腎穿六胺銀套染馬松三色雙重染色的改進(jìn)

葉美華 方慶全 張海芳

目的 探討改進(jìn)腎穿六胺銀套染馬松三色的染液與染色方法的可行性。方法 收集2015年1月—2016年12月廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科已確診的100例腎穿刺活檢病例的蠟塊，每例蠟塊連續(xù)切片2片，隨機(jī)分為兩組。甲組采用傳統(tǒng)染液與傳統(tǒng)染色法染色，乙組采用改進(jìn)染液與改進(jìn)染色法染色，以百分制評(píng)定200張六胺銀套染馬松三色染色片的得分，統(tǒng)計(jì)各組的得分，結(jié)果用（）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，分析兩組得分的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并比較兩組顯微鏡下的染色結(jié)果。結(jié)果 乙組染色的得分高于甲組[（88．7±9．6）分vs．（72．2±10．3）分]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝11．719，P＜0．001）；乙組切片鏡下顯示腎小球鮑曼囊和毛細(xì)血管襻基膜均呈黑色細(xì)絲狀，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，網(wǎng)狀纖維和彈力纖維呈黑色，免疫復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)與紅細(xì)胞均呈紅色，細(xì)胞間質(zhì)與膠原纖維呈綠色，組織結(jié)構(gòu)清晰，著色均勻，優(yōu)于甲組。結(jié)論 改進(jìn)染液與染色方法使六胺銀套染馬松三色的染色效果好。

腎穿；六胺銀套染馬松三色 ；改進(jìn)

目前，腎臟疾病最可靠的一種診斷方式是穿刺活組織病理檢查，該檢查對(duì)腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制、病變類(lèi)型以及病程進(jìn)展等方面的了解提供了可靠的依據(jù)，對(duì)治療方案的選擇與判斷預(yù)后具有重要意義[1]。腎穿刺活檢組織病理診斷中，光鏡檢查包括蘇木素-伊紅染色（HE）、高碘酸-雪夫氏染色（PAS）、六胺銀染色（PASM）及馬松三色染色（Masson）[2]，其中PASM染色法是重要的檢查方法，能清晰的顯示基底膜增厚“叮突”和“雙軌”等病理變化，又可以顯示腎小球毛細(xì)血管或球囊壁基底膜在炎性損傷中的形態(tài)學(xué)改變[3]。但是，傳統(tǒng)的PASM染色是用HE染色復(fù)染的，對(duì)觀察腎小球中的免疫復(fù)合物的形態(tài)和定位不利，六胺銀套染馬松（PASMMasson）三色染色則能在同一切片上觀察腎小球基底膜的改變，同時(shí)又可觀察免疫復(fù)合物的沉積，所以腎穿刺活檢病理組織切片染色中，PASM-Masson染色是最為重要的染色之一[4]。但在實(shí)際操作過(guò)程中，傳統(tǒng)的PASM-Masson染色效果不理想，不能很好地顯示免疫復(fù)合物沉積情況，基底膜顯色比較重，背景深，染色時(shí)間太長(zhǎng)，而且組織表面常有雜質(zhì)粘附，常常影響病理診斷結(jié)果。由此，筆者對(duì)染液的配制和染色方法等方面進(jìn)行了改進(jìn)，取得很好的效果。

1 資料與方法

1.1 資料

收集2015年1月—2016年12月廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科已確診的100例腎穿刺活檢病例的蠟塊，每例蠟塊連續(xù)切片2片，切片厚1～2 μm，隨機(jī)分為兩組。

1.2 方法

1.2.1 傳統(tǒng)試劑配制 （1）0.5%高碘酸100 ml。（2）8%鉻酸100 ml。（3）1%偏重亞硫酸鈉。（4）5%硝酸銀溶液。（5）3%六次甲基四胺水溶液。（6）5%四硼酸鈉。（7）六胺銀工作液：取0.5 ml的5%硝酸銀溶液緩緩加入到10 ml的3%六次甲基四胺溶液中，立即形成乳白色沉淀，搖動(dòng)沉淀即可溶解變清。再加入2 ml的5%四硼酸鈉溶液，混勻，加入25 ml的蒸餾水，混勻后即可使用。（8）麗春紅酸性復(fù)紅染液：麗春紅0.7 g，酸性品紅0.3 g，蒸餾水99 ml，冰醋酸1 ml。（9）1%亮綠溶液100 ml：亮綠1 g，蒸餾水99 ml，冰醋酸1 ml。（10）2%苯胺藍(lán)染液100 ml：苯胺藍(lán)2 g，蒸餾水98 ml，冰醋酸2 ml[5-6]。

