何書芬，居文政，胡浩彬，朱立靜，戴國梁，張 倩

(1. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院中藥室，江蘇 南京 210008 )

◇實驗方法學◇

腎陽虛型抑郁癥大鼠模型的建立和評價

何書芬1，居文政1，胡浩彬2，朱立靜1，戴國梁1，張 倩1

(1. 南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院中藥室，江蘇 南京 210008 )

目的 建立腎陽虛抑郁癥大鼠病證結合動物模型并進行評價。方法 將24只大鼠按體質(zhì)量區(qū)間分組法分為對照組、模型組、自愈組；模型組與自愈組連續(xù)21 d注射氫化可的松，對照組給予等體積生理鹽水。造模結束后，各組進行相關指標檢測：曠敞試驗、糖水偏好試驗、強迫游泳試驗，LC-MS/MS法測血漿中5-HT、DA、NE的含量；取肝、腎、脾、胸腺、腎上腺、睪丸及附睪，計算臟器指數(shù)。結果 與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)干枯、畏寒、拱背蜷縮等癥狀，體質(zhì)量增長明顯遲緩，強迫游泳的不動時間明顯延長，糖水偏好降低，曠敞試驗水平得分、垂直得分均降低，肝、腎、脾、胸腺、睪丸及附睪的臟器指數(shù)不同程度降低，血中5-HT、NE含量增加；與模型組相比，自愈組大鼠血漿5-HT、NE、DA明顯下降，且5-HT、DA明顯低于對照組。結論 連續(xù)注射氫化可的松誘導腎陽虛型抑郁癥大鼠模型是一種可行的方法。

抑郁癥；腎陽虛；氫化可的松；動物模型；指標檢測；LC-MS/MS

抑郁癥是一種以持續(xù)情緒低落為主要癥狀的精神情志障礙性疾病，具有患病率高、自殺率高、難治愈及復發(fā)率高的特點，是全球性公共衛(wèi)生問題之一。中醫(yī)認為抑郁癥病因病機復雜，近年來中醫(yī)醫(yī)家認為腎陽主導抑郁癥發(fā)生，腎陽不足是抑郁癥的基礎病機，臨床及動物實驗表明輔以溫補腎陽法治療抑郁癥取得更好的效果。研究表明糖皮質(zhì)激素及其受體與抑郁癥密切相關[1]，且目前腎陽虛抑郁癥動物造模方法主要是給予外源性糖皮質(zhì)激素，本實驗試圖通過注射氫化可的松建立腎陽虛型抑郁癥大鼠模型，從行為學及生理變化多方面評價模型，為進一步開展腎陽虛型抑郁癥的病理病機研究及篩選合適的中藥治療腎陽虛型抑郁癥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 注射用氫化可的松琥珀酸鈉粉針劑(天津生物化學制藥有限公司，產(chǎn)品批號：021509017，規(guī)格10 mg/片)，用生理鹽水配成濃度為4 mg·mL-1，對照品鹽酸五羥色胺、鹽酸多巴胺均購于Sigma公司(批號分別為1001528057、101280875)；重酒石酸去甲腎上腺素、內(nèi)標替硝唑均購于中國藥品生物制品檢定所(批號分別為：100169-201103、100336-200402)，苯甲酰氯購于成都科龍化工試劑廠(批號：20120529，分析純，98%)，甲醇、乙腈為色譜純，甲酸、乙酸銨、四硼酸鈉等均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 儀器 Waters Quattro Micro液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters公司)，色譜工作站：Masslynx4.1；梅特勒-托利多AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Thermo Micro17冷凍高速離心機(美國Thermo公司)；Millipore Driet-Q5超純水機(法國Millipore公司)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)，游泳缸，自制敞箱，-20 ℃冰箱(海爾)，非接觸性紅外測試溫度計(Vicks)。

1.3 動物及造模方法 SPF級健康成年SD大鼠24只，♂，體質(zhì)量(150±20) g，由南通大學提供，合格證號：(蘇)2014-0001SPF級，實驗前適應性飼養(yǎng)1周，保持12 h晝夜節(jié)律，室溫(22±2) ℃，濕度50%，自由攝食飲水。按體質(zhì)量區(qū)間分組法將大鼠隨機分為空白組、模型組、自愈組，8只/組，4只/籠。模型組、自愈組大鼠每天14:00左右臀部肌肉注射氫化可的松25 mg·kg-1，連續(xù)21 d[2]，對照組大鼠給予等體積的生理鹽水。21 d造模結束后，空白組、模型組大鼠眼眶取血0.5 mL，置于肝素鈉浸泡過的1.5 mL EP管中，4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，分離血漿于-20 ℃冰箱中備用；隔天處死大鼠，取肝、腎、脾、胸腺、腎上腺、睪丸及附睪稱重。自愈組停止給藥，正常進食進水，14 d后，同上操作。

