王延暉

（河南省水產(chǎn)科學研究院，鄭州 450044）

魚類染色體的特點之一，是具有較大的可塑性，易于加倍，這是人工誘導多倍體技術的理論基礎。魚類人工多倍體育種就是通過增加染色體組的方法來改造生物的遺傳基礎，從而培育出符合人們需要的優(yōu)良品種的育種方法。

多倍體育種方法簡單，技術可行，易于操作，與性控、選育等技術結合可以生產(chǎn)具有生長速度快、抗病力強、成活率高和飼養(yǎng)管理方便的新品種。多倍體育種的研究進展較快，許多品種已應用于生產(chǎn)，取得了明顯的經(jīng)濟效益。中國自20世紀70年代中期開始魚類多倍體育種工作，迄今已獲得草魚、鯉魚、鰱魚、虹鱒、鯽魚、大鱗副泥鰍、牙鲆等 20余種魚類的三倍體或四倍體試驗魚，其中三倍體的異育銀鯽、湘云鯽、湘云鯉已進入實用化生產(chǎn)階段。

1 魚類人工誘導多倍體機理及方法

1.1 人工誘導多倍體的細胞學機制

多倍體是由于細胞內(nèi)染色體加倍而形成的。魚類受精細胞學研究表明：魚類精子入卵的時期是第二次減數(shù)分裂的中期，卵子受精后放出第二極體。如果卵子在各種理化因子刺激下不排出第二極體，與單倍體精子結合就形成三倍體；若受精后第一次有絲分裂受到抑制，則單倍體的精子、卵子結合后再經(jīng)過染色體加倍就產(chǎn)生四倍體魚類。

1.2 人工誘導多倍體的方法

目前，魚類多倍體的誘導方法主要有生物、物理和化學方法。

1.2.1 生物學方法

人工誘導多倍體的生物學方法主要有遠緣雜交、核移植和細胞融合等。應用較多的是遠緣雜交法。

遠緣雜交主要是借助于異源精子的不親和性而誘發(fā)染色體倍數(shù)增加，產(chǎn)生異源三倍體或四倍體。遠緣雜交技術易操作，應用較為廣泛。鯉科不同亞種之間的遠緣雜交，往往可以產(chǎn)生多倍體。鳙(♂)×草魚(♀)雜交會產(chǎn)生三倍體雜種魚，其F1全部具有三倍染色體數(shù)(3n=72)。

此外還有核移植和細胞融合。核移植技術精細、難度大，故通過核移植獲得多倍體的方法還處于初始階段；細胞融合是在人工誘導下，將兩個不同基因型的細胞融合成一個雜種細胞的方法。但由于細胞內(nèi)染色體發(fā)生重排，實際得到的是各種不同數(shù)量染色體的細胞群。通過這兩種方法并未成功地獲得真正意義上的多倍體，僅得到心跳期胚胎或嵌合體仔魚。

1.2.2 物理方法

物理方法是利用物理手段抑制魚類受精卵細胞正常分裂，獲得多倍體后代的方法。目前最常用的包括溫度休克法（冷休克和熱休克）、靜水壓法、高鹽高堿法等。

溫度休克法是將受精卵短時間置于略高于或略低于致死溫度的冷或熱環(huán)境中，引起受精卵細胞內(nèi)代謝相關酶構型的改變，不利于酶促反應的正常進行，使得受精卵發(fā)育延遲，從而抑制第二極體排放或抑制第一次卵裂，誘導出三倍體或四倍體魚。根據(jù)處理溫度分為冷休克（0～5℃）和熱休克（35～42℃）兩種方法。一般來說，冷水性魚類宜用熱休克，溫水性魚類宜用冷休克。影響溫度休克法的關鍵因素包括處理的開始時間、持續(xù)時間以及溫度高低，魚類溫度休克敏感性的差異既與遺傳背景有關，也與卵子成熟度有關。

靜水壓法采用較高的水靜壓(650 kg/cm2)來抑制第二極體的放出或者抑制第一次卵裂，誘導產(chǎn)生多倍體。該方法最佳條件易于掌握，處理程序易于標準化，對受精卵的損傷小，誘導率高(一般在90～100%)。但需專門的設備如水壓機等，同時樣品室容量有限，不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。

高鹽高堿法是利用高鹽或高pH條件誘導魚類多倍體的方法，其誘導機理尚不明確，容易產(chǎn)生較高畸形率，故應用較少。

1.2.3 化學方法

化學方法是利用化學誘導劑抑制魚類受精卵正常分裂，產(chǎn)生多倍體后代的方法。常用的誘導劑包括細胞松弛素 B（CB）、聚乙二醇（PEG）、6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP）、秋水仙素、咖啡堿等。這些化學藥物通過阻止分裂溝的形成、抑制細胞質(zhì)的分裂，阻止了極體的釋放而形成多倍體。

