湯 陽，孔文韜，張小龍，王文平. 復旦大學附屬中山醫(yī)院超聲科，上海 000；. 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院超聲科，南京 0008；. 上海市影像醫(yī)學研究所，上海 000

·論著·

靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2微泡造影劑評價腫瘤血管生成的實驗研究

湯 陽1，孔文韜2，張小龍3，王文平1
1. 復旦大學附屬中山醫(yī)院超聲科，上海 200032；
2. 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院超聲科，南京 210008；
3. 上海市影像醫(yī)學研究所，上海 200032

目的：探討靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)微泡造影劑用于腫瘤血管生成的超聲分子成像。方法：用生物素-親和素橋接法制備靶向VEGFR2超聲微泡，免疫熒光法檢測微泡與抗體的結合。建立裸鼠HepG2肝癌皮下種植瘤模型，隨機分成靶向組(n=5)和非靶向組(n=5)，經(jīng)尾靜脈團注相同劑量靶向微泡或非靶向微泡，錄像并繪制時間-強度曲線(time-intensity curve，TIC)；注入造影劑5 min后利用高聲壓爆破技術清除腫瘤內(nèi)部微泡，比較爆破前后兩組造影圖像灰階強度的下降，估計靶向微泡在體內(nèi)與靶點的結合能力。結果：靶向造影劑和非靶向造影劑均表現(xiàn)為裸鼠皮下瘤的顯著增強，但TIC顯示兩組間曲線下面積差異有統(tǒng)計學意義[(3 940.4±200.9) dB·s vs. (2 796.8±452.3) dB·s，P=0.001]；微泡爆破后靶向組灰階強度降低顯著大于非靶向組[(7.61±2.20) dB vs. (3.74±1.40) dB，P=0.010]。結論：靶向VEGFR2微泡造影劑在體內(nèi)能顯著增強腫瘤血管成像，可作為監(jiān)測腫瘤血管生成的較可靠分子影像學探針。

靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2微泡；HepG2肝癌模型；腫瘤血管生成；超聲分子成像

血管內(nèi)皮生長因子受體2 (vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)在腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞表面高度表達，而在正常組織中表達保守[1-2]。本研究使用磷脂質(zhì)包覆的USphere?造影劑，通過“生物素-親和素”橋接法與抗VEGFR2 單克隆抗體(簡稱單抗)連接，構成靶向腫瘤血管的超聲造影劑，旨在探索一種能在分子水平顯示腫瘤新生血管的影像學技術。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1 實驗細胞

HepG2人肝癌細胞購自復旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所。

1.1.2 實驗動物

BALB/c-nu/nu雄性裸鼠，10只，6周齡，無特定病原體(specifc pathogen free，SPF)級飼養(yǎng)，購自復旦大學實驗動物中心。

1.1.3 主要實驗藥品與儀器

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自賽ThermoFisher Scientific公司，青/鏈霉素溶液購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司，USphere? Labeler全氟化碳微泡購自臺灣博信生物科技，生物素化大鼠抗小鼠CD309單抗、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記小鼠抗大鼠IgG2a購自美國BioLegend公司，AM-1高速振蕩器購自臺灣Monitex公司，納米粒度電位分析儀Nano ZS90購自英國馬爾文儀器有限公司，激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司，IU22彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)購自荷蘭Philips公司。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠皮下種植瘤模型的建立

HepG2人肝癌細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(含青霉素10 μg/mL、鏈霉素10 μg/mL)中生長。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2、完全飽和濕度，用0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(ethylenedinitrilotetraacetic acid，EDTA)消化傳代。按5×106/mL密度(約0.1 mL，細胞懸液密度以生理鹽水調(diào)節(jié))接種于裸鼠右肩背部皮下，接種前充分搖勻細胞懸液，約2周后腫瘤長至長徑1 cm左右。