1.4 行為學評估

1.4.1 一般四診指標 觀察各模型組大鼠實驗過程中生長發(fā)育情況，精神狀態(tài)，活動度，毛發(fā)，大小便情況等。

1.4.2 大鼠體重、體溫檢測 測定時間為實驗前d 0和造模過程中的7、14、21 d，按動物序號進行測量。

1.4.3 糖水偏好[2]實驗前1 d，將大鼠單籠適應24 h。d 1：給予每只大鼠2瓶1%蔗糖水；d 2：給予每只大鼠1瓶1%蔗糖水，1瓶純凈水；d 3：所有大鼠均禁食禁水23 h；d 4：給予每只大鼠事先定量的2瓶水：1瓶1%蔗糖水，1瓶純凈水，1 h后交換兩瓶位置，計算大鼠在2 h內(nèi)的糖水消耗量。

1.4.4 曠敞試驗[2]將大鼠放入高40 cm，長、寬均為80 cm，內(nèi)壁涂黑，底面平均分為25個(16×16) cm2的小方格的箱內(nèi)底面中心，同時進行攝像和計時，以5 min內(nèi)大鼠穿越箱底面的方格數(shù)為水平得分(三爪以上跨入)，穿越1格得1分；以雙前肢抬起次數(shù)為垂直得分(兩前肢離地1 cm以上)，雙前肢離地1次得1分。徹底清潔敞箱后再進行下1只大鼠的觀察。

1.4.5 強迫游泳試驗[3]將大鼠放入直徑40 cm、水深35 cm的桶內(nèi)，水溫25 ℃，適應2 min，累計后4 min內(nèi)大鼠的不動時間。

1.5 生化指標評估

1.5.1 臟器指數(shù)測定[4]解剖動物臟器，稱重，計算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器重量/體質(zhì)量×100%。

1.5.2 血漿中5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量測定

1.5.2.1 血樣處理[3]取血漿100 μL，加入10 μL內(nèi)標(替硝唑：5.28 mg·L-1)，加入200 μL乙腈，渦旋1 min，12 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，依次加入50 μL苯甲酰氯(體積分數(shù)為2%的苯甲酰氯溶于乙腈溶液中)及50 μL四硼酸鈉緩沖溶液(100 mmol·L-1)，室溫下微振10 min，12 000 r·min-1離心5 min，取上清100 μL于進樣小瓶中，進樣10 μL分析。

1.5.2.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×2.1 mm，5 μm)，美國Agilent公司；保護柱：Agilent Zorbax SB-C18(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)，美國Agilent公司；流動相：0.1%甲酸水溶液(含2.0 mmol·L-1乙酸銨) ∶乙腈=35 ∶65；流速：0.2 mL·min-1，柱溫：35 ℃。

1.5.2.3 質(zhì)譜條件 多反應檢測(MRM)模式；電噴霧正離子化檢測(ESI+)；檢測電壓：3.0 kv；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；脫溶劑氣體流速：450 L·h-1。各成分的檢測離子、錐孔電壓、碰撞能量見Tab 1。

Tab 1 MRM parameters of three analytes and internal standards(IS)

2 結果

2.1 大鼠的生活狀態(tài) 造模前各組大鼠發(fā)育正常，毛發(fā)光澤整齊，無豎毛，大小便正常，行為活躍，對外來刺激反應靈敏。空白組大鼠造模前、后一般狀況無明顯變化；與空白組相比，模型組大鼠生長發(fā)育緩慢，毛發(fā)枯燥無光澤，豎毛，泄瀉，精神萎靡，對外來刺激反應差，行動遲緩，常蜷縮在角落。

2.2 行為學測試結果 造模過程中，模型組大鼠體質(zhì)量增長緩慢，14 d時，模型組體質(zhì)量明顯低于對照組(P<0.05)，21 d時，模型組體質(zhì)量極明顯低于對照組 (P<0.01)，同時模型組大鼠的水平得分、垂直得分、糖水偏好及強迫游泳的不動時間均極明顯低于對照組 (P<0.01)，模型組大鼠體溫低于對照組，但無明顯差異，見Tab 2。

Time/dTestitemControlgroupModelgroup0Bodyweight/mg177179Bodytemperature/℃35．235．47Bodyweight/g242235Bodytemperature/℃35．034．914Bodyweight/mg284266?Bodytemperature/℃36．636．521Bodyweight/mg324277??Bodytemperature/℃35．535．1Open?fieldtest Levelscore67±1338±18?? Verticalscore30±1013±8??Sucrosepreferencetest/%69．52±11．8547．97±14．56??Forcedswimtest(immobiletime)/s59．3±14．5111．6±15．78??

