劉 力 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病原室，北京100005）

·腫瘤病因與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

癌基因誘發(fā)的DNA損傷反應(yīng)與腫瘤生成

劉 力 （中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病原室，北京100005）

腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活或抑癌基因的失活有著密不可分的關(guān)系．癌基因的活化及抑癌基因的抑制可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)染色體基因組的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)．持續(xù)的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致雙鏈DNA斷裂或單鏈DNA復(fù)制中間體的產(chǎn)生，從而分別激活兩個重要的DNA損傷反應(yīng)（DDR）通路，即ATM和ATR通路．與此同時，DDR檢查點在感知DNA損傷信號后，可誘發(fā)細(xì)胞周期阻滯．只有損傷的DNA在得以正確修復(fù)以后，細(xì)胞周期才能再次啟動．在細(xì)胞發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)化的情況下，癌基因在引發(fā)DNA損傷的同時，常通過多種途徑抑制DDR反應(yīng)，導(dǎo)致染色體異常的重組與分離，進而促進腫瘤的生成；而癌基因造成的持續(xù)的損傷反應(yīng)，未通過DDR檢驗點，還可引發(fā)細(xì)胞的另外一種結(jié)局，即最終細(xì)胞的老化死亡．

腫瘤生成；癌基因；雙鏈DNA斷裂；DNA損傷反應(yīng)

0 引言

在腫瘤治療過程中，人們常采用化療及放療的方法誘發(fā)腫瘤細(xì)胞染色體基因組發(fā)生斷裂，使腫瘤細(xì)胞無法修復(fù)這種損傷而死亡，從而達(dá)到腫瘤治療的目的［1-2］．另一方面，環(huán)境中的致癌成分及長期的電離輻射所造成的DNA損傷也會導(dǎo)致人群中癌癥患者的比例增加［3］．研究［4-6］顯示，癌基因的過量表達(dá)或抑癌基因的失活也會誘發(fā)DNA損傷反應(yīng)，并且這一過程與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)．DNA損傷除可由外界因素引發(fā)以外，還可以由內(nèi)源性因素引發(fā)［7］．其中癌基因的過量表達(dá)是引發(fā)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)進而造成DNA損傷的最主要原因之一．

1 癌基因DNA損傷反應(yīng)的概念

在DNA損傷反應(yīng)（DNA damage response，DDR）過程中，DNA損傷反應(yīng)檢查點（checkpoint）在感知DNA損傷并進一步啟動DDR修復(fù)機制，維持基因組穩(wěn)定性上發(fā)揮重要作用［8］．DDR在某些情況下可被看作是機體先天免疫反應(yīng)的組成部分，是對機體受到損傷威脅的一種應(yīng)激保護機制．與此相反，癌基因的激活以及導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程是一種對抗細(xì)胞DDR的過程［9］．DDR檢查點對細(xì)胞具有兩面性．一方面，當(dāng)損傷信號適當(dāng)時DDR檢查點可發(fā)揮正常功能，并激活DNA損傷修復(fù)通路；當(dāng)損傷信號足夠大時DDR檢查點因松懈而不能發(fā)揮正常功能，使損傷未被修復(fù)即進入細(xì)胞周期，導(dǎo)致腫瘤的生成；當(dāng)損傷信號特別大時，細(xì)胞周期持續(xù)阻滯，DDR檢查點被完全阻斷，細(xì)胞發(fā)生凋亡或老化死亡．

2 腫瘤發(fā)生過程中抑癌基因引發(fā)的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)

