張 軍， 代文靜， 周敬群， 張家俊， 曹志剛

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院 1ICU科， 2心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443000)

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抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用*

張 軍1△， 代文靜2， 周敬群2， 張家俊1， 曹志剛1

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院1ICU科，2心血管內(nèi)科，湖北 宜昌 443000)

目的： 研究抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法: 體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，設(shè)置PBS對照組、5.5 mmol/L葡萄糖組、33.3 mmol/L葡萄糖組、0.1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組、1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組和10 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組。使用MTT法檢測各組細(xì)胞活力；同時(shí)檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中丙二醛(MDA)的含量以及乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和還原型谷胱甘肽(GSH)的活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞中活性氧(ROS)含量變化；ELISA檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮(NO)、內(nèi)皮素1(ET-1)和細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)的濃度變化；Western blot法檢測各組細(xì)胞中核因子κB(NF-κB)蛋白的表達(dá)。結(jié)果: 與PBS對照組相比，33.3 mmol/L葡萄糖能夠顯著降低HUVECs的細(xì)胞活力，增加細(xì)胞中ROS的含量，增加細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性和MDA含量,降低SOD和GSH的活性，同時(shí)降低NO分泌，誘導(dǎo)ET-1、ICAM-1分泌及細(xì)胞中NF-κB蛋白的表達(dá)(P<0.05)。不同濃度Klotho蛋白和33.3 mmol/L高糖同時(shí)作用HUVECs時(shí)，細(xì)胞活力逐漸上升，ROS和MDA含量以及LDH活性逐漸下降， SOD和GSH活性則逐漸上升，同時(shí)NO分泌增加，ET-1、ICAM-1分泌及NF-κB蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。結(jié)論: 抗衰老Klotho蛋白能夠提升高糖作用下HUVECs的細(xì)胞活力，減少高糖誘導(dǎo)的ROS生成及氧化損傷，恢復(fù)HUVECs的正常分泌功能，并通過減少NF-κB蛋白表達(dá)發(fā)揮抗損傷作用。

高糖； Klotho蛋白； 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； 動(dòng)脈粥樣硬化

糖尿病患者由于血糖濃度較高，極易導(dǎo)致血管并發(fā)癥，其較非糖尿病患者心血管病發(fā)病率及病死率高2到3倍。長期高血糖導(dǎo)致的血管動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病患者死亡率上升的主要原因之一[1]。糖尿病性并發(fā)心血管疾病由于發(fā)病病因、機(jī)制、病理表現(xiàn)復(fù)雜尚無有效的防治方法，多發(fā)于中老年人群，提示機(jī)體衰老因素可能參與到糖尿病并發(fā)心血管疾病病因中。Klotho蛋白是一種新型與抗衰老相關(guān)的蛋白，對于抵抗機(jī)體衰老發(fā)揮重要作用[2]。已有研究表明分泌型Klotho蛋白能夠抑制機(jī)體衰老、發(fā)揮抗氧化、抗凋亡作用并保護(hù)心血管、腎臟等系統(tǒng)，從而對多種衰老相關(guān)疾病進(jìn)行調(diào)節(jié)[3]。目前，由高血糖引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣硬化等心血管并發(fā)癥的明確機(jī)制及有效防治方法尚不明確。因此，本研究以高濃度葡糖糖作用于人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)模擬糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞受損狀態(tài)，研究人抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs損傷的影響，為驗(yàn)證抗衰老因素在糖尿病并發(fā)血管內(nèi)皮損傷疾病防治中發(fā)揮作用提供新依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

HUVECs購自中科院細(xì)胞資源中心(細(xì)胞培養(yǎng)級，CD31/vWF陽性率≥95%)；RMPI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清和EDTA胰酶購自HyClone；人Klotho蛋白購自R&D；MTT、二甲基亞砜(DMSO)和雙氫羅丹明123購自Sigma；乳酸脫氫酶(lactate dehydroge-nase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；一氧化氮(nitric oxide，NO)ELISA試劑盒購自上海凱博生化試劑公司；內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)和細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)檢測ELISA試劑盒購自武漢華美生物公司；兔抗人核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和β-actin多克隆抗體購自Abcam；HRP標(biāo)記II抗和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自北京中杉金橋公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 MTT法檢測細(xì)胞活力 復(fù)蘇活化凍存的HUVECs，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。選取增殖期狀態(tài)良好的HUVECs，胰酶消化后用培養(yǎng)基稀釋濃度至107/L種于96孔板中。細(xì)胞分組為PBS對照組、5.5 mmol/L葡萄糖組、33.3 mmol/L葡萄糖組、0.1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組、1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組和10 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖組。每組設(shè)置6個(gè)平行孔，分別加藥處理24 h和48 h。每孔加入20 μL的MTT溶液繼續(xù)溫育4 h后，去除培養(yǎng)基加入DMSO，振蕩5 min后在酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在波長492 nm處的吸光度(A)。

