章旭之 馬 毅

(中山大學附屬第一醫(yī)院器官移植科,廣州510080)

NOD樣受體在免疫耐受中的作用①

章旭之 馬 毅

(中山大學附屬第一醫(yī)院器官移植科,廣州510080)

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)和NOD樣受體(Nucleotide binding oligomerization domain-like receptors，NLR)為代表的模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRR)在固有免疫等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，其中NLR作為一類胞內(nèi)模式識別受體在免疫耐受領(lǐng)域也得到越來越多的關(guān)注。本文對NLR在免疫耐受領(lǐng)域近年的研究進展作一綜述。

1 NLR概況

NLR，即核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域受體，是一類廣泛存在于固有免疫細胞胞漿內(nèi)的PRR[1]，由介導配體蛋白的C端亮氨酸富集重復結(jié)構(gòu)域(Leucine-rich repeat domain，LRRs)、具有ATP酶結(jié)構(gòu)域的中心核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-binding domain，NBD)和結(jié)合下游分子的N端結(jié)構(gòu)域組成。目前NLR家族已發(fā)現(xiàn)22個成員[2]，其LRRs和NBD基本相同(除NLRP10缺乏LRRs)，但其N端結(jié)構(gòu)域則存在異質(zhì)性，以此為依據(jù)分為5個亞家族：大多數(shù)NLR的N端含1～2個胱天蛋白酶激活和募集結(jié)構(gòu)域(Caspase-activation and recruitment domain，CARD)或熱蛋白結(jié)構(gòu)域(Pyrin domain，PYD)，前者屬NLRC亞家族，包括2種NOD蛋白(Nucleotide binding oligomerization domain protein，NOD)和3種NLRC蛋白；后者屬NLRP亞家族，包括14種NLRP蛋白。值得注意的是NLRP蛋白舊稱NALP蛋白(Neutrophilic apoptosis LRR pyrin domain protein，NALP)，兩種命名法通用。還有少數(shù)NLR的N端含桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復體(Baculovirus inhibitor of apoptosis protein repeat，BIR)，稱NAIP蛋白(Neut-rophilic apoptosis inhibitory protein,NAIP)，屬NLRB亞家族[3]；N端含線粒體靶向序列的稱NLRX蛋白，屬NLRX亞家族[4]；而NLRA亞家族的NLRA蛋白，又稱Ⅱ型反式激活子(ClassⅡtransactivator,CⅡTAs)，其CARD和NACHT結(jié)構(gòu)域之間還存在一段功能尚不清楚的可被酸性環(huán)境激活的結(jié)構(gòu)域稱酸性激活結(jié)構(gòu)域(Acidic activation domain,AD)[5]。

NLRC亞家族中，NOD蛋白N端的CARD結(jié)構(gòu)域可結(jié)合和激活絲-蘇氨酸激酶RIP2，使IκB磷酸化，進而激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，通過NF-κB信號通路和MAPK信號通路介導下游炎性細胞因子的表達[6]；近期有報道稱NOD蛋白還可激活胱天蛋白酶和ATG16L蛋白，介導細胞的凋亡(Apoptosis)和自噬(Autophagy)作用[7,8]。根據(jù)CARD結(jié)構(gòu)域數(shù)目的不同，NOD蛋白可分為NOD1和NOD2，其N端分別含有1個或2個CARD結(jié)構(gòu)域。NOD1蛋白的配體是N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine)，與革蘭陰性菌細胞壁成分mDAP結(jié)構(gòu)相似[9]；NOD2蛋白的配體則為胞壁酰二肽(NAM-L-Ala-D-Glu，MDP)，在大多數(shù)革蘭陰性菌和陽性菌的肽聚糖中均存在[10]。而同含有CARD結(jié)構(gòu)域的NLRC蛋白在N端另含一個高度保守的、和凋亡信號傳導有關(guān)的、被稱為死亡結(jié)構(gòu)域(Death domain，DD)的折疊區(qū)[11]。值得一提的是，近期發(fā)現(xiàn)NLRC5能上調(diào)主要組織相容性復合體Ⅰ(Major histocompatibility complex-Ⅰ,MHCⅠ)基因的轉(zhuǎn)錄，這在免疫耐受調(diào)控領(lǐng)域成為新熱點[12]。