1.2.2 靶向VEGFR2超聲微泡的制備及其理化性質(zhì)的檢測

將USphere? Labeler微泡于室溫置入專用高速振蕩器內(nèi)，設置振蕩時間為30 s，振蕩活化后便可產(chǎn)生密度約2.5×1010bubbles/mL的微氣泡(參考產(chǎn)品說明書)。從瓶內(nèi)抽取適量微泡與生物素化VEGFR2單抗室溫下混合，混合比例根據(jù)產(chǎn)品說明書(0.7 nmol抗體/mL USphere? Labeler微泡)，放置15 min，不時輕輕混勻。修飾完畢的微泡用PBS稀釋，4 ℃ 1 000 r/min離心洗滌3 min，棄下清液以去除未修飾成功的靶標分子，重復洗滌3次，獲得制備完成的靶向微泡。吸取少量微泡懸液，用適量PBS稀釋后滴于載玻片中央，置于光鏡下觀察。另外吸取少量微泡懸液用庫爾特粒度分析儀測定修飾成功微泡的粒徑分布。

1.2.3 免疫熒光法測定微泡與抗體的結合

在避光環(huán)境中，在制備完成的靶向微泡中加入FITC標記小鼠抗大鼠IgG2a熒光二抗(5 μL/107bubbles)，冰上孵育15～20 min，適當混勻，PBS稀釋，4 ℃ 1 000 r/m離心洗滌3 min，棄下清液以去除未結合的熒光二抗，重復洗滌3次。吸取少量微泡懸液滴于35 mm細胞培養(yǎng)皿中央，置于激光共聚焦顯微鏡載物臺上，熒光模式高倍鏡下觀察并拍照。

1.2.4 靶向微泡對腫瘤血管的體內(nèi)顯像

將已成瘤的10只裸鼠隨機分成靶向組和非靶向組，每組5只，測量腫瘤大小，根據(jù)公式長×寬×厚/2計算腫瘤體積。采用Philips IU22彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)，5～12 MHz線陣探頭，機械指數(shù)諧波造影技術，設定動態(tài)范圍(dynamic range，DR) 83dB，機械指數(shù)0.07，幀頻12 Hz，深度35 mm。焦點位于腫瘤下方，盡量避開腫瘤，減少超聲波照射對微泡的破壞，以獲得穩(wěn)定的超聲造影效果。裸鼠麻醉后取俯臥位固定，二維超聲顯示腫瘤圖像清晰后探頭保持不動，切換至造影模式，確定腫瘤位置無誤后經(jīng)裸鼠尾靜脈一次性團注密度為2.0×109bubbles/mL的靶向造影劑或非靶向造影劑50 μL/只，立即開始錄像3 min并存盤；注入造影劑5 min后錄像5 s；高機械指數(shù)超聲波照射破壞腫瘤內(nèi)殘余微泡，再次錄像30 s。

1.2.5 超聲造影結果及圖像分析

應用Interface Design定量分析軟件繪制時間-強度曲線(time-intensity curve，TIC)，選取有增強的腫瘤實質(zhì)為感興趣區(qū)，排除始終未見增強的壞死區(qū)域及周圍高增強的包膜，獲得定量分析的主要參數(shù)，包括曲線上升及下降斜率、達峰時間(time to peak，TTP)、峰值強度(peak intensity，PI)、平均渡越時間(mean transit time，MTT)及曲線下面積(area under the curve，AUC)等數(shù)據(jù)，比較兩組之間的差異；計算微泡爆破前后造影圖像灰階強度的差值，間接估計瘤體內(nèi)與腫瘤血管內(nèi)皮靶點結合的微泡量。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析處理所得數(shù)據(jù)，計量資料以差表示，組間比較應用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 靶向微泡的理化性質(zhì)

光鏡下靶向微泡呈彼此分散、較均勻的透亮圓形空泡(圖1)，粒徑分析顯示新鮮配制的靶向微泡平均粒徑為1 214 nm，分布范圍610～1 484 nm，多分散性指數(shù)(polydispersity index，PDI)為0.344 (圖2)。

圖1 靶向微泡的光鏡圖(×200)

圖2 靶向微泡的粒徑分布圖

2.2 微泡與抗體的結合情況

與FITC標記的熒光二抗孵育后，激光共聚焦顯微鏡下可見靶向微泡呈明亮的綠色熒光(200/ HP)，而非靶向微泡僅有極少量微泡顯示熒光(15/HP)(圖3)，表明抗VEGFR2單抗通過生物素-親和素橋接法成功連接于微泡表面。