2.2 LDH、MDA、SOD和GSH的檢測 按照相同的分組方法將增殖期的HUVECs以1×108/L分組處理培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，利用比色法檢測試劑盒檢測HUVECs細(xì)胞分別經(jīng)5.5、33.3 mmol/L葡萄糖及33.3 mmol/L葡萄糖與0.1、1、10 μmol/L Klotho蛋白聯(lián)合作用后對細(xì)胞分泌LDH、MDA、SOD和GSH的影響。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成的變化 以同樣分組方法將HUVECs等量接種于不同培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后經(jīng)5.5、33.3 mmol/L葡萄糖及33.3 mmol/L葡萄糖與0.1、1、10 μmol/L Klotho蛋白聯(lián)合處理48 h后消化收集細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次后，分別在各組細(xì)胞中加入1 μmol/L的雙氫羅丹明123孵育1 h，孵育完成后離心收集細(xì)胞并用PBS洗滌1次。各組細(xì)胞內(nèi)活性氧可將雙氫羅丹明123氧化為羅丹明123發(fā)出熒光，以連續(xù)傳代處于對數(shù)期的HUVECs中熒光量為陰性對照，利用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞中熒光陽性率反映各組HUVECs細(xì)胞內(nèi)ROS變化情況。

2.4 ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO、ET-1和ICAM-1含量的變化 將HUVECs分組接種于6孔板中后，按相同的分組分別用5.5、33.3 mmol/L葡萄糖及33.3 mmol/L葡萄糖與0.1、1、10 μmol/L Klotho蛋白聯(lián)合處理48 h，同時(shí)設(shè)置PBS空白對照。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液按照ELISA試劑盒說明書檢測各組HUVECs經(jīng)處理后NO、ET-1和ICAM-1分泌量的變化。

2.5 Western blot法檢測NF-κB的蛋白表達(dá) 按照相同方法和分組處理培養(yǎng)的HUVECs，48 h后消化收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后利用RAPI蛋白提取液提取各組細(xì)胞中總蛋白。BCA試劑盒測定各組細(xì)胞中總蛋白。每組上樣30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜封閉后分別孵育抗NF-κB和β-actin的 I 抗4 ℃過夜，TBST洗滌后孵育HRP標(biāo)記 II 抗2 h，TBST洗滌2次后ECL化學(xué)發(fā)光顯影拍照。利用Quantity One 軟件分析NF-κB蛋白相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。在方差齊性檢驗(yàn)后各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs細(xì)胞活力的影響

與空白對照組HUVECs細(xì)胞相比，5.5 mmol/L葡萄糖單獨(dú)處理HUVECs細(xì)胞24 h和48 h后細(xì)胞的A值有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；而33.3 mmol/L葡萄糖單獨(dú)處理組中HUVECs細(xì)胞的A值均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。當(dāng)不同濃度抗衰老Klotho蛋白與33.3 mmol/L葡萄糖同時(shí)作用于HUVECs細(xì)胞時(shí)，可以顯著提升細(xì)胞A值。與33.3 mmol/L葡萄糖單獨(dú)作用組相比，1、10 μmol/L Klotho蛋白作用24 h細(xì)胞的A值顯著上升(P<0.05)，而0.1、1、10 μmol/L Klotho蛋白作用48 h時(shí)細(xì)胞A值均顯著上升(P<0.05)。說明抗衰老Klotho蛋白可以促進(jìn)高糖作用下?lián)p傷的HUVECs細(xì)胞活力的上升，見圖1。

Figure 1.The effect of Klotho protein on the activity of HUVECs treated with high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