NLRP亞家族N端的PYD結(jié)構(gòu)域可激活胱天蛋白酶1(caspase-1)，介導早期反應性細胞因子IL-1β的活化與釋放。這個過程通過NLR蛋白炎性體(NLRs protein inflammasome)介導。炎性體由NLR、接頭蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)及前體胱天蛋白酶1組成，其中ASC蛋白的PYD結(jié)構(gòu)域和CARD結(jié)構(gòu)域可分別結(jié)合與NLRP和pre-caspase-1相同的結(jié)構(gòu)域[13]。當LRRs識別配體后，pre-caspase-1被激活并剪切為成熟的caspase-1，同時促進IL-1β和IL-18的成熟與分泌，激活炎癥反應[14]。在NLRP亞家族中，NLRP3有20余種配體，包括ATP、膽固醇結(jié)晶、尿酸鹽結(jié)晶、菌毛蛋白、dsDNA等[15]，受到較多關(guān)注。

NLRA、NLRB和NLRX亞家族的報道較少。NLRA亞家族的CⅡTAs主要通過上調(diào)MHCⅡ類分子的表達，調(diào)節(jié)適應性免疫應答[16]。NLRB亞家族的NAIP是一類凋亡抑制蛋白，能夠阻止細胞凋亡[17]。而NLRX亞家族的NLRX則可增強線粒體活性，產(chǎn)生更多活性氧和自由基發(fā)揮抗感染功能[18]。

2 免疫耐受

免疫耐受(Immune tolerance)是免疫系統(tǒng)在抗原刺激下不能激活，從而不能執(zhí)行免疫應答的現(xiàn)象。按形成機制，可分為中樞耐受(Central tolerance)和外周耐受(Peripheral tolerance)，前者指未成熟淋巴細胞在中樞免疫器官遭遇自身抗原形成的耐受，后者指成熟淋巴細胞在外周免疫器官接觸內(nèi)外源性抗原形成的耐受[19]。目前認為中樞耐受是由于在中樞免疫器官中，未成熟淋巴細胞經(jīng)過陰性選擇(Negative selection)，表面MHC分子與接觸的自身抗原發(fā)生高親和力結(jié)合者均被克隆清除(Deletion)所致[20]。而外周耐受的機制則存在多種理論，包括克隆清除、免疫忽視(Immunological ignorance)、克隆失能、免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導障礙、免疫隔離(Immunological privileged)、免疫抑制等，目前認為其形成是多種因素調(diào)節(jié)免疫網(wǎng)絡的共同作用結(jié)果[21]。同時，外周耐受的形成與抗原和機體因素密切相關(guān)，其中抗原因素包括劑量、性狀、接觸途徑、存在時間、表位特點及表位變異等，而機體因素則包括遺傳背景和發(fā)育年齡(越接近胚胎期越易形成耐受)[22]。免疫耐受的失調(diào)會造成多種疾病，如耐受狀態(tài)的破壞會導致移植物排斥、自身免疫性疾病及超敏反應，而慢性感染持續(xù)狀態(tài)及免疫逃避的腫瘤細胞均和耐受狀態(tài)的形成有關(guān)[23]。因此，對免疫耐受的研究具有積極的臨床意義。

3 NLR與免疫耐受

目前針對NLR與免疫耐受領(lǐng)域的研究主要集中于NLRC亞家族的NOD蛋白和NLRP亞家族的NLRP3蛋白，而NLRA亞家族的CⅡTAs和NLRC亞家族的NLRC蛋白近期亦有研究所涉及。