圖3 與FITC標記的熒光二抗孵育后非靶向微泡與靶向微泡的激光共聚焦顯微鏡圖(×630)

2.3 動物模型情況

10只裸鼠均成瘤，2周后肩背部隆起皮下種植瘤長徑約1 cm。靶向組與非靶向組腫瘤體積分別為(0.95±0.23) cm3(范圍0.57～1.16 cm3，與(1.12±0.32) cm3(范圍0.69～1.56 cm3)，兩者差異無統(tǒng)計學意義(P=0.378)。

2.4 造影圖像及定量分析結果

經(jīng)尾靜脈一次性團注靶向造影劑或非靶向造影劑后，在裸鼠體內(nèi)均表現(xiàn)為腫瘤顯著增強(圖4)。比較靶向組與非靶向組TIC定量分析參數(shù)(表1)發(fā)現(xiàn)，腫瘤實質(zhì)的曲線上升及下降斜率、TTP、MTT均無顯著差異；靶向組腫瘤實質(zhì)AUC值為(3 940.4±200.9) dB·s，非靶向組腫瘤實質(zhì)AUC值為(2 796.8±452.3) dB·s，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)；靶向組腫瘤實質(zhì)PI平均值為25.67 dB，高于非靶向組的21.62 dB，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.078)。

高機械指數(shù)超聲波照射前后，靶向組腫瘤實質(zhì)灰階強度下降(7.61±2.20) dB，非靶向組僅下降(3.74±1.40) dB (圖5)，兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.010)，表明更多的靶向VEGFR2超聲微泡在體內(nèi)與腫瘤血管內(nèi)皮細胞結合并停留于靶組織中。

圖4 靶向組(A)與非靶向組(B)造影達到峰值時的超聲圖像

表1 靶向組與非靶向組TIC定量分析參數(shù)的比較

圖5 微泡爆破前后靶向組與非靶向組的造影圖像

3 討 論

生物素-親和素橋接法作為最常用的制作靶向微泡造影劑的方法之一，具有簡便、穩(wěn)定、敏感、多靶點、結合率高等優(yōu)勢。盡管親和素的免疫原性限制了生物素-親和素橋接法在臨床的應用[3-4]，但其對各種靶點有效性的研究有重要意義[5-6]。本研究應用免疫熒光法證實抗VEGFR2單抗能通過這種作用與微泡結合，成功制備以血管內(nèi)皮細胞表面VEGFR2分子為靶點的超聲造影劑，可用于腫瘤血管的特異性顯像。體內(nèi)實驗顯示，注入造影劑后腫瘤實質(zhì)顯著增強，5 min后仍有大量微泡存留其中。

與其他分子成像方法相似，超聲分子成像需造影劑注入后在體內(nèi)存留一段時間(通常4～15 min)。Dayton等[7]認為，靶向微泡造影劑在這段時間內(nèi)聚集于靶組織并顯像，同時未結合的微泡被循環(huán)清除，通過微泡破壞前后相減的方法即可獲得殘留微泡的信號強度。而Yeh等[8]通過小鼠心肌顯像實驗發(fā)現(xiàn)，靶向微泡造影劑注入20 min后，循環(huán)中的游離微泡完全檢測不出，仍有部分微泡于靶組織中持續(xù)顯像。因此，本研究中繪制TIC得到曲線上升及下降斜率、TTP、MTT、PI、AUC等主要定量參數(shù)，并計算5 min時微泡爆破前后灰階強度的下降來間接估計結合微泡的灰階信號強度，采用這兩種方法對靶向微泡造影劑的顯像效果進行評價。結果發(fā)現(xiàn)，靶向組與非靶向組灌注參數(shù)AUC有顯著統(tǒng)計學差異，靶向組PI平均值高于非靶向組，兩組間微泡爆破前后灰階強度的下降也存在顯著差異。以上結果均證實靶向微泡在體內(nèi)與腫瘤血管內(nèi)皮細胞的穩(wěn)定結合。同時，本研究使用的USphere? Labeler微泡直徑約1.2 μm，與其他較大粒徑微泡相比，因高通透和滯留(enhanced permeability and retention，EPR)效應在腫瘤組織中形成選擇性分布[9]，能顯著提高顯像效果。但其粒徑過小，加大了定量檢測抗體攜帶率的難度，而這種被動靶向作用同樣能對靶向微泡在體內(nèi)主動尋靶并結合的效應產(chǎn)生干擾。因此，本研究中盡管靶向組平均PI值高于非靶向組，但沒有統(tǒng)計學差異；樣本量小也可能是影響因素之一。既往研究顯示，與普通超聲造影比較，靶向超聲造影的腫瘤組織TTP略提前，PI更高，且持續(xù)強化時間更長[10]。通過改進靶點選取、微泡構成、成像方法等，有助于提高微泡的尋靶能力與成像效果[11]。