圖1 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs活力的影響

2 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs中LDH、MDA、SOD和GSH的影響

如圖2所示，與PBS對照組相比，33.3 mmol/L葡萄糖作用下，HUVECs分泌LDH活力和MDA含量顯著上升，而SOD和GSH活力則顯著下降(P<0.05)。當(dāng)0.1、1、10 μmol/L抗衰老Klotho蛋白和33.3 mmol/L葡萄糖同時(shí)作用時(shí)，HUVECs分泌LDH活力和MDA含量均逐漸降低，而SOD和GSH活力則逐漸上升，且具有濃度依賴效應(yīng)(P<0.05)。

Figure 2.The effect of Klotho protein on the content of MDA, and the activities of LDH, SOD and GSH in the culture supernatants of HUVECs treated with high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

圖2 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs分泌LDH、MDA、SOD、GSH的影響

3 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs中ROS生成的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)抗衰老Klotho蛋白可以抑制高糖誘導(dǎo)下HUVECs產(chǎn)生的ROS，結(jié)果見圖3。與PBS對照組相比，5.55 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生ROS不明顯，但33.3 mmol/L葡萄糖組中產(chǎn)生ROS的量則顯著上升(P<0.05)。當(dāng)抗衰老Klotho蛋白和高濃度葡萄糖同時(shí)作用于HUVECs時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS有所下降，并隨著Klotho作用濃度的升高ROS含量逐漸降低，與高糖單獨(dú)作用組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。這說明Klotho蛋白能夠減少高糖對HUVECs氧化損傷產(chǎn)生的ROS。

Figure 3.The effect of Klotho protein on the ROS production in the HUVECs treated with high glucose. A: PBS control; B: 5.5 mmol/L glucose; C: 33.3 mmol/L glucose; D: 0.1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose; E: 1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose; F: 10 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

圖3 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs細(xì)胞ROS生成的影響

4 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs培養(yǎng)上清中NO、ET-1和ICAM-1的影響

ELISA方法檢測抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs培養(yǎng)上清中的NO、ET-1和ICAM-1含量，結(jié)果見表1。與PBS對照組相比，5.5 mmol/L葡萄糖作用組中HUVECs分泌NO、ET-1及ICAM-1含量的變化較小，但33.3 mmol/L葡萄糖作用組HUVECs中NO含量顯著降低，而ET-1和ICAM-1含量顯著上升(均P<0.05)。當(dāng)不同濃度Klotho蛋白和33.3 mmol/L高糖同時(shí)作用于HUVECs細(xì)胞時(shí)，隨著Klotho濃度的升高，NO含量逐漸上升而ET-1和ICAM-1含量逐漸下降，與高糖單獨(dú)作用組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。

5 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs中NF-κB蛋白表達(dá)的影響

通過Western blot法檢測抗衰老Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs中NF-κB表達(dá)的影響，結(jié)果見圖4。低濃度5.5 mmol/L和高濃度33.3 mmol/L葡萄糖作用HUVECs時(shí)，細(xì)胞中NF-κB蛋白均顯著上升，且高糖作用組中上升更為明顯(P<0.05)。但當(dāng)不同濃度Klotho蛋白和33.3 mmol/L高糖同時(shí)作用HUVECs時(shí)，細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白則顯著下降，隨著Klotho作用濃度的升高，NF-κB表達(dá)漸下降，與高糖單獨(dú)作用組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。

表1 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs培養(yǎng)上清中NO、ET-1和ICAM-1含量的影響

Table 1.The effect of Klotho protein on the concentrations of NO, ET-1 and ICAM-1 in the culture supernatants of HUVECs treated with high glucose (Mean±SD.n=6)

GroupNO(μmol/L)ET?1(mmol/L)ICAM?1(μg/L)PBScontrol93．58±4．850．57±0．053．63±0．235．5mmol/Lglucose85．43±6．750．62±0．123．95±0．3533．3mmol/Lglucose54．17±5．17?0．97±0．06?8．64±0．47?0．1μmol/LKlotho+33．3mmol/Lglucose67．33±3．48#0．85±0．047．33±0．27#1μmol/LKlotho+33．3mmol/Lglucose75．29±4．19#0．71±0．08#5．37±0．30#10μmol/LKlotho+33．3mmol/Lglucose83．45±3．98#0．64±0．07#4．11±0．46#

*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

Figure 4.The effect of Klotho protein on NF-κB protein expression in HUVECs treated with high glucose. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsPBS control;#P<0.05vs33.3 mmol/L glucose.

