張小藝 鄭宏 王永強(qiáng) 王蕾

·論著·

梓醇外泌體對(duì)低血清培養(yǎng)致人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

張小藝 鄭宏 王永強(qiáng) 王蕾

目的 探討梓醇外泌體對(duì)低血清培養(yǎng)致人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法梓醇80 μmol/L預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞72小時(shí)后，收集細(xì)胞上清液，聚合物沉淀法提取細(xì)胞上清液外泌體；乙酰膽堿酯酶法測定外泌體含量；將提取出的外泌體加入低血清培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞中，24小時(shí)后，CCK-8法測定其細(xì)胞存活率。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，梓醇給藥組細(xì)胞外泌體分泌量明顯增多(P<0.05)；與空白外泌體組比較，梓醇外泌體能明顯升高細(xì)胞存活率(P<0.05)。結(jié)論梓醇可以促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞分泌外泌體，梓醇外泌體對(duì)低血清致SH-SY5Y細(xì)胞損傷有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。

梓醇； 外泌體； SH-SY5Y細(xì)胞

梓醇是來自于地黃中一種環(huán)烯醚萜苷的小分子量天然化合物，分子式為C15H22O10，分子量362.45。研究發(fā)現(xiàn)，梓醇可通過抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫、升高神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)等作用促進(jìn)神經(jīng)的修復(fù)和重塑[1-3]，是治療中樞神經(jīng)退行性病變的潛在藥物，但對(duì)于梓醇是如何發(fā)揮上述作用的目前研究較少。

最近研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是一類納米單位(小于200 nm)的膜性囊泡，由多種活體細(xì)胞釋放到細(xì)胞外，隨體液流至全身，外泌體具有無毒、無免疫原性等特性，并具有透過血腦屏障的能力[4-5]。外泌體攜帶了來自原細(xì)胞的生物遺傳信息，如mRNAs、蛋白質(zhì)等。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體廣泛參與細(xì)胞之間的交流，作用于靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)生理過程，外泌體還傳遞疾病信息，如內(nèi)皮細(xì)胞外泌體促使單核和淋巴細(xì)胞透過血腦屏障，擴(kuò)散炎癥反應(yīng)，造成脫髓鞘[6]。但經(jīng)過某些良性外源性因素修飾的外泌體可遞送相關(guān)信息，減少細(xì)胞損傷，促進(jìn)組織修復(fù)[7]如干擾素刺激樹突狀細(xì)胞釋放的外泌體能促進(jìn)MS大鼠髓鞘再生[8]；經(jīng)miR-150*修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能夠?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)揮抑癌作用[9]。

筆者推測梓醇通過修飾外泌體發(fā)揮對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察梓醇對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞外泌體分泌的影響，并進(jìn)一步采用低血清致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，觀察梓醇修飾過的外泌體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑

人胚胎來源的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)細(xì)胞由北京腦重大疾病研究院王曉民教授惠贈(zèng)。梓醇標(biāo)準(zhǔn)品(購于中國食品藥品鑒定研究所，批號(hào)：110808-201210，純度>98%)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Corning公司)；胎牛血清、青霉素-鏈霉素和0.25%胰酶(Gibco公司)；CCK-8試劑盒(日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)；Exosome Isolation kit試劑盒(美國101Bio公司)；EXOCET試劑盒(美國SBI公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

正置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；生物安全柜(新加坡藝思高科技有限公司)；臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)分析儀(美國Molecular Devices公司)；-80℃低溫冰箱(美國Thermo公司)；4℃冰箱(中國海爾公司)；VG3S25型渦旋震蕩器(IKA公司)；低溫生物離心機(jī)(德國Eppendorf AG公司)；超速離心機(jī)(日本Hitachi Koki Co公司)。

1.3 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基中(含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)，接種在75 cm2培養(yǎng)瓶中。在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育。每4～5天傳代一次。

1.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8測定SH-SY5Y細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，調(diào)其密度為3×105/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，并分別加入各組不含細(xì)胞的空白溶液。經(jīng)過處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育1.5～2小時(shí)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長檢測各孔的吸光度值(optical density,OD)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD值-實(shí)驗(yàn)組空白溶液OD值)/(空白對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組空白溶液OD值)×100%。