在基因組上分布著許多染色體缺口、異位及經(jīng)常發(fā)生DNA雙鏈斷裂（double stand break，DSB）的部位，常發(fā)生于有絲分裂中期，被統(tǒng)稱為染色體常見的脆性位點（common fragile site，CFS）［10-11］．過去人們普遍認(rèn)為，基因組上的CFS是一類沒有活性的結(jié)構(gòu)區(qū)域，但越來越多的研究結(jié)果證明，CFS區(qū)域?？蓹z測到有功能基因的表達(dá)．在小鼠基因組上敲除這些CFS基因后，這些CFS基因敲除小鼠腫瘤的負(fù)荷能力大大增加．從而提示，CFS基因的表達(dá)產(chǎn)物具有抑癌基因的功能，比如抑癌基因p53除有促進細(xì)胞凋亡的作用外，在S期還具有防止DNA復(fù)制叉停頓及塌陷的作用［12］．染色體脆性位點FRA3B中含有抑癌基因FHIT，在許多復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)所引發(fā)的腫瘤及前癌損傷中，該基因常呈現(xiàn)雜合或純合缺失［13］．BLESS是一種在核苷酸水平繪制全染色體DSB的新型二代測序方法，主要采用生物素富集斷裂標(biāo)記的方法．BLESS檢測顯示許多經(jīng)典的抑癌基因如RB和PTEN雖在腫瘤細(xì)胞中缺失，但并未位于CFS區(qū)域［14］，說明這些經(jīng)典的抑癌基因缺失受其他機制調(diào)控．

3 腫瘤發(fā)生過程中癌基因引發(fā)的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)

癌基因的激活可引發(fā)染色體的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)，這些復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)多發(fā)生在染色體CFS區(qū)域［15］．發(fā)生斷裂的區(qū)域常是由于復(fù)制叉及轉(zhuǎn)錄機器的沖撞所致，部分原因是由于CFS區(qū)域的復(fù)制常發(fā)生于S期的晚期，且常與＞1 Mb的基因相連．這些斷裂易引起染色體改變，如易位、缺失、放大和超突變等，從而引起基因拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）．

4 復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)與DNA損傷反應(yīng)通路

傳統(tǒng)上可將DNA損傷反應(yīng)分為三個階段：感知損傷、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及下游效應(yīng)．目前已知的DDR通路主要有兩條：一條是ATM（ataxia telangiectasia mutated）反應(yīng)通路，是由與PI3K相關(guān)的蛋白激酶，即共濟失調(diào)-毛細(xì)血管擴張突變基因調(diào)控的通路［16］；另一條是ATR（ATM-Rad3-Related）反應(yīng)通路，是由與ATM和酵母Rad3相關(guān)蛋白激酶，即 ATR基因調(diào)控的通路［17］．當(dāng)癌基因被激活或抑癌基因被抑制的時候，可引發(fā)細(xì)胞處于復(fù)制應(yīng)激狀態(tài)，受染細(xì)胞識別這些病毒DNA為自身受損DNA，從而引發(fā)DDR．病毒感染誘發(fā)的復(fù)制應(yīng)激狀態(tài)可導(dǎo)致多種自身染色體的損傷，其中最嚴(yán)重的損傷是DNA雙鏈斷裂．

雙鏈DNA斷裂可激活A(yù)TM反應(yīng)通路．當(dāng)DSB出現(xiàn)時，其感知復(fù)合物MRN（Mre11-Rad50-Nbs1）隨即結(jié)合到DNA的損傷區(qū)域，且ATM蛋白也被募集到該區(qū)域，并與MRN復(fù)合物相互作用．正常狀態(tài)下，ATM在蛋白去磷酸酶如PP2A或WIP1作用下形成同源二聚體的非活化狀態(tài)．DSB可使ATM 1981位點的絲氨酸（S1981）自主磷酸化，并使PP2A從ATM上解離，從而導(dǎo)致ATM由非活化的雙體變?yōu)榛罨膯误w，ATM單體又進一步被磷酸化及乙?；?，形成功能性ATM單體．隨后，活化的ATM在S139位點磷酸化H2AX蛋白，形成活化的γH2AX蛋白．γH2AX蛋白的形成有利于 ATM募集另一個重要的銜接蛋白MDC-1，并使其磷酸化．磷酸化的MDC-1可促使泛素連接酶RNF8和RNF168與其結(jié)合，并導(dǎo)致γH2AX泛素化．形成泛素化的γH2AX不僅可在核內(nèi)DNA損傷部位搭建與修復(fù)蛋白53BP1和Brca1的聯(lián)系，而且也能使ATM進一步磷酸化下游靶基因如Chk2、p53和Cdc25，從而調(diào)控細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡．