圖4 Klotho蛋白對高糖作用下HUVECs NF-κB表達(dá)的影響

討 論

糖尿病患者常常引發(fā)血管并發(fā)癥，因?yàn)槠溲軆?nèi)慢性高血糖水平容易使血管內(nèi)皮細(xì)胞喪失正常生理功能，血管內(nèi)皮功能損傷被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)病起始因素，可以導(dǎo)致機(jī)體多發(fā)性器官病變[4]。而糖尿病及心血管疾病多發(fā)于老年人群，相比于青少年群體，其發(fā)病率和死亡率均較高，提示機(jī)體衰老因素與血管性疾病病因有關(guān)聯(lián)[5]?？顾ダ螷lotho蛋白是一種與人類衰老相關(guān)的蛋白因子，有膜型和分泌型兩種形式。分泌型Klotho蛋白可作為抗衰老調(diào)節(jié)激素對多種靶器官發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，研究表明它能夠保護(hù)心血管系統(tǒng)，對衰老等多種相關(guān)疾病進(jìn)行調(diào)節(jié)[6]。進(jìn)一步研究表明，Klotho蛋白與人類心血管疾病、癌癥、腎損傷等多種代謝疾病都有密不可分的關(guān)系，前期研究中已發(fā)現(xiàn)Klotho蛋白能夠抑制高糖作用下內(nèi)皮細(xì)胞的衰老和凋亡，但關(guān)于其是否在高糖引起的血管內(nèi)皮損傷氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用尚未見研究[7]。本研究中以不同濃度葡萄糖作用于HUVECs模擬糖尿病人受損血管內(nèi)皮，MTT檢測可以發(fā)現(xiàn)33.3 mmol/L高濃度葡萄糖作用組中HUVECs細(xì)胞活力顯著下降，而當(dāng)Klotho蛋白與高糖同時(shí)作用于HUVECs時(shí)，細(xì)胞活力卻能夠顯著上升，說明抗衰老Klotho蛋白能夠減輕高糖對HUVECs的損傷作用。

動(dòng)脈粥樣硬化等心血管障礙性疾病都與血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)，而糖尿病患者由于血管內(nèi)血糖濃度過高，使血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS增多而加速其損傷程度[8]。本文通過流式細(xì)胞術(shù)檢測也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)不同濃度葡糖糖單獨(dú)作用于HUVECs時(shí)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的含量會(huì)顯著上升，說明高糖能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的ROS。而當(dāng)抗衰老Klotho蛋白同時(shí)作用于HUVECs時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS含量逐漸下降，并具有明顯的濃度效應(yīng)，說明Klotho蛋白有助于減少高糖引起的HUVECs細(xì)胞ROS損傷。同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化生理功能還能通過LDH、MDA、SOD及GSH反映出來。LDH在細(xì)胞內(nèi)糖分解和異生中起著重要作用，其分泌的多少反映機(jī)體氧化損傷的嚴(yán)重程度[9]。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化的敏感指標(biāo)，水平的高低可以反映細(xì)胞的氧化損傷程度，而細(xì)胞內(nèi)存在的抗氧化系統(tǒng)SOD和GSH可以對抗氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷[10]。本研究中不同濃度Klotho蛋白和高糖同時(shí)作用于HUVECs時(shí)，與高糖單獨(dú)損傷組相比，細(xì)胞中LDH和MDA水平顯著下降，而抗氧化SOD和GSH活性均明顯上升，說明抗衰老Klotho蛋白作用于高糖損傷的HUVECs，能夠刺激其抗氧化損傷系統(tǒng)發(fā)揮作用，進(jìn)而對氧化損傷的細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)和修復(fù)作用。