1.2.2 改進(jìn)試劑配制 （1）1%高碘酸100 ml。（2）5%鉻酸100 ml。（3）2.5%草酸100 ml。（4）六次甲基四胺儲(chǔ)備液：5%四硼酸鈉溶液50 ml，3%六次甲基四胺溶液50 ml，5%硝酸銀溶液50 ml。（5）六胺銀工作液：取2 ml的5%硝酸銀溶液，加入18 ml的六次甲基四胺儲(chǔ)備液中，該溶液即變?yōu)槿榘咨珣覞嵋?，再加? ml的四硼酸鈉溶液，此時(shí)該溶液變成澄清透明；最后加入蒸餾水22 ml。（6）1%酸性品紅溶液：酸性品紅1 g，蒸餾水99 ml，冰醋酸1 ml。（7）1%麗春紅溶液：麗春紅1 g，蒸餾水99 ml，冰醋酸1 ml。（8）復(fù)紅液工作液：1%酸性品紅：1%麗春紅按2∶1的比例混合后使用。（9）0.5%亮綠溶液100 ml：亮綠0.5 g，蒸餾水99 ml，冰醋酸1 ml。

1.2.3 傳統(tǒng)染色方法 參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)編制的《臨床技術(shù)操作規(guī)范病理學(xué)分冊(cè)》的操作方法[5]。

1.2.4 改進(jìn)染色方法 （1）切片厚1～2 μm；（2）常規(guī)脫蠟至水；（3）1% 高碘酸溶液處理10 min，蒸餾水洗1 min×2；（4）5%鉻酸溶液處理40 min，蒸餾水洗1 min×2；（5）2.5%草酸溶液1 min，蒸餾水洗1 min×2；（6）切片放入預(yù)熱至60℃新鮮配制的六胺銀工作液中20～35 min；蒸餾水速洗數(shù)次，用紙巾擦掉周?chē)碾s質(zhì)；（7）0.2%氯化金調(diào)色（顯微鏡下觀察腎小球基底膜著色情況）；蒸餾水洗1 min；（8）2%硫代硫酸鈉處理1 min（顯微鏡下觀察背景強(qiáng)弱），蒸餾水洗1 min；（9）再用0.2%氯化金速洗，流水沖洗約5 min；（10）1%天青石藍(lán)媒染3 min，水洗；（11）Harris蘇木精復(fù)染5 min，水洗，分化，弱堿性溶液或溫水返藍(lán)3 min，蒸餾水洗；（12）切片于復(fù)紅工作液中15 min，水洗；（13）1%磷鉬酸溶液處理5 min，不用水洗，改用0.5%冰醋酸洗1 min；（14）0.5%亮綠30 s，0.5%冰醋酸洗1 min；（15） 高濃度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.5 染色 甲組：采用傳統(tǒng)試劑及傳統(tǒng)染色法染色；乙組：采用改進(jìn)試劑及改進(jìn)染色法染色。

1.2.6 評(píng)片 切片由2名主治醫(yī)師進(jìn)行雙盲評(píng)片，采用百分制評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，結(jié)果用（）表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 評(píng)分的比較

乙組染色得分高于甲組染色得分[（88.7±9.6）分vs.（72.2± 10.3）分]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝11.719，P＜0.001）。

2.2 染色效果比較

甲組：腎小球基底膜與腎小管基膜呈黑色，顯色比較重，常伴有銀顆粒沉淀，細(xì)胞核呈藍(lán)色，免疫復(fù)合物呈紅色，細(xì)胞質(zhì)與紅細(xì)胞呈紅色，但雜質(zhì)較多，細(xì)胞間質(zhì)與膠原纖維部分呈綠色，部分不著色，著色不均勻，背景欠清晰。乙組：腎小球鮑曼囊和毛細(xì)血管襻基膜均呈黑色細(xì)絲狀，細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，網(wǎng)狀纖維和彈力纖維呈黑色，免疫復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)與紅細(xì)胞均呈紅色，細(xì)胞間質(zhì)與膠原纖維呈綠色，組織結(jié)構(gòu)清晰，著色均勻。

