馬玉環(huán)+鄭文偉+陳后煌+邵翔+陳達(dá)+葉蕻芝+李西海

【摘 要】目的：探討牛膝多糖（ABPS）對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原及蛋白聚糖表達(dá)的影響。方法：取4周齡健康SD大鼠10只，分離膝關(guān)節(jié)，刮下雙側(cè)膝關(guān)節(jié)表面軟骨組織，采用機(jī)械-Ⅱ型膠原酶消化法獲取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，采用

Ⅱ型膠原免疫組化法鑒定軟骨細(xì)胞。體外培養(yǎng)到第2代軟骨細(xì)胞，分別用0，50，100，200 μg·mL-1的ABPS對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。干預(yù)后，Western blot檢測(cè)各組Ⅱ型膠原、蛋白聚糖的表達(dá)變化，免疫熒光觀察空白組與加藥組Ⅱ型膠原的表達(dá)變化。結(jié)果：第2代軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表明軟骨細(xì)胞的典型特征：軟骨細(xì)胞含有豐富的Ⅱ型膠原。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，ABPS促進(jìn)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)，并且在

100 μg·mL-1時(shí)表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。同時(shí)100 μg·mL-1的ABPS干預(yù)軟骨細(xì)胞后，軟骨細(xì)胞中的蛋白聚糖表達(dá)增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與空白組的Ⅱ型膠原熒光表達(dá)相比，ABPS干預(yù)后軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原熒光表達(dá)更強(qiáng)。結(jié)論：ABPS促進(jìn)了軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎；牛膝多糖；Ⅱ型膠原；蛋白聚糖；軟骨細(xì)胞；大鼠

Effect of ABPS on the Expressions of TypeⅡCollagen and Proteoglycan of Cartilage Cells

MA Yu-huan，ZHENG Wen-wei，CHEN Hou-huang，SHAO Xiang，CHEN Da，YE Hong-zhi，LI Xi-hai

【ABSTRACT】 Objective：To investigate the effect of Achyranthes bidentata polysaccharides（ABPS） on the expressions of typeⅡcollagen and proteoglycan in cartilage cells.Methods：Ten 4-week-old healthy SD rats were used to isolate the knee joints，scrape cartilaginous tissue off the surface of the knee joint，and get knee joint cartilage cells with the mechanical typeⅡcollagenase digestion method.An in vitro culture system was established and the cell morphology was observed with an inverted phase contrast microscope.TypeⅡ immunohistochemistry method was used to identify the chondrocytes.By the second generation of in-vitro-cultured chondrocytes，ABPS（0，50，100，200 μg·mL-1 respectively）was used to interfere in the cartilage cells.After intervention，Western blot was used to detect the expression changes of typeⅡcollagen and proteoglycan of each group，and immunofluorescence was used to observe the expression changes of typeⅡcollagen respectively in the blank control group and the dosing group.Results：The morphology of the second generation chondrocytes showed that cartilage cells contained rich typeⅡcollagen.Western blot showed that ABPS promoted chondrocyte typeⅡcollagen and the expression of typeⅡcollagen was the highest when there was 100 μg·mL-1 ABPS，the difference being statistically significant（P < 0.05）.After intervention with 100 μg·mL-1 ABPS，the expression of proteoglycan in cartilage cells increased，but the difference was not statistically significant（P > 0.05）.Compared with the blank control group，the expression of intervened collagen typeⅡcollagen was stronger.Conclusion：ABPS promotes the expression of typeⅡcollagen and proteoglycan.

【Keywords】 osteoarthritis；achyranthes

bidentata polysaccharide；typeⅡcollagen；pr-oteoglycan；cartilage cell；rats

牛膝多糖（ABPS）是從莧科類(lèi)植物牛膝的干燥根中提取出來(lái)的有效成分。牛膝具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行之功效[1-2]，被廣泛應(yīng)用于治療骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）。OA是一種常見(jiàn)于中老年人的慢性、進(jìn)展性關(guān)節(jié)疾病，其最典型的病理特征是軟骨退變，以Ⅱ型膠原與蛋白聚糖破壞丟失、軟骨膠原表型改變?yōu)橹饕±碜兓痆3-4]。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組成[5-6]，構(gòu)成ECM的主要成分是Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。課題組前期研究表明，ABPS促進(jìn)了軟骨細(xì)胞的增殖，因此，本文將探討ABPS對(duì)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原及蛋白聚糖表達(dá)變化的

影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠10只，雄性，4周齡，體質(zhì)量200～300 g，由上海吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：0001319。許可證號(hào)：SCXK（閩）2012-0001。大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲水，顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥 物 按照參考文獻(xiàn)[7]研究方法提取。提取的ABPS溶解在培養(yǎng)液中。