本研究存在以下局限性：超聲微泡較長時間與空氣接觸可引起微泡破壞及其理化特性改變，而操作時不可避免會出現(xiàn)微泡與空氣的短暫接觸；此外，種植瘤模型受到較多因素影響，如動物品系、腫瘤類型、種植瘤大小及種植部位等[12]。比較裸鼠皮下瘤的造影圖像，顯示該動物模型穩(wěn)定性較好。盡管如此，仍需增加樣本量以獲得更可靠的結果。

綜上所述，靶向VEGFR2微泡造影劑在體內(nèi)與腫瘤血管內(nèi)皮細胞的特異性結合能顯著增強腫瘤血管顯像，作為監(jiān)測腫瘤灌注及血管生成較可靠的分子影像學探針，在研究疾病早期診斷、評價疾病進展及分子靶向治療等方面存在一定的潛力。

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Molecular ultrasound imaging with vascular endothelial growth factor receptor 2-targeted microbubbles in a mouse liver cancer model

TANG Yang1, KONG Wentao2, ZHANG Xiaolong3, WANG Wenping1
(1. Department of Ultrasound, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2. Department of Ultrasound, Nanjing Drum Tower Hospital Afliated to Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China; 3. Shanghai Institute of Medical Imaging, Shanghai 200032, China)

WANG Wenping E-mail: puguang61@126.com

Objective:To evaluate the feasibility and reproducibility of molecular ultrasound imaging of tumor angiogenesis with vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2)-targeted microbubbles.Methods:VEGFR2-targeted microbubbles were accomplished by anti-VEGFR2 monoclonal antibody conjugation to the microbubble surface using biotin-avidin linkage, which was assessed ex vivo using immunofuorescence. Ten mice bearing subcutaneous human liver tumor were divided into two groups randomly (targeted group, n=5; non-targeted group, n=5) and scanned at 2 weeks after implantation with contrast-enhanced ultrasound (CEUS) using either targeted or non-targeted microbubbles. Following CEUS, time-intensity curves were constructed ofline and perfusion parameters were calculated. The residual bubble signal was determined 5 min after contrast agent injection with destruction-replenishment analysis.Results:Both targeted and non-targeted microbubbles revealed signifcant enhancement in vivo. A signifcant diference in area under the curve (AUC) was recorded between targeted group and non-targeted group [(3 940.4±200.9) dB·s vs. (2 796.8±452.3) dB·s, P=0.001]. After the destruction sequence, there was a signifcant diference in the decrease of video intensity between targeted group and non-targeted group [(7.61±2.20) dB vs. (3.74±1.40) dB, P=0.010].Conclusion:Molecular ultrasound imaging with VEGFR2-targeted microbubbles is noninvasive, feasible and reproducible to assess tumor angiogenesis.

Vascular endothelial growth factor receptor 2-targeted microbubble; HepG2 liver cancer model; Tumor angiogenesis; Molecular ultrasound imaging

R445.1

A

1008-617X(2016)04-0317-05

2016-07-14

2016-09-03）

國家自然科學基金資助項目(No: 81371577)

王文平 E-mail：puguang61@126.com