3.1NOD和免疫耐受 現(xiàn)關(guān)于NOD蛋白和免疫耐受的報道多集中于自身免疫性疾病和超敏反應，包括2型糖尿病、哮喘及克羅恩病(Crohn′s disease,CD)等。2型糖尿病的胰島素抵抗被認為與自身免疫因素有關(guān)。Shiny等[24]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者體內(nèi)i-EDAP和MDP表達顯著升高；體外實驗顯示NOD1和NOD2蛋白能通過RIPK2和NF-κB等促炎信號增加TNF-α和IL-6的釋放，促進單核細胞表達活化標記物CD11b和CD36，而活化單核細胞水平則與胰島素抵抗的程度呈正相關(guān)。可見單核細胞中的NOD蛋白介導的炎癥反應可破壞機體耐受狀態(tài)，與2型糖尿病的胰島素抵抗相關(guān)。氣道對過敏原耐受程度低是造成哮喘等呼吸道超敏反應性疾病的原因。Duan等[25]發(fā)現(xiàn)，胸腺基質(zhì)淋巴細胞中的NOD2蛋白識別PAMP后， IL-25分泌增加，并表達T細胞共刺激配體OX40，促進Th1細胞的分化，激活適應性免疫，破壞氣道耐受環(huán)境。

而NOD蛋白在CD中的作用則比較復雜。CD是一種自身免疫性腸病，與黏膜免疫失調(diào)有關(guān)，而NOD2蛋白的慢性刺激則介導腸道黏膜對腸道菌群耐受性誘導和維持[26]。Strober等[27]發(fā)現(xiàn)，CD患者NOD2基因多表現(xiàn)為多態(tài)性，其功能缺失導致小腸黏膜潘氏細胞分泌α防御素減少，造成腸道菌群失調(diào)，激活適應性應答，破壞黏膜耐受狀態(tài)；而功能正常的NOD2蛋白則可防止腸道過度炎癥反應的發(fā)生。但是腸道菌群的作用及調(diào)節(jié)機制迄今尚未明晰，故NOD2在CD中的作用并非絕對，如Kim等[28]發(fā)現(xiàn)，志賀桿菌PGN(Shigella flexneri PGN,flexPGN)正是通過NOD2途徑激活NF-κB誘導CD的發(fā)生，而使用能夠抑制免疫應答的植物乳桿菌脂磷壁酸(Lactobacillus plantarum lipoteichoic acid,pLTA)處理單核細胞系THP-1細胞，結(jié)果NOD2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達均顯著下降?？梢?，關(guān)于NOD蛋白在腸道黏膜免疫耐受狀態(tài)中的作用，需根據(jù)機制具體分析，如Cantó等[29]認為CD的發(fā)生與NOD2通路和TLR4通路平衡的破壞有關(guān)，任意一方的過度活化均會破壞耐受狀態(tài)，此為CD發(fā)生的危險因素。

3.2NLRP3和免疫耐受 NLRP蛋白主要通過形成炎性體發(fā)揮作用，目前關(guān)注最多的是NLPR3與胰島素耐受及中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病的關(guān)系。肥胖患者易發(fā)生糖耐量異常和胰島素抵抗，這被認為與過量脂肪導致的輕微炎癥反應破壞免疫耐受的內(nèi)環(huán)境有關(guān)。Healy等[30]發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體能促進釋放IL-1β誘導胰島素耐受，而在高脂喂養(yǎng)小鼠中使用酪蛋白水解物(Casein hydrolysate,CH)降低caspase-1蛋白活性后，IL-1β表達降低，AkT磷酸化水平升高，小鼠對胰島素的敏感性提高。類似的，Mocanu等[31]發(fā)現(xiàn)肥胖大鼠空腸-Roux-en-Y胃旁路手術(shù)后90 d脂肪組織中NLPR3、caspase-1、ASC等炎性體成分及IL-1β、IL-6、IL-18、MCP-1等炎性因子表達均顯著降低，同時血糖控制情況良好，胰島素抵抗減輕。Chi等[32]在胰島素抵抗的燒傷大鼠模型中及Vandanmagsar等[33]在對人類患者的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)論。