3 討論

腎穿刺活檢是臨床進(jìn)行腎病診斷最有效的措施，對(duì)于腎臟疾病的治療及預(yù)后的改善均具有重要意義[7]。在腎活檢中，六胺銀染色的基本原理是腎小球基底膜和系膜區(qū)等部位的蛋白多糖經(jīng)1%過(guò)碘酸氧化后醛基暴露，暴露的醛基再與六氨銀染液中銀離子發(fā)生銀鏡反應(yīng)[8]，染色結(jié)果：腎小球基膜、腎小管基膜呈黑色，細(xì)胞核呈藍(lán)色[9]。而PASM加Masson套染實(shí)驗(yàn)中，腎小管基膜、腎小球、細(xì)胞膜基質(zhì)呈黑色，膠原纖維綠色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，免疫復(fù)合物呈紅色。這顯示PASM-Masson三色雙重染色方法能更清晰顯示免疫復(fù)合物、基膜、膠原纖維[10]。

作者經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)：（1）由于腎小球基底膜富含黏多糖，需要經(jīng)過(guò)氧化才能使醛基暴露，腎小球基底膜上暴露的醛基吸附銀沉淀使腎小球基膜呈黑色，氧化是腎小球基底膜染色的前提。通常采用高碘酸和鉻酸進(jìn)行雙重氧化，其中高碘酸的作用比較溫和，作者將其使用濃度由傳統(tǒng)的0.5%提高至1%，加強(qiáng)氧化作用，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未發(fā)生脫片現(xiàn)象。但鉻酸為強(qiáng)氧化劑，且具有較強(qiáng)的腐蝕性，濃度過(guò)高易導(dǎo)致組織脫片，作者將其使用濃度由傳統(tǒng)的8%降至5%，有效地防止組織脫片。實(shí)踐證明，用1%高碘酸和5%鉻酸雙重氧化后腎小球基膜著色深，染色效果好。（2）在中斷六胺銀浸染步驟中，傳統(tǒng)方法用蒸餾水洗后即進(jìn)行鏡下檢查。作者實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，蒸餾水沖洗后，務(wù)必用紙巾擦掉組織周?chē)Ｆ系你y雜質(zhì)，否則沖洗時(shí)雜質(zhì)會(huì)附著在組織上，背景不清晰，有銀顆粒沉積。（3）在切片染色中，由于腎小管基底膜比腎小球基底膜著色更早，在顯微鏡下觀察基底膜浸染是否適度時(shí)，應(yīng)以腎小球基底膜著色強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，即腎小球基底膜著色至黑色，而背景呈黃棕色為準(zhǔn)[11]。（4）改進(jìn)方法中，2次氯化金調(diào)色非常關(guān)鍵。如果氯化金調(diào)色不足，棕黃或棕紅色成分將會(huì)遺留在腎小球和增生的新月體內(nèi)，將會(huì)影響對(duì)免疫復(fù)合物沉積部位、腎小球囊壁基底膜等結(jié)構(gòu)的分析。使用硫代硫酸鈉溶液處理后，腎小管管壁呈淺灰至深灰色不等，基底膜呈深灰色，管腔基本不著色。再用氯化金速洗一次可以調(diào)整腎小球基底膜的細(xì)絲狀線條由灰黑色變深呈黑色，基底膜的細(xì)絲狀線條變得更加柔和，更有利于腎小球疾病在顯微鏡下的觀察。（5）改進(jìn)方法中，天青石藍(lán)與蘇木精聯(lián)合應(yīng)用可以增強(qiáng)對(duì)核的染色作用。（6）馬松套染時(shí)，改進(jìn)方法將1%酸性品紅與1%麗春紅溶液分別配制后存放，臨用前按1%酸性品紅：1%麗春紅按2∶1的比例混合后使用，染色效果比傳統(tǒng)方法更佳。（7）本實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)玻璃器皿均應(yīng)用本科室自配的清潔液浸泡，然后徹底沖洗干凈，再用蒸餾水反復(fù)沖洗后才能使用。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)避免銀試劑與金屬物品接觸，因?yàn)殂y溶液會(huì)與多種金屬物品發(fā)生置換反應(yīng)，導(dǎo)致染液的染色力下降甚至消失。

