程學(xué)遠(yuǎn)，黃忠

（廣西北海市人民醫(yī)院 普通外科，廣西 北海 536000）

miR-320在乳腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

程學(xué)遠(yuǎn)，黃忠

（廣西北海市人民醫(yī)院 普通外科，廣西 北海 536000）

目的探討miR-320在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RTPCR）檢測(cè)108例乳腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中miR-320表達(dá)，分析miR-320表達(dá)與乳腺癌病理特征的相關(guān)性。結(jié)果乳腺癌組織中miR-320表達(dá)水平低于正常乳腺組織[（0.58±0.17）vs（1.05±0.21）]（P<0.05）。乳腺癌組織miR-320表達(dá)水平與乳腺癌TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）；而miR-320表達(dá)水平與年齡、絕經(jīng)、病理類型、腫瘤大小、C-erbB-2表達(dá)、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）表達(dá)、孕激素受體（PR）表達(dá)及雌激素受體（ER）表達(dá)無(wú)關(guān)（P>0.05）。結(jié)論miR-320在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-320可能是乳腺癌特異性診斷潛在標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。

miR-320；乳腺癌；臨床病理特征

Abstract:ObjectiveTo evaluate the expression and clinical significance of miR-320 in breast cancer.MethodsThe expression of miR-320 in 108 cases of breast cancer tissues and normal breast tissue were detected by RT-PCR,and analyzed the correlation between expression of miR-320 in breastcancer,pathological feature and clinical prognosis.ResultsThe miR-320 expression levels of breast cancer tissue were significantly lower than normal breast tissue[(0.58±0.17)vs(1.05±0.21)](P<0.05).The miR-320 expression level was closely correlated with TNM staging and lymph node metastasis(P<0.05),but the miR-320 expression level was no correlated with age,menopause,pathological type,tumor size,C-erbB-2 expression,PCNA expression,PR expression and ER expression (P>0.05).ConclusionsmiR-320 is lowly expression in the breast cancer,and its expression level is closely related with occurrence and development of breast cancer.

Keywords:miR-320;breast cancer;clinicopathological features

乳腺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，全世界每年約有130萬(wàn)乳腺癌新增病例，約有50多萬(wàn)患者死于乳腺癌[1]。盡管手術(shù)聯(lián)合同步放化療治療早期乳腺癌的長(zhǎng)期治愈率可達(dá)≥90%，但對(duì)于局部晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移乳腺癌仍缺乏令人滿意的治療手段[2]。缺乏具有早期診斷及預(yù)后判定意義的特異性指標(biāo)是導(dǎo)致乳腺癌臨床診療效果欠佳的重要因素。因此，探尋乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，明確其早期診斷及治療靶點(diǎn)，對(duì)于乳腺癌的臨床診療具有十分重要的意義。微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，miRNA）屬于內(nèi)源性非編碼小分子核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），其可通過(guò)與靶基因信使核糖核酸3’（messenger ribonucleicacid 3’，mRNA 3’）端非翻譯區(qū)相結(jié)合調(diào)控靶基因mRNA翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，并以此參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過(guò)程[3]。miRNAs異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，miRNAs被認(rèn)為是腫瘤特異性診斷標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。miR-320是一種公認(rèn)的抑癌miRNA，既往研究顯示，miR-320在宮頸癌[4]和結(jié)直腸癌等[5]多種惡性腫瘤組織中低表達(dá)。但miR-320在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義尚未明確。本研究旨在探討miR-320表達(dá)水平乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，以期為乳腺癌的臨床診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 選取2014年7月-2016年9月北海市人民醫(yī)院收治的108例乳腺癌患者?；颊呔鶠榕裕荒挲g 27～69 歲，平均（52.35±9.44）歲；所有乳腺癌組織樣本均經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性乳腺癌；術(shù)前均未接受放療、化療等輔助治療，且有完整臨床病理資料。同時(shí)取對(duì)應(yīng)癌旁組織（距癌組織邊緣≥5 cm）為對(duì)照組，所有癌旁組織樣本均經(jīng)病理證實(shí)為正常乳腺組織。