正常血管內(nèi)皮細(xì)胞還具有分泌功能，能夠分泌NO、ET-1、ICAM-1等因子，并在動(dòng)脈粥樣硬化形成中發(fā)揮重要作用[11]。NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的重要舒血管物質(zhì)能夠直接反映內(nèi)皮細(xì)胞功能的強(qiáng)弱，而內(nèi)皮素ET-1是機(jī)體內(nèi)強(qiáng)收縮血管物質(zhì)，能夠促進(jìn)血管平滑肌的增生，血管損傷時(shí)會(huì)顯著上升，也可以反映血管的損傷程度[12]。ICAM-1能夠在受損的內(nèi)皮細(xì)胞及血管中斑塊形成處較強(qiáng)表達(dá)，從而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化[13]。研究表明糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，血清中NO分泌含量下降，而ET-1及ICAM-1會(huì)顯著上升[14]。本文研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)高糖作用HUVECs時(shí)，細(xì)胞中NO分泌含量顯著下降，而ET-1及ICAM-1含量均顯著上升，說明高糖損傷HUVECs正常分泌功能。當(dāng)抗衰老Klotho蛋白與高糖同時(shí)作用于HUVECs時(shí)，細(xì)胞分泌NO含量能夠逐漸上升，而ET-1和ICAM-1水平會(huì)漸下降,說明Klotho蛋白能夠恢復(fù)HUVECs正常分泌功能，對于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成有積極作用。同時(shí)有研究[15]表明ROS能夠激活細(xì)胞中NF-κB表達(dá)的上調(diào)，而NF-κB能夠調(diào)節(jié)編碼多種炎癥介質(zhì)的基因，使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答或凋亡，從而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，而通過阻斷NF-κB信號(hào)通路能夠阻止糖尿病血管病變的發(fā)生、發(fā)展。本研究中Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境下HUVECs中NF-κB蛋白表達(dá)上調(diào)，但不同濃度Klotho蛋白能夠逐漸抑制高糖誘導(dǎo)HUVECs中NF-κB蛋白的表達(dá)，說明其保護(hù)高糖下血管內(nèi)皮細(xì)胞可能通過減少NF-κB蛋白表達(dá)阻斷NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)抗衰老Klotho蛋白能夠提升高糖作用下HUVECs細(xì)胞活力，抵抗高糖誘導(dǎo)的氧化損傷，恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞正常分泌功能，從而對血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，并可通過減少NF-κB蛋白表達(dá)發(fā)揮作用。通過本研究能夠?qū)Ω哐且鸬膭?dòng)脈粥樣硬化等心血管并發(fā)癥的防治提供新的視野和思路。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Protective effect of anti-aging Klotho protein on human umbilical vein endothelial cells treated with high glucose

ZHANG Jun1, DAI Wen-jing2, ZHOU Jing-qun2, ZHANG Jia-jun1, CAO Zhi-gang1

(1ICU,2DepartmentofCardiology,RenheHospital,ThreeGorgesUniversity,Yichang443000,China.E-mail:zhoujingqun-1@medmail.com.cn)

AIM: To study the protective effect of anti-aging Klotho protein on human umbilical vein endothe-lial cells (HUVECs) treated with high glucose (HG).METHODS: HUVECs were culturedinvitro, and divided into PBS control group, 5.5 mmol/L glucose group, 33.3 mmol/L glucose group, 0.1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose group, 1 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose group, and 10 μmol/L Klotho+33.3 mmol/L glucose group. The viability of the HUVECs was measured by MTT assay. The content of malondialdehyde (MDA), and the activities of lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and glutathione (GSH) in cell culture supernatants were observed. The production of reactive oxygen species (ROS) in HUVECs was analyzed by flow cytometry. The levels of nitric oxide (NO), endothelin (ET-1), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) in HUVEC culture medium were detected by ELISA. The protein expression of nuclear factor-kappa B (NF-κB) in the HUVECs was determined by Western blot. RESULTS: Compared with PBS control group, 33.3 mmol/L glucose significantly decreased the HUVEC viability, increased ROS, LDH and MDA levels, reduced the activities of SOD and GSH, decreased the NO secretion, and induced the ET-1 and ICAM-1 secretion and the protein expression of NF-κB in HUVECs. When HUVECs were treated with Klotho protein at different concentrations combined with 33.3 mmol/L glucose, the cell viability was increased significantly, the ROS, LDH and MDA levels were decreased significantly, the antioxidant SOD and GSH activities were significantly increased, the secretion of NO was increased, but ET-1 and ICAM-1 releases and protein expression of NF-κB were significantly reduced.CONCLUSION: Anti-aging Klotho protein promotes the viability of HUVECs treated with HG, reduces the oxidative damage and ROS production, and restores the normal secretory function of HUVECs, thus playing a protective role in vascular endothelial cells through reducing the protein expression of NF-κB.

High glucose; Klotho protein; Human umbilical vein endothelial cells; Oxidative stress; Atherosclerosis

1000- 4718(2017)01- 0067- 06

2016- 05- 24

2016- 10- 27

湖北省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. D20091308)

R587.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.011

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