ATR反應(yīng)通路主要應(yīng)對DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的單鏈DNA暴露的問題．主要表現(xiàn)為在應(yīng)激條件下，復(fù)制叉停頓（stalling）或塌陷（collapse）可導(dǎo)致單鏈DNA的暴露．此外，某些DSB也可造成DNA雙鏈的不對稱切割，也可形成暴露的單鏈DNA．復(fù)制蛋白A（replication proteinA，RPA）隨即覆蓋于單鏈DNA，并通過ATR相互作用蛋白ATRIP募集ATR．拓?fù)洚悩?gòu)酶結(jié)合蛋白 1（topoisomerase binding protein 1，TopBP1）也可通過9-1-1復(fù)合物（Rad9-Rad1-Hus1）被募集到ssDNA并與ATR及ATRIP蛋白結(jié)合．這樣ATR的激酶活性就可以被激活，其作用是通過磷酸化活化下游許多效應(yīng)因子，其中包括很重要的調(diào)節(jié)因子Claspin．Claspin負(fù)責(zé)募集Chk1到ssDNA，進而使ATR磷酸化Chk1并激活其激酶結(jié)構(gòu)域，促進相關(guān)周期檢查點的活化．Chk1是S期內(nèi)及G2／M檢驗點的主要效應(yīng)因子，而Chk2主要在G1／S及S期內(nèi)發(fā)揮作用．

Chk1和Chk2均可磷酸化Cdc25磷酸酶家族，且可通過去除周期素依賴激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）蛋白的抑制性磷酸化作用，而使CDK功能性活化．Chk2可通過磷酸化E2F調(diào)控細(xì)胞周期進程，Chk1和Chk2還可通過磷酸化p53而影響G1／S周期進程及細(xì)胞凋亡．Chk1和Chk2還可通過磷酸化和激活同源重組通路的成分而在DNA修復(fù)中發(fā)揮作用．

5 腫瘤生成是一種拮抗DDR的過程

腫瘤生成的過程就是對DDR的抑制過程，同時導(dǎo)致細(xì)胞周期檢查點不對損傷的DNA進行檢測［18］．癌基因誘導(dǎo)的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致的DNA損傷通?？梢员?DDR檢測到，而 DDR下游的效應(yīng)因子如Chk1和Chk2的功能常被抑制．EB病毒（epstein-barr virus，EBV）相關(guān)的癌基因可使B細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，可導(dǎo)致B淋巴瘤等的發(fā)生．EBV介導(dǎo)的淋巴瘤生成與EB病毒感染所引起的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)及DNA損傷有關(guān)［19］．該損傷信號可以被ATR通路的感知蛋白所檢測，從而激活A(yù)TR．研究顯示，EBV感染可激活B細(xì)胞的STAT3信號通路，而STAT3可以抑制ATR下游信號通路，進而使S期內(nèi)的檢查點松弛．STAT3的活化可以促進caspase 7介導(dǎo)的Claspin蛋白的降解，從而抑制損傷信號由ATR到Chk1的傳遞．該研究顯示，在腫瘤發(fā)生過程中 STAT3的持續(xù)激活可抑制DDR，從而使S期內(nèi)的檢查點不發(fā)揮作用，細(xì)胞攜帶損傷信號進入S期．此外，最近美國杜克大學(xué)研究［20］顯示，腫瘤細(xì)胞存在一種新的可隨機誘發(fā)DSB的作用機制．研究顯示，該機制不依賴于細(xì)胞內(nèi)活性氧應(yīng)激反應(yīng)或復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)，而依賴于腫瘤細(xì)胞中線粒體所釋放的細(xì)胞色素C使caspase 3及核酸酶得以激活，進而在細(xì)胞核內(nèi)引發(fā)染色體DSB，進而激活A(yù)TM通路．ATM的活化可進一步激活腫瘤驅(qū)動因子如NFκB和STAT3的表達(dá)，從而促進腫瘤的生成．本研究略顯不足的是尚不知腫瘤的發(fā)生是如何克服DDR機制的？但本研究與EBV誘發(fā)B細(xì)胞淋巴瘤的研究結(jié)果是有相關(guān)性的：EBV可激活A(yù)TR信號通路，而隨機的 DSB可激活 ATM信號通路，二者均可激活STAT3信號通路．因此隨機DSB激活的STAT3也可抑制ATM下游Chk2效應(yīng)因子的功能，從而使細(xì)胞周期檢查點松弛，DNA損傷不被修復(fù)，從而誘發(fā)腫瘤的生成．