1.1.2 試劑與設(shè)備 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒（購(gòu)于美國(guó)ABI公司），Trizol試劑（購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司），miR-320、U6引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取 取2 mm3樣本組織超聲勻漿，隨后加入1ml Trizol試劑，吹打均勻后室溫靜置10 min 后加入 340 μl氯仿，震蕩均勻，4℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上層水相并加入等體積的異丙醇，震蕩均勻，室溫反應(yīng)10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，室溫放置15 min以徹底晾干，焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水溶解，取1 μl RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，采用Bio-Rad檢測(cè)RNA純度及濃度。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 取組織總RNA置于1支潔凈PCR 反應(yīng)管中，1 μl Oligo（dT），RNase Free dH2O將溶液總體積補(bǔ)足至6 μl，混勻，70℃水浴10 min，冰浴3 min，向上述聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）反應(yīng)管中依次加入下列試劑，總反應(yīng)體系為20 μl∶1 μmol/L逆轉(zhuǎn)錄特異性引物3 μl、10×RT buffer 1.5 μl、100 mmol/L dNTPs 0.15 μl、50 u/μl Multi ScribeTMReverse Transcriptase（美國(guó)Applied Biosystems公司）1.0μl、20 u/μl RNA 酶抑制劑 0.19 μl、總 RNA 1 μl，加 DEPC 水補(bǔ)至 20 μl。反應(yīng)條件：16℃反應(yīng) 30 min，42℃反應(yīng) 30 min，85℃反應(yīng)5 s，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。miR-320逆轉(zhuǎn)錄引物序列，正向引物：5'-TATTCGCACTGGAT ACGACTCCAGC-3’；反向引物：5'-GTCGTATCCAG TGCAGGGTCCGAGG-3’。U6逆轉(zhuǎn)錄引物序列，正向引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，反向引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 取一支潔凈PCR反應(yīng)管，反應(yīng)體系為20μl，冰上依次加入以下試劑：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）1 μl、引物 1 μl、TaqMan GEx MASTER Mix（美國(guó) Applied Biosystems公司）10 μl，加雙蒸水補(bǔ)至20μl。反應(yīng)條件：95℃反應(yīng)10 min，92℃反應(yīng)15s，60℃反應(yīng)1min，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，△Ct值=miR-320Ct值-U6Ct值。miR-320引物序列，正向引物：5'-ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTG AGA-3'；反向引物：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'。U6引物序列，正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)（%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與正常乳腺組織miR-320表達(dá)水平比較

乳腺癌組織中miR-320表達(dá)水平低于正常乳腺組織[（0.58±0.17）vs（1.05±0.21）]（P<0.05）。

2.2 乳腺癌組織miR-320表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

miR-320表達(dá)水平與TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），miR-320表達(dá)水平年齡、絕經(jīng)、病理類型、腫瘤大小、C-erbB-2表達(dá)、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá)、孕激素受體（progesterone receptor，PR）表達(dá)及雌激素受體（estrogen receptor，ER）表達(dá)無(wú)關(guān)（P>0.05）。見(jiàn)附表。

附表 乳腺癌組織臨床病理特征與miR-320表達(dá)水平的相關(guān)性 （±s）

病理特征 例數(shù)miR-320相對(duì)表達(dá)量t值P值絕經(jīng)是48 0.60±0.24 0.197 0.843否60 0.56±0.15年齡≥40歲 66 0.59±0.28 0.049 0.978<40歲 42 0.57±0.14病理類型浸潤(rùn)型導(dǎo)管癌 57 0.55±0.20 0.113 0.924浸潤(rùn)型小葉癌 51 0.60±0.16 TNM分期I、Ⅱ 72 0.68±0.25 3.199 0.035Ⅲ36 0.52±0.13腫瘤大小<2.5 cm 55 0.59±0.20 0.062 0.963≥2.5 cm 53 0.57±0.16淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是40 0.51±0.15 3.128 0.038否68 0.66±0.23 C-erbB-2表達(dá)+38 0.56±0.25 0.127 0.919-70 0.59±0.16 PCNA表達(dá)+76 0.57±0.21 0.058 0.964-32 0.59±0.19 PR表達(dá)+71 0.57±0.20 0.225 0.821-37 0.60±0.24 ER表達(dá)+73 0.59±0.16 0.186 0.859-35 0.57±0.22

