超氧自由基離子，而他的產物過氧化氫對生物體仍然有害，它的去除需要CAT催化反應，所以SOD與CAT組成一個反應體系，徹底清除超氧負離子。

(五)將SOD與CAT進行固定化后便于其在農業(yè)、工業(yè)及醫(yī)藥方面的應用，如護膚品、保健品等。

[2]鄭善切，孫境蔚.酶固定化技術的研究和進展[J].赤峰學院學報(自然科學版)，2011，27(2)：36-38.DOI：10.3969/j.issn.1673-260X.2001.02.014.

李雨津(1988-)，女，漢族，山西大同人，工作單位：山西省大同市渾源縣第六中學，讀研單位：山西師范大學教育科學研究院，學科教學(生物)專業(yè)。

Q

A

跟年，李麗維，齊鳳等.固定化酶研究進展[J].中國釀造，2009(8)：17-20.

10.3969/j.issn.0254-5071.2009.08.005.