綜上所述，改進(jìn)的染液和改進(jìn)的染色方法能使六胺銀套染馬松三色的染色效果佳。

[1] 張鷗． 腎活檢病理診斷中電鏡檢查的應(yīng)用分析[J]． 中國(guó)繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2016，8（8）：43-44．

[2] 田昕． 腎小球疾病病理類(lèi)型及流行病學(xué)分析[J]． 中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2015，6（10）：10-11．

[3] 傅杭州，方慶全． 腎穿刺活檢組織病理診斷中六胺銀染色的改進(jìn)[J]． 中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2016，7（19）：160-162．

[4] 郭廣秀，王建，肖軍蘭，等． 改良六胺銀套馬松三色染色在腎穿刺活檢組織染色中的應(yīng)用[J]． 贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，34（4）：593-594．

[5] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)． 臨床技術(shù)操作規(guī)范 病理學(xué)分冊(cè)［M］． 北京：人民軍醫(yī)出版社，2004：131-170．

[6] 丁偉，王德田． 簡(jiǎn)明病理學(xué)技術(shù)[M]． 杭州：浙江科學(xué)技術(shù)出版社，2014：55-95．

[7] 李卉． 腎穿刺活檢術(shù)后患者排尿困難的原因及護(hù)理體會(huì)[J]． 中國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)管理，2016，7（19）：199-201．

[8] 曲樂(lè)，劉樹(shù)軍，徐進(jìn)，等． 腎穿刺活檢病理PASM染色方法改良探討[J]． 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2015，19（4）：617-619．

[9] 王弦，江冬瑞，秦蓉． 腎穿刺活檢標(biāo)本制片體會(huì)[J]． 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2016，32（6）：706-707．

[10] 李玉蓮，施琳，袁宏偉． 六胺銀加馬松三色雙重染色在腎穿刺活檢組織中的應(yīng)用[J]． 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2015，31（3）：347-348．

[11] 馬寧，蔡媛． 腎穿刺標(biāo)本六胺銀-馬松三色套染法介紹[J]． 診斷病理學(xué)雜志，2012，19（5）：391．

Modified Double Stain of PASM and Masson Trichrom for Renal Needle Biopsy

YE Meihua FANG Qingquan ZHANG Haifang Pathology Department, The First Aff i liated Hospital of Xiamen University, Xiamen Fujian 361003, China

Objective To explore the effect of modified double stain of PASM and Masson trichrom for renal needle biopsy dyeing dye solution preparation. Methods To collecte 100 cases of renal biopsy diagnosis of wax in the fi rst aff i liated hospital of xiamen university from January 2015 to December 2016, each wax of 100 cases was cut into two serial sections and divided into two groups randomly. Group A division was dyed by traditional dye solution under the traditional dyeing method. Group B division was dyed with modified method. Evaluation of 200 six silver amine or Masson staining score sheet. The scores of each group were presented in the form of（）. To with the independent sample t-test, and analyze the statistical significance, and the staining results of were compared between the two groups under the microscope. Results The results of group B staining score higher than that of group A [(88.7±9.6)vs. (72.2±10.3)], the difference was statistically signif i cant (t= 11.719,P＜ 0.001). Under the microscope, the result of group B slices showed that bauman capsule and glomerular capillaryloop in basement membrane were black fi laments, purple and blue nuclei, reticular fi bers and elastic fi bers were black, the immune complexes, cytoplasm and red blood cells were red, the intercellular and collagen fibers were green, clear boundaries and uniform coloring, better than group A. Conclusion The modif i ed double stain of PASM and Masson trichrom dye solution preparation method and improved dyeing method is significantly better than the traditional method.

renal needle biopsy; double stain of PASM and masson trichrom; modif i ed

R361

A

1674-9316（2017）07-0126-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．07．077

廈門(mén)大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福建 廈門(mén) 361003

方慶全