王曉驍， 邱滿堂， 夏文佳， 王思煒， 王 潔， 尹 榮， 許 林

論 著

非小細(xì)胞肺癌中長鏈非編碼RNA AFAP1-AS1的表達(dá)特征及其與患者預(yù)后的關(guān)系

王曉驍， 邱滿堂， 夏文佳， 王思煒， 王 潔， 尹 榮， 許 林

目的 觀察長鏈非編碼RNAAFAP1-AS1在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)中的表達(dá)，探討AAFAP1-AS1與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系。方法 選取82例病理學(xué)確診為NSCLC患者的癌組織及癌旁組織，制作組織芯片，檢測AFAP1-AS1在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)。通過Cox單因素和多因素回歸模型分析AFAP1-AS1與NSCLC預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 AFAP1-AS1在NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)高于癌旁組織，并且AFAP1-AS1高表達(dá)的患者預(yù)后明顯差于AFAP1-AS1低表達(dá)患者(P<0.05)。結(jié)論 AFAP1-AS1在NSCLC腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，可作為判斷NSCLC預(yù)后的重要指標(biāo)。

AFAP1-AS1； 長鏈非編碼RNA； 非小細(xì)胞肺癌； 組織芯片

越來越多的研究表明非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移中起著重要的作用，其中，長鏈非編碼RNA參與了腫瘤很多生物進(jìn)程[1-2]。長鏈非編碼RNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個(gè)核苷酸的不能編碼蛋白質(zhì)的RNA，很長一段時(shí)間被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”[3-4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)許多長鏈非編碼RNA的調(diào)節(jié)異常在腫瘤的演變中起著決定性的作用。例如HOTAIR[5-6]、MALAT1[7-8]、CCAT2[9]等lncRNA與肺癌的發(fā)生、侵襲與轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)，可作肺癌診斷的生物標(biāo)志物。在前期研究中，我們通過基因芯片尋找與肺癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA，發(fā)現(xiàn)AFAP1-AS1在肺癌中表達(dá)顯著上調(diào)。AFAP-AS1與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后尚未明確報(bào)道。本次研究首次通過制作AFAP1-AS1的肺癌組織芯片，檢測其在非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer，NSCLC)患者組織中的表達(dá)，分析AFAP1-AS1與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2005—2012年在江蘇省腫瘤醫(yī)院行外科治療的非小細(xì)胞肺癌患者82例，排除8例丟失臨床數(shù)據(jù)或隨訪記錄后，男55例、女19例，年齡<60歲33例、≥60歲41例?；颊咝g(shù)前均未行放化療，并且未服用過靶向治療藥物?；颊咝g(shù)后診斷均依據(jù)病理學(xué)檢查結(jié)果。TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期52例，Ⅲ、Ⅳ期22例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例。

1.2 肺癌組織芯片評價(jià) AFAP1-AS1表達(dá)患者行肺癌切除術(shù)后留取肺癌組織及癌旁組織，制作福爾馬林固定和石蠟包埋的組織芯片(上海芯超股份有限公司，中國上海)。使用AFAP1-AS1探針(Exiqon, Vedbaek, Denmark)進(jìn)行原位分子雜交，組織芯片置于60 ℃溫箱中1 h，4 ℃儲存過夜。然后放于二甲苯和乙醇溶液中用蛋白酶K室溫下孵育7.5 min。孵育后，在50 ℃環(huán)境下用濃度為1 000 nmol/L的AFAP1-AS1探針在雜交緩沖液中雜交20 min，結(jié)束后用洗脫液清洗玻片。所有步驟遵循制造廠商的流程說明。依據(jù)玻片的染色面積和染色強(qiáng)度進(jìn)行評分[10]：染色面積<10%為1分，≥10%～<30%為2分，≥30%～<50%為3分，≥50%～<75%為4分，≥75%為5分。染色強(qiáng)度：無染色為0分，輕度染色為1分，輕中度染色為2分，中度染色為3分，中重度染色為4分，重度染色為5分。將染色面積與染色強(qiáng)度相乘得到組織芯片總分，然后用肺癌組織評分減去癌旁組織評分得到該患者的AFAP1-AS1評分，根據(jù)結(jié)果將AFAP1-AS1表達(dá)水平分為高表達(dá)(≥6分)和低表達(dá)(<6分)[11]。組織芯片評分由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立判定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。生存數(shù)據(jù)使用Cox回歸分析，并繪制Kaplan-Meier曲線。P<0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA AFAP1-AS1在組織中的表達(dá) 表1顯示免疫組化評分結(jié)果，在肺癌組織中，AFAP1-AS1評分0～5分的有3例，6～10分有19例，11～15分有30例，16～20分有22例；相比較而言，在癌旁非腫瘤組織中，AFAP1-AS1評分0～5分的有23例，6～10分有35例，11～15分有16例，16～20分0例。以上結(jié)果提示AFAP1-AS1在肺癌組織中的表達(dá)明顯較癌旁組織多，肺癌組織中AFAP1-AS1的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.01)。

表1 肺癌患者癌與癌旁組織芯片AFAP1-AS1表達(dá)評分統(tǒng)計(jì)(例)