1.3 主要試劑 RIPA裂解液（強(qiáng)）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；PVDF膜（美國(guó)Millipore公司）；TBST、轉(zhuǎn)膜液、電泳液（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；一抗Ⅱ型膠原、一抗蛋白聚糖（Abcam）；二抗羊抗兔（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；DAB檢測(cè)試劑盒（北京博士德公司）；DyLight 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（艾美捷科技有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 超純水裝置（美國(guó)MILIPORE公司）；LX-800酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-tek公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD公司）；64R型低溫高速離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)ZEISS公司）。

2 方 法

2.1 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 將10只SD大鼠脫頸法處死，無(wú)菌條件下刮下雙側(cè)膝關(guān)節(jié)表面軟骨組織，1×PBS緩沖液漂洗3次，用眼科剪剪碎至1 mm3大?。灰浦僚囵B(yǎng)皿中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為

0.2%的Ⅱ型膠原酶5 mL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化2 h；接著用200目尼龍網(wǎng)篩過(guò)濾；然后放入1000 r·min-1離心機(jī)離心5 min，棄上清液，將沉淀的細(xì)胞團(tuán)塊用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液；再將未消化完全的組織如此操作2次。將3次所得的細(xì)胞懸液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1×105·mL-1，接種于培養(yǎng)瓶中，放入體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～

3天更換1次培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待80%的細(xì)胞融合后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)單層鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化2～3 min，待鏡下細(xì)胞圓縮時(shí)，用尖吸管吹打細(xì)胞使其懸于液體中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS培養(yǎng)液終止消化，分瓶，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的FBS培養(yǎng)。第2代（P2）軟骨細(xì)胞分為空白組和ABPS組，空白組不加ABPS干預(yù)，ABPS組分別加入50，100，200 μg·mL-1的ABPS干預(yù)48 h[8]。

2.2 軟骨細(xì)胞鑒定 P2軟骨細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)48 h，PBS沖洗，丙酮固定10 min，浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.75%的H2O2-PBS 37 ℃處理30 min，PBS振洗2次，每次3 min；加入封閉血清，37 ℃

封閉30 min，棄去血清，加入Ⅱ型膠原一抗，37 ℃孵育2 h，PBS振洗3次，每次3 min，生物素化山羊抗兔IgG 37 ℃作用20 min，PBS沖洗

2 min，3次；鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物置于室溫30 min，PBS沖洗5 min，4次；DAB顯色，水洗

5 min，浸入蘇木素染液2 min，水洗，脫水，透明，

封片。陰性對(duì)照組不加入Ⅱ型膠原一抗孵育。

2.3 Western blot 參照試劑說(shuō)明書(shū)，分組提取總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。①質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE膠每孔加20 μg變性后蛋白，60 V恒壓至電泳超過(guò)濃縮膠后，90 V恒壓至電泳結(jié)束。②PVDF膜無(wú)水甲醇活化10 min，PVDF膜、膠、濾紙，轉(zhuǎn)膜液平衡10 min。③由下到上：濾紙-膠-PVDF膜-濾紙順序，制作“三明治”夾，100 V恒壓條件轉(zhuǎn)膜。④轉(zhuǎn)膜完成的PVDF膜，TBST蕩洗后質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，相應(yīng)一抗孵育，4 ℃搖床搖動(dòng)過(guò)夜。⑤TBST洗3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。⑥PVDF膜蛋白面朝上放置，加入適量ECL顯色液，反應(yīng)2 min，

分析得出結(jié)果。

2.4 免疫熒光染色 將軟骨細(xì)胞分為空白組及ABPS組，ABPS組中加入含ABPS 100 μg·mL-1的完全培養(yǎng)基。干預(yù)48 h后，去除培養(yǎng)基，PBS洗3次；多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗3次；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗3次；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的羊血清室溫封閉1 h，Ⅱ型膠原抗體4 ℃孵育過(guò)夜；PBS洗3次，羊抗兔熒光二抗37 ℃孵育1 h，DAPI染色5 min，PBS洗5～6次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）或Student's t-test。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞形態(tài) 從大鼠膝關(guān)節(jié)經(jīng)多次酶消化分離所得成骨細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察，原代（P0）的軟骨細(xì)胞具有小而圓的特征，經(jīng)過(guò)2 d的培養(yǎng)，細(xì)胞的體積變大，少量的細(xì)胞開(kāi)始拉長(zhǎng)；3 d后，細(xì)胞具有梭型或者橢圓形的特征；到第5天細(xì)胞簇開(kāi)始生長(zhǎng)。第1代（P1）及P2細(xì)胞生長(zhǎng)更為迅速。見(jiàn)圖1。