3 討論

miRNA屬于高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，并廣泛存在于真核生物中。正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)miRNA表達(dá)遵守嚴(yán)格的組織、時(shí)序特異性；但在腫瘤環(huán)境下，miRNA往往出現(xiàn)異常表達(dá)，并起到類似癌基因或抑癌基因的作用[6]。大量研究證實(shí)，乳腺癌中存在多種miRNA的異常表達(dá)，提示miRNA參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[7-9]。因此，深入研究miRNA與乳腺癌的相關(guān)性，對(duì)乳腺癌的臨床診療具有積極的促進(jìn)作用。

miR-320定位于人類第8號(hào)染色體，是新發(fā)現(xiàn)的一類miRNA。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miR-320失衡表達(dá)可促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。WU等[10]研究顯示，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中miR-320表達(dá)低于正常組織（P<0.05），且miR-320表達(dá)水平與腫瘤血管密度呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），而慢病毒載體轉(zhuǎn)染miR-320可抑制腔鱗狀細(xì)胞癌新生血管生成。WAN等[11]研究表明，結(jié)直腸癌組織中miR-320表達(dá)低于正常組織（P<0.05），過(guò)表達(dá)miR-320可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HT-29增殖及侵襲，并降低后者對(duì)5-Fu和奧沙利鉑的敏感性，其機(jī)制與miR-320靶向調(diào)控叉頭框蛋白 M1（fork head box M1，F(xiàn)OXM1）蛋白表達(dá)有關(guān)。宋成等[12]通過(guò)對(duì)比宮頸癌組織和正常宮頸上皮組織miR-320表達(dá)發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中miR-320表達(dá)低于正常宮頸上皮組織（P<0.05），且miR-320表達(dá)水平與宮頸癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。上述研究提示，miR-320在多種惡性腫瘤進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著類似抑癌基因作用，但miR-320在乳腺癌中的作用尚未明確。

本研究結(jié)果顯示，乳腺癌組織中miR-320表達(dá)水平低于正常乳腺組織（P<0.05），該結(jié)果與其他腫瘤的表達(dá)情況相似[12-13]，提示miR-320低表達(dá)可能在某種程度上促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步分析，乳腺癌組織中miR-320表達(dá)與乳腺癌臨床病理特性相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，TNM分期越高則miR-320表達(dá)越低（P<0.05），提示miR-320可能作為抑癌基因參與乳腺癌的進(jìn)展過(guò)程；遠(yuǎn)處淋巴轉(zhuǎn)移者miR-320表達(dá)低于無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者（P<0.05），提示miR-320低表達(dá)可能促進(jìn)乳腺癌侵襲及遷移[14]。而miR-320表達(dá)與年齡、絕經(jīng)、病理類型、腫瘤大小、C-erbB-2表達(dá)、PCNA表達(dá)、PR表達(dá)及ER表達(dá)（P>0.05），提示miR-320表達(dá)不易受個(gè)體因素或其他因素影響，其可能是乳腺癌早期診斷、療效判定和預(yù)后評(píng)估的潛在指標(biāo)。但值得注意的是，由于miR-320在多種惡性腫瘤組織中具有高表達(dá)，故其診斷乳腺癌的特異性較差。因此，聯(lián)合其他血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)可能對(duì)于提高miR-320針對(duì)乳腺癌的特異性有所幫助。

綜上所述，miR-320在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，且其表達(dá)水平與乳腺癌TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miR-320可能是乳腺癌特異性診斷潛在標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)。

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Expression and clinical significance of miR-320 in breast cancer

Xue-yuan Cheng,Zhong Huang
(Department of General Surgery,the People's Hospital of Beihai City,Beihai,Guangxi 536000,China)

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.012

1005-8982（2017）15-0058-04

2016-11-17

北海市本級(jí)科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目研發(fā)類資助（No：201602028）