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.3 生化指標結果 ♂ SD注射氫化可的松后，腎臟、胸腺、睪丸及附睪指數(shù)明顯降低(P<0.05)，脾臟指數(shù)極明顯降低(P<0.01)，肝臟指數(shù)降低，但變化不明顯，腎上腺指數(shù)無明顯差異，見Tab 3。

2.4 樣品測定 結果表明，與對照組相比，模型組大鼠血漿中5-HT、NE的含量明顯或極明顯升高(P<0.05,P<0.01 )，與模型組相比，自愈組大鼠血漿中5-HT、NE、DA的含量明顯或極明顯降低(P<0.05,P<0.01)，并且自愈組5-HT、DA的含 量明顯或極明顯低于正常組(P<0.05,P<0.01)，而NE含量依然高于正常組。見Tab 4。

GroupLiverKidneySpleenAdrenalglandThymusTestisandepididymisControl3．77±0．970．72±0．100．22±0．010．02±0．010．11±0．031．21±0．13Model3．50±0．240．66±0．02?0．16±0．03??0．02±0．000．08±0．03?1．13±0．13?Self?healing3．49±0．300．67±0．08?0．16±0．02??0．02±0．000．08±0．01?1．12±0．14?

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Group5?HT/mg·L-1NE/mg·L-1DA/mg·L-1Control0．06±0．011．51±0．710．24±0．04Model0．19±0．13??2．20±0．43?0．24±0．04Self?healing0．04±0．01?##1．63±0．35#0．13±0．03??##

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3 討論

中醫(yī)“證”是祖國醫(yī)學理論的基本概念，也是實施中醫(yī)辨證施治的基礎，因此建立可靠的動物模型是深入研究疾病的前提之一。本實驗采取連續(xù)21 d給予SD大鼠肌注氫化可的松25 mg·kg-1，行為學評估結果顯示大鼠表現(xiàn)出明顯的腎陽虛抑郁狀態(tài)，如拱背、蜷縮、毛發(fā)疏松、無光澤、泄瀉、體質(zhì)量減輕、體溫降低，糖水偏好降低，強迫游泳的不動時間明細延長，曠場試驗的水平得分和垂直得分明顯降低，與實驗報道一致[5-8]，已造成腎陽虛型抑郁癥模型。

病理學檢查結果顯示，模型大鼠的肝、腎、脾、胸腺、睪丸及附睪的臟器指數(shù)均不同程度的降低，其中脾臟指數(shù)下降極為明顯，提示氫化可的松可導致大鼠腎臟、脾臟、睪丸等萎縮，生理機能減退、免疫力下降、性功能降低，說明氫化可的松導致大鼠下丘腦-垂體-性腺軸和腎上腺軸-胸腺軸功能紊亂[4,6,9]，模型大鼠出現(xiàn)腎陽虛型抑郁癥的病理癥狀，停止氫化可的松刺激14 d后，受影響的臟器未能恢復正常，認為氫化可的松造成的臟器損傷可能是不可逆的。

抑郁癥經(jīng)典的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和受體假說認為，抑郁癥的發(fā)生可能與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能失衡有關，5-HT、NE、DA被認為與抑郁癥發(fā)生密切相關。由于5-HT、DA及NE是內(nèi)源性物質(zhì)，本實驗在參考文獻[3]的基礎上，采用活性炭預處理后的血漿作為空白血漿，排除了5-HT、NE對實驗的干擾，同時大大降低了DA的干擾，保證實驗數(shù)據(jù)更準確可靠。實驗結果顯示持續(xù)注射外源性氫化可的松可引起大鼠血漿中5-HT、NE含量明顯升高，與蔡定芳等的研究結果一致[10-12]，且更早研究表明內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素缺乏時支配中樞單胺類遞質(zhì)的神經(jīng)興奮性增高[13-14]，提示長期大劑量注射氫化可的松導致HPA軸功能低下的同時，反饋性激活中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成及代謝，大鼠表現(xiàn)出腎陽虛抑郁狀態(tài)；停止注射氫化可的松14 d后，與模型組相比，自愈組大鼠血漿中5-HT、NE及DA含量下降，并且5-HT、DA含量明顯低于正常組，而NE含量依然高于正常組，楊慧敏等[15]對不同中醫(yī)癥型抑郁癥進行研究發(fā)現(xiàn)，心腎不交型抑郁癥5-HT、DA水平低下，NE水平相對亢進，與本實驗自愈組結果一致，認為模型大鼠在14 d內(nèi)不僅未能恢復正常狀態(tài)，反而由腎陽虛型發(fā)展為心腎不交型，病情加重。本研究亦從單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量角度初步揭示了腎陽虛型抑郁癥，若久病不治，腎之精血不足，不能上養(yǎng)心神，最終將可能發(fā)展成心腎不交型抑郁癥。