化學藥品一般較貴，而且有毒性，對生成個體的活性有負面影響，往往得到較大比例的嵌合體，有一定的局限性，不如溫度休克與靜水壓處理誘導魚類多倍體使用普遍。

2 多倍體的鑒定

無論采用何種誘導方法,都不能達到100%的誘導率，且所形成的多倍體常常表現(xiàn)為嵌合體，因此誘導結果必須經(jīng)過嚴格的鑒定。常用的魚類倍性鑒定方法包括染色體計數(shù)、DNA含量測定、紅細胞測量及其他現(xiàn)代生物技術方法等。

染色體制片直接計數(shù)法是通過對有絲分裂旺盛組織制備染色體標本，對染色體數(shù)目進行統(tǒng)計和核型配對確定其倍性的方法。該方法是魚類多倍體鑒定中最直接和精確的鑒定方法。不僅可以檢測細胞倍性，還可以檢測出多種細胞倍性形成的嵌合體。但該方法最大的缺點是制片過程繁瑣，需要對實驗魚進行連續(xù)2～3次注射誘導藥物。同時，需要對實驗魚進行解剖取材，產(chǎn)生不可逆的損傷。

細胞核內(nèi)DNA含量是由物種本身所決定的，魚類體細胞倍性增加，其DNA含量也隨之增加。利用核酸特異性結合熒光染料（PI或DAPI）對魚類體細胞進行染色，流式細胞儀檢測其熒光信號強度，從而鑒定其倍性。該方法具有取樣量少，倍性鑒定靈敏度高等優(yōu)點，且不會對實驗魚產(chǎn)生不可逆損傷，是目前較為先進可靠，利用最為廣泛的方法，但此方法需要專門的儀器設備，檢測費用昂貴。

魚類的紅細胞大小通常與其倍性成正比，倍性越高，紅細胞體積越大，可通過紅細胞體積測量來判斷其倍性。該方法取材簡單，操作簡便，對魚體傷害小，可作為魚類倍性鑒定的初步篩選方案。

現(xiàn)代分子生物學方法如mtDNA遺傳多態(tài)性檢測、RAPD技術、DNA斑點雜交技術等均可以檢測多倍體中外源片段的摻入。

3 多倍體技術在魚類養(yǎng)殖中的應用

多倍體魚類對改善品質(zhì)、加快生長速度、延長壽命、提高產(chǎn)量、控制過度繁殖、保持物種多樣性、培育新品種等方面都具有重要意義，應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖可以帶來巨大的經(jīng)濟效益。

3.1 提高雜種后代成活率，提高生長速度

性腺不育的三倍體魚類，在耐水污染、耐寒和抗病性等抵抗惡劣環(huán)境方面具有明顯的優(yōu)勢。褐鱒、溪紅點鮭的三倍體雜種在開口攝食時成活率為78.8%，而二倍體雜種的成活率僅為23.7%，在幼魚期和成熟期三倍體普遍比二倍體生長快。

3.2 延長養(yǎng)殖周期，改善品質(zhì)，提高經(jīng)濟效益

多倍體不育的魚因無需消耗能量用于生殖腺的發(fā)育，因而可將更多的營養(yǎng)物質(zhì)用于生長，提高餌料轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。不僅避免因性腺發(fā)育繁殖而造成的肉質(zhì)退化、生長停滯、產(chǎn)后染病死亡等不良現(xiàn)象，還會提高生長速度，明顯地改善魚肉的品質(zhì)。

3.3 控制過度繁殖，保持物種多樣性

三倍體的不育性可以減少魚類基因之間的混雜，可有效控制自然水域中魚類的混亂雜交和過度繁殖，避免養(yǎng)殖品種的退化，保存當?shù)匚锓N的多樣性。因此也可用于控制引種對環(huán)境的影響。

3.4 培育魚類新品種

多倍體技術目前比較成熟的是三倍體，但三倍體魚是不育的，苗種不能大規(guī)模生產(chǎn)。而四倍體魚類是可育的，且有4個等位基因，染色體重組形式多、變異性大，在遺傳育種上具重要意義。將四倍體與正常二倍體雜交便可大量生產(chǎn)三倍體。另外，從四倍體還可獲得四倍體(自交)、更高倍數(shù)體以及結合雌核發(fā)育、雄核發(fā)育技術得到雌核或雄核發(fā)育二倍體。

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