3.2 體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的鑒定 P2軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表明軟骨細(xì)胞的典型特征：軟骨細(xì)胞含有豐富的Ⅱ型膠原。與陰性對(duì)照組比較，干預(yù)后的軟骨細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)染色棕色，這表明軟骨細(xì)胞具有豐富的Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)。見(jiàn)

圖2。

3.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果 與空白組比較，ABPS組中的Ⅱ型膠原表達(dá)量增加，其中以

100 μg·mL-1ABPS對(duì)軟骨細(xì)胞干預(yù)時(shí)Ⅱ型膠原的表達(dá)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（圖3、

意義（P > 0.05）。

3.4 免疫熒光結(jié)果 2組軟骨細(xì)胞核DAPI染色明顯，呈藍(lán)色（圖6A1-A2），軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原染色明顯，呈綠色（圖6B1-B2），細(xì)胞核與Ⅱ型膠原的合成圖，結(jié)構(gòu)清晰（圖6C1-C2）。與空白組比較，ABPS組的細(xì)胞核染色明顯，Ⅱ型膠原的熒光表達(dá)更強(qiáng)?？梢哉f(shuō)明100 μg·mL-1 ABPS干預(yù)的軟骨細(xì)胞的活性、Ⅱ型膠原的表達(dá)都得到了增強(qiáng)。

4 討 論

氨基葡萄糖是治療OA的常用藥物，具有一定的療效。研究發(fā)現(xiàn)，氨基葡萄糖可以促進(jìn)蛋白多糖的合成，抑制蛋白多糖及膠原的降解，延緩OA的進(jìn)程[9]。然而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間使用氨基葡萄糖會(huì)造成長(zhǎng)鏈脂肪酸及過(guò)氧化物的積聚，對(duì)OA的治療產(chǎn)生相反的作用[10]。而ABPS是一種具有廣泛生物活性的高分子多糖，因在治療疾病中具有重要作用而引起廣泛的關(guān)注。課題組前期的結(jié)果表明，ABPS可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖[8，11]。因此，ABPS可能是一種潛在新型的治療OA的藥物。

關(guān)節(jié)軟骨的膠原蛋白主要以Ⅱ型膠原為主，占軟骨膠原總量的90%～95%。Ⅱ型膠原經(jīng)過(guò)多次聚集，在軟骨內(nèi)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)與蛋白多糖鏈接、纏繞，形成了使軟骨具有伸縮力的纖維網(wǎng)，起到固定蛋白多糖以及維持組織結(jié)構(gòu)和張力恒定的作用。Ⅱ型膠原蛋白形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞被認(rèn)為是OA的重要環(huán)節(jié)，軟骨的這種結(jié)構(gòu)框架遭到破壞從而引發(fā)軟骨生物力學(xué)、生物化學(xué)等一系列變

化[12-14]。因此促進(jìn)Ⅱ型膠原表達(dá)，在一定程度上可以緩解OA進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)Western blot的結(jié)果表明，ABPS促進(jìn)了軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)，并且

100 μg·mL-1時(shí)表達(dá)最高。免疫熒光結(jié)果表明，ABPS可以明顯增加軟骨細(xì)胞中Ⅱ型膠原的

表達(dá)。

蛋白聚糖是關(guān)節(jié)軟骨ECM的主要大分子成分，在維持軟骨正常功能及ECM的結(jié)構(gòu)上具有重要作用[15]。在OA中，蛋白聚糖的過(guò)度降解和丟失是軟骨代謝失衡中最早發(fā)生的代謝變化。隨著OA病理改變出現(xiàn)，蛋白聚糖的降解持續(xù)存在，則會(huì)進(jìn)一步引起關(guān)節(jié)軟骨膠原的過(guò)度降解及細(xì)胞表型的改變。而軟骨細(xì)胞的表型改變，又能導(dǎo)致蛋白聚糖代謝的異常增加，隨著細(xì)胞功能的喪失，蛋白聚糖的分解加快，并且多于合成，最終導(dǎo)致蛋白聚糖的大量丟失。因此，促進(jìn)蛋白聚糖的表達(dá)對(duì)治療OA具有重要作用[16]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ABPS在100 μg·mL-1時(shí)可以促進(jìn)蛋白聚糖的合成，表明ABPS可通過(guò)促進(jìn)蛋白聚糖的表達(dá)抑制軟骨退變。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞進(jìn)行ABPS干預(yù)發(fā)現(xiàn)，ABPS具有促進(jìn)大鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原與蛋白聚糖表達(dá)的作用，提示ABPS可以通過(guò)促進(jìn)軟骨細(xì)胞ECM分泌來(lái)抑制軟骨退變。

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收稿日期：2016-07-13；修回日期：2016-08-29