6 討論與展望

基因組不穩(wěn)定性在腫瘤發(fā)生中起重要作用，是腫瘤發(fā)生的八大標(biāo)志性事件之一［21］．癌基因激活或抑癌基因的抑制均可引發(fā)基因組DNA的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)，持續(xù)的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致DNA損傷，如復(fù)制叉停頓、塌陷或雙鏈DNA斷裂．DNA損傷信號可使細(xì)胞周期停滯，并激活DNA損傷反應(yīng)通路，進而對損傷的DNA進行修復(fù)．DDR是機體的一種保護機制，對腫瘤的生成具有抑制作用．而癌基因?qū)?xì)胞的成功轉(zhuǎn)化就是克服靶細(xì)胞DDR的過程．DNA復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的早期事件，發(fā)生于基因組不穩(wěn)定性之前．癌基因除可促進腫瘤生成以外，還可以促進靶細(xì)胞的老化，從而限制細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化．同一癌基因在不同的組織細(xì)胞中可能會產(chǎn)生相反的作用，即癌基因在一種細(xì)胞中表現(xiàn)為促進腫瘤生成，而在另外的一種細(xì)胞中可能就表現(xiàn)為促進細(xì)胞的老化．

深入研究DDR在腫瘤發(fā)生過程中的普遍性作用規(guī)律將會為未來腫瘤治療帶來新的治療靶點與策略［22］．不同于已有的放療及遺傳毒性化學(xué)治療，這些方法主要是誘發(fā)癌細(xì)胞的DNA損傷從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的，新的治療策略將基于對作用機制的深入研究與認(rèn)識．比如可以靶向STAT3進行抑制劑藥物篩選，從而抑制癌基因誘發(fā)的對DDR抑制作用，激活自身的DDR機制，達(dá)到抗腫瘤的目的．而傳統(tǒng)的ATM／Chk2及ATR／Chk1抑制劑需要結(jié)合其他治療方法如放療等［23］，治療程序復(fù)雜，毒副作用也比較大．因此，腫瘤的新治療策略值得進一步探索與嘗試．

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DNA damageresponseandtumorigenesis induced by oncogene

LIU Li
Department of Microbiology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100005，China

Tumorigenesis is closely related to the activation of oncogene or inactivation of tumor suppressor gene．The activation of oncogene or suppression of tumor suppressor gene can induce the replication stress of human chromosome genome．The sustained reaction of replication stress often results in the accumulation of double strand break or single strand DNA replication intermediate，which will in turn activate two important DNA damage response（DDR）pathways，ATM and ATR pathway，respectively．Meanwhile，the detection of the damaged signal by DDR check point can induce cell cycle arrest．Only upon the correct repair on these damage DNAs，the cell cycle can re-initiate．In the presence of cellular transformation，oncogene not only induces DNA damage，but also promotes tumorigenesis by inhibiting DDR through multiple pathways that may eventually lead to the aberrant recombination and／or segregation of the replicative chromosomes．In addition，the sustained DDR induced by oncogene fails to pass the DDR checkpoint which will lead to another cellular outcome，the final cell death through senescence．

tumorigenesis；oncogene；double strand break；DNA damage response

R730．231

A

2095-6894（2017）05-01-03

2017-04-06；接受日期：2017-04-20

國家自然科學(xué)基金項目（81272230，81550030）

劉 力．博士，研究員．研究方向：病毒RNA調(diào)控及腫瘤信號通路．E-mail：lliu8＠263．net；lliu＠pumc．edu．cn