(致謝：本文實驗在江蘇省中醫(yī)院基礎藥理實驗室和臨床藥理實驗室完成，特此致謝！)

[1] 陳 姣, 楚世峰, 陳乃宏. 糖皮質(zhì)激素與抑郁發(fā)病相關機制研究進展[J].中國藥理學通報, 2013, 29(11): 1493-5.

[1] Chen J, Chu S F, Chen N H. Research progress in glucocorticoid and pathophysiology of depression[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(11): 1493-5.

[2] 陳 嶸, 秦 竹, 吳施國, 等. 桂附地黃丸對腎陽虛抑郁癥大鼠行為學改變的影響[J]. 新中醫(yī), 2013, 45(4): 165-8.

[2] Chen Z, Qin Z, Wu S G, et al. Effect of Guifu rehmaniae bolus on the behavior changes of kidney Yang deficiency depression rats[J].JNewChinMed, 2013, 45(4): 165-8.

[3] 臧雨馨, 居文政, 孫冰婷, 等. LC-MS/MS法同時測定CUMS大鼠血漿中3中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)[J]. 中國藥理學通報, 2015, 31(2): 273-8.

[3] Zang Y X, Sun B T, Zhao W Z, et al. LC-MS/MS method for simultaneous determination of three monoamine neurotransmitters in rat plasma of CUMS [J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(2): 273-8.

[4] 周文江, 姚菊芳, 彭秀華, 等. 腎陽虛證大鼠模型的建立[J]. 實驗動物與比較醫(yī)學, 2007, 27(4): 242-3.

[4] Zhou W J, Yao J F, Peng X H, et al. Establishment of rat model of kidney deficiency syndrome[J].LabAnimCompMed, 2007, 27(4): 242-3.

[5] 劉 欣, 張 冰, 劉小青, 等. 氫化可的松誘導大鼠類陽虛狀態(tài)的動態(tài)觀察[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2011, 26(1): 126-8.

[5] Liu X, Zhang B, Liu X Q, et al. Dunamic experimental study on rat’s analogue yang deficiency syndrome induced by hydrocortisone [J].ChinJTraditClinMedPharm, 2011, 26(1): 126-8.

[6] Sturm M, Becker A, Schroeder A, et al. Effect of chronic corticosterone application on depression-like behavior in C57BL/6N and C57BL/6J mice [J].GenesBrainBehav, 2015, 14(3): 292-300.

[7] 彭軍波, 季麗莉, 金雪花, 等. 糖皮質(zhì)激素注射建立小鼠行為抑郁癥模型[J]. 解剖學研究, 2012, 34(2): 86-8.

[7] Peng J B, Ji L L, Jin X H, et al. A mouse model of behavioral depression induced by repeated corticosterone injections[J].AnatRes, 2012, 34(2): 86-8.

[8] Kott J M, Mooneyleber S M, Shoubah F A, et al. Effectiveness of different corticosterone administration methods to elevate corticosterone serum levels, induce depressive-like behavior, and affect neurogenesis levels in female rats [J].Neuroscience, 2016, 312(15): 201-14.

[9] 沈自尹, 吳志軍, 于立華, 等. 淫羊藿總黃酮對皮質(zhì)酮誘導免疫功能低于大鼠的保護作用及配伍研[J]. 中國藥理學通報, 2007, 23(8), 1061-3.

[9] Shen Z Y, Wu Z J, Yu L H, et al.Study the protection and combination on the total flavones of epimedium to the immunodeficiency rats induced by corticosterone[J].ChinPharmacolBull, 2007, 23(8)：1061-3.

[10]蔡定芳, 陳曉紅, 劉彥芳, 等. 外源性糖皮質(zhì)激素對大鼠下丘腦-垂體-腎上腺-胸腺軸的影響[J]. 中國病理生理雜志, 1997, 13(6): 589-92.