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis,MS)是一類自身免疫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，與免疫耐受的破壞關(guān)系密切。Inoue等[34]發(fā)現(xiàn)NLRP3能通過促進IL-1β的分泌誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)適應性免疫細胞的聚集，而在NLRP3敲除小鼠上建立的實驗性變應性腦炎(Experimental allergic encephalitis,EAE)模型中脫髓鞘現(xiàn)象減輕，Th1和Th17細胞的比例均減少，可見NLRP3對免疫耐受的破壞與MS的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

3.3CⅡTAs和免疫耐受 CⅡTAs可以特異性上調(diào)MHCⅡ類分子的表達，在移植免疫耐受領(lǐng)域得到更多關(guān)注。Liu等[35]在大鼠肝移植模型中沉默受體CⅡTAs，發(fā)現(xiàn)IL-2等炎癥細胞因子和MHC-Ⅱ類分子表達顯著下降，移植肝的存活時間更長，提示移植耐受的形成。而Yang等[36]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，突變的Ⅱ型反式激活子(mutants of classⅡtransactivator,mCⅡTAs)能促進IL-33等細胞因子的釋放，誘導Th2細胞的分化，使Th2/Th1比例升高，增加IL-4、IL-10等炎癥抑制因子的表達，抑制Th1細胞功能，有利于移植耐受的誘導和維持?？梢娨种艭ⅡTAs表達有利于移植耐受的形成，但此類研究甚少，仍需更多的實驗數(shù)據(jù)支持。

3.4NLRC和免疫耐受 目前認為NLRC蛋白在抗感染免疫和移植免疫中有一定意義。綠膿桿菌可分泌幾丁質(zhì)3樣1(Chitinase 3-Like 1,Chi3L1)誘導免疫耐受，限制宿主的炎癥反應，故導致的醫(yī)院獲得性肺炎死亡率很高。Marion等[37]發(fā)現(xiàn)，Chil1可與宿主的IL-13受體結(jié)合，抑制NLRC4活性，阻止炎癥反應的產(chǎn)生，形成免疫耐受；而敲除Chil1后，IL-1β和TNF-α表達顯著升高，細菌在宿主中的免疫耐受狀態(tài)被破壞。可見破壞病原體在宿主中的耐受狀態(tài)是防止病原體感染加重或慢性化的方法之一。而Ludigs等[38]發(fā)現(xiàn)，處于免疫耐受狀態(tài)的NLRC5缺陷小鼠和MHCⅠ缺陷小鼠的自然殺傷細胞(Natural killer cells,NK cells)表面的可清除活化T淋巴細胞的抑制性受體均增多，提示NLRC5可能通過增加T細胞表面MHCⅠ類分子表達，保護其免遭NK細胞清除。故抑制NLRC5表達或阻斷其信號通路，可激活機體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，阻止免疫應答的增強，進而維持免疫耐受狀態(tài)。

4 小結(jié)與展望

NLR蛋白家族在固有免疫領(lǐng)域發(fā)揮重要作用，其可識別PAMP，激活免疫系統(tǒng)，破壞免疫耐受狀態(tài)；而設(shè)法抑制NLR的功能則有利于免疫耐受狀態(tài)的形成。利用NLR這一特點，我們可以誘導或破壞免疫耐受狀態(tài)，以糾正移植排斥、超敏反應、自身免疫性疾病、感染或腫瘤免疫逃逸等臨床問題。但是，關(guān)于NLR對免疫耐受的影響，其研究尚處于細胞、動物實驗階段，尚未有臨床應用探索；且其機制仍未完全明晰，故仍須更深入的研究。

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[收稿2016-10-09]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.026

①本文為國家自然科學基金面上項目(81370574、81670591)和廣東省自然科學基金重點項目(2016A030311028)。

章旭之(1992年-)，男，在讀碩士，主要從事移植免疫方面的研究，E-mail：zhxuzh@foxmail.com。

及指導教師：馬 毅(1968年-)，男，醫(yī)學博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事移植免疫的研究，E-mail：anhuimayi2002@163.com。

R392

A

1000-484X(2017)06-0930-04