2.2 肺癌組織AFAP1-AS1高表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 單因素生存分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及AFAP1-AS1表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性患者及AFAP1-AS1高表達(dá)的患者預(yù)后明顯差于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性及AFAP1-AS1低表達(dá)的患者(P<0.05)。后續(xù)多因素生存分析亦證明了此結(jié)論(表2)。相比較而言，分層生存分析顯示：性別、年齡、吸煙、腫瘤分化及TNM分期與患者的總體預(yù)后無明顯相關(guān)性。Kaplan-Meier分析進(jìn)一步顯示AFAP1-AS1高表達(dá)生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

目前，肺癌的發(fā)病率在我國男性和女性腫瘤患者中分別排第一位和第二位，并且是病死率最高的惡性腫瘤[12]。由于肺癌早期診斷和轉(zhuǎn)移缺少有效的分子標(biāo)志物，往往患者就診時(shí)已經(jīng)是肺癌晚期[13]。盡管目前肺癌的治療方式越來越多，但非小細(xì)胞肺癌的5年生存率只有11%～15%[14-15]。因此，與肺癌早期診斷和預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物是解決肺癌診斷與治療問題的重要切入點(diǎn)。

表2 單變量和多變量分析影響肺癌患者預(yù)后的因素

圖1 AFAP1-AS1表達(dá)水平與NSCLC患者生存曲線

近幾年來，很多的研究表明lncRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用，lncRNA可能作為新的腫瘤生物標(biāo)志物[1-2, 16]。在肺癌中，研究比較多的lncRNA有HOTAIR[5-6]、MALAT1[7-8]等，這些lncRNA已經(jīng)被認(rèn)可是肺癌的生物標(biāo)志物。在本次研究中，我們通過芯片分析發(fā)現(xiàn)lncRNA AFAP1-AS1在NSCLC患者中表達(dá)上調(diào)。根據(jù)組織芯片評分發(fā)現(xiàn)肺癌組織中AFAP1-AS1的表達(dá)明顯高于癌旁組織。同時(shí)AFAP1-AS1高表達(dá)的NSCLC患者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者，AFP1-AS1高表達(dá)是提示肺癌預(yù)后差的標(biāo)志?？梢?，AFAP1-AS1在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。但目前對AFAP1-AS1在NSCLC中的作用機(jī)制研究尚未涉及，在后續(xù)試驗(yàn)中我們將通過體外實(shí)驗(yàn)在肺癌細(xì)胞中過表達(dá)和沉默AFP1-AS1的表達(dá)，進(jìn)一步研究AFAP1-AS1在NSCLC的作用機(jī)制?？傊?，本次研究表明AFAP1-AS1可作為判斷NSCLC預(yù)后的重要指標(biāo)。

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Expression profile and prognostic value of long non-coding RNA AFAP1-AS1 in non-small cell lung cancer

WANG Xiaoxiao1,QIU Mantang2, XIA Wenjia2,WANG Siwei2, WANG Jie2, YIN Rong2,XU Lin2.

(1. GCP Center, Jiangsu Province Hospital of TCM, Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM, Nanjing 210029, China；2. Department of Thoracic Surgery, Nanjing Medical University Affiliated Jiangsu Cancer Hospital, Jiangsu Key Laboratory of Molecular and Translational Cancer Research, Cancer Institute of Jiangsu Province, Nanjing 210009, China)

XULin,E-mail:xulin83cn@gmail.com

Objective To characterize the expression of long non-coding RNA (lncRNA) AFAP1-AS1 in non-small cell lung cancer (NSLCC) and to explore the relationship between AFAP1-AS1 expression and prognosis of NSCLC. Methods Pathologically diagnosed NSCLC tissues and paired adjacent non-tumor tissues were collected and fixed on tissue microarray. Univariate and multi-variateCoxregression were used to analyze the correlation between AFAP1-AS1 expression and NSCLC survival. Results Expression of AFAP1-AS1 was significantly higher in NSCLC tissues compared with non-tumor tissues. Patients with high expression level of AFAP1-AS1 had poor survival than those with low expression level(P<0.05).Conclusions The expression level of AFAP1-AS1 is up-regulated in NSCLC tissues and AFAP1-AS1 could be a prognostic biomarker for NSCLC.

AFAP1-AS1； Long non-coding RNA； Non-small cell lung cancer； Tissue microarray

國家自然科學(xué)基金資助(81572261)

210029 江蘇 南京，江蘇省中醫(yī)院、南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床藥物臨床試驗(yàn)中心(王曉驍)； 210009 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇省腫瘤醫(yī)院 胸外科，江蘇省惡性腫瘤分子生物學(xué)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(邱滿堂，夏文佳，王思煒，王 潔，尹 榮，許 林)

王曉驍，男，住院醫(yī)師，研究方向：腫瘤相關(guān)藥物臨床實(shí)驗(yàn)，E-mail：tall42005@163.com

許 林，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，國家級重點(diǎn)學(xué)科胸外科帶頭人，中國抗癌協(xié)會肺癌專業(yè)委員會常務(wù)委員，研究方向：胸腔腫瘤的外科治療，E-mail：xulin83cn@gmail.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2016.05.005

1674-4136(2016)05-0298-04

2016-09-03][本文編輯：李筱蕾]