[10]Cai D F, Chen X H, Liu Y F, et al. The effect of exogenous glucocorticoid on the hypothalamus-pituitary -adrenal-thymus axis in the rats [J].ChinJPathophysiol, 1997, 13(6): 589-92.

[11]吳 勇, 李政木, 卓廉佳, 等. 腎氣丸“陰中求陽”配伍對腎陽虛大鼠下丘腦多巴胺及五羥色胺含量的影響[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2009, 20(10): 2387-8.

[11]Wu Y, Li Z M, Zhuo L J, et al. Influence of compatibility of Shenqi pill “Peinforcing yang from Yin”on the contents of DA, 5-HT in Hypothalamus of Deficient Kidney-Yang rats [J].LishizhenMedMaterMedRes, 2009, 20(10): 2387-8.

[12]蔡定芳, 沈自尹, 張玲娟, 等. 右歸飲對皮質(zhì)酮大鼠下丘腦單胺類遞質(zhì)含量以及體重飲食攝水的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志, 1995, 15(12): 728-31.

[12]Cai D F, Shen Z Y, Zhang L J, et al. Effcet of Youguiyin on the content of monoaminie transmitters and body weight, food and fluid intake in corticosteron-rats [J].ChinJIntegrTradWestMed, 1995, 15(12): 728-31.

[13]Lachuer J, Buda M, Tappaz M, et al. Differential time course activation of the brain stem catecholaminergic groups following chronic adrenalectomy [J].Neuroendocrinology, 1992, 56(2): 125-32.

[14]Lachuer J, Buda M, Tappaz M, et al. Lack of glucocorticoids enhances the early activation of noradrenergic cell group triggered by restraint stress [J].Neuroendocrinology, 1992, 4(2): 153-9.

[15]楊慧敏, 李躍華, 楊 京, 等. 抑郁癥中醫(yī)辨證分型與外周血神經(jīng)遞質(zhì)關系研究[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2011, 18(4): 14-6.

[15]Yang H M, Li Y H, Yang J, et al. Relationship berween TCM syndrome types and peripheral neurotransmitter of major depression patients [J].InfTraditChinMed, 2011, 18(4): 14-6.

Establishment and evaluation of animal model of depression rats with kidney-yang deficiency

HE Shu-fen1, JU Wen-zheng1, HU Hao-bin2, ZHU Li-jing1, DAI Guo-liang1, ZHANG Qian1

(1.DeptofClinicalPharmacology,theAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210029,China; 2.Mesothecium,JiangsuInstituteforFoodandDrugControl,Nanjing210008,China)

Aim To establish depression rat model with kidney-yang deficiency and evaluate the related parameters. Methods A total of 24 adult SD rats were divided into control group, model group and self-healing group by body weight. Model group and self-healing group were injected hydrocortisone for 21 days, meanwhile the control group was injected sodium chloride. After modeling, the related indexs detection were taken out: open-field test, sucrose preference test and forced swim test. Then the orbital blood was taken to detect 5-HT, DA and NE by LC-MS/MS. And liver, kidney, spleen, thymus, adrenal gland, testis and epididymis were taken to calculate organ index. Results Compared with the control group, model rats displayed depression and kidney yang deficiency syndrome such as dry hairs, chills, back arched and so on. Correspondingly, the body weight increased slowly. Immobility in FST was significantly increased. Sucrose preference, horizontal scores and vertical scores was significantly decreased. Organ index decreased in liver, kidney, spleen, adrenal, testis and epididymis. The level of 5-HT and NE was significantly high. Compared with the model group, 5-HT, NE and DA were significantly reduced, 5-HT and DA were even lower than those of the control group. Conclusion Depression rat model with kidney-yang deficiency could be induced by continuous injection of hydrocortisone.

depression; kidney-yang deficiency; hydrocortisone; animal model; index detection; LC-MS/MS

時間：2016-12-27 16:13

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161227.1613.048.html

2016-09-12,

2016-11-28

國家自然科學基金資助項目(No 81573685)；江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心重點項目(No ZDXM-2)

何書芬(1989-)，女，碩士生，研究方向：中藥臨床藥理，E-mail：l097089864@qq.com； 居文政(1965-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：中藥臨床藥物代謝動力學,通訊作者，E-mail：wzhju333@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.01.024

A

1001-1978(2017)01-0140-04

R-332；R241.3；R322.61；R363-332；R749.41