1.5 低血清致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型的建立

細(xì)胞正常培養(yǎng)2～3天后，接種在96孔培養(yǎng)板中，分為空白對(duì)照組和模型組。模型組分別用低血清(2.5%、1%、0.5% FBS)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)，空白對(duì)照用正常10% FBS培養(yǎng)。48小時(shí)后用CCK-8測定細(xì)胞存活率，確定低血清致SH-SY5Y細(xì)胞損傷的血清濃度。

1.6 梓醇給藥濃度的確定

細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，分為空白對(duì)照組、模型組和梓醇組。模型組和梓醇組用低血清(2.5%FBS)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，梓醇組分別用不同濃度的梓醇(60、80、100 μM)進(jìn)行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，24小時(shí)后用CCK-8測定細(xì)胞存活率，選擇梓醇給藥濃度。

1.7 聚合物沉淀法提取梓醇外泌體

細(xì)胞接種在75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入梓醇(80 μM)后培養(yǎng)3天，棄去含血清培養(yǎng)基，用PBS沖洗3～5遍，加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)基適量，孵育24小時(shí)，收集上清液，按美國101Bio公司生產(chǎn)的Exosome Isolation kit說明書提取細(xì)胞上清液中的外泌體。

1.8 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)

將提取的外泌體載于直徑為2 mm的銅網(wǎng)上，用濾紙將多余液體從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去。將2%磷鎢酸鹽溶液滴于銅網(wǎng)上，室溫環(huán)境下進(jìn)行負(fù)染，時(shí)間為5分鐘。蒸餾水輕柔沖洗兩次，用濾紙將多余液體吸出。將此銅網(wǎng)置于透射電鏡下，于80 KV下觀察外泌體形態(tài)。

1.9 外泌體含量的測定

用EXOCET試劑盒的乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)活性測定法檢測細(xì)胞分泌的外泌體含量，用酶標(biāo)儀在405 nm測定OD值。

1.10 梓醇修飾的外泌體對(duì)低血清致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用

細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。分為空白對(duì)照組、模型組、空白外泌體組和梓醇外泌體組。模型組、空白外泌體組和醇外泌體組均用低血清(2.5% FBS)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)，再分別加入空白低血清、空白外泌體、梓醇外泌體10 μL，空白對(duì)照組加正常血清(10% FBS)培養(yǎng)基10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，用CCK-8測定細(xì)胞存活率。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度血清對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

不同濃度血清(2.5%～0.5%)培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，存活率降低，模型組1組(2.5%)存活率為66.67%，下降約33.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此選擇2.5% FBS血清作為細(xì)胞損傷模型的濃度。見表1。

表1 不同濃度血清對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

2.2 不同梓醇濃度對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

隨著梓醇給藥濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸升高，當(dāng)梓醇的給藥濃度為80和100 μM時(shí)，細(xì)胞存活率較模型組明顯升高至86.14%和88.44%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此，選用80 μM為作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)梓醇給藥的濃度。見表2。

表2 不同濃度梓醇對(duì)低血清致SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型細(xì)胞存活率的影響±s,n=3)

注： 與空白對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05。

2.3 梓醇對(duì)細(xì)胞外泌體分泌的影響

梓醇(80 μM)干預(yù)細(xì)胞后，梓醇組每1×106個(gè)細(xì)胞分泌外泌體4.349×108個(gè)，高出正常組3倍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。透射電鏡下觀察到外泌體呈大小均勻的圓形或橢圓形的囊泡，直徑為30～100 nm，染色后可見膜狀結(jié)構(gòu)。見表3、圖1。

表3 梓醇干預(yù)細(xì)胞后分泌外泌體含量變化±s,n=2)

圖1 透射電子顯微鏡下的外泌體

2.4 梓醇外泌體對(duì)低血清致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用

外泌體濃度為4.0×106時(shí)，梓醇外泌體組與空白外泌體組相比細(xì)胞存活率升高約17%，存在顯著性差異(P<0.05)。見表4。

表4 梓醇外泌體干預(yù)細(xì)胞后存活率變化±s,n=3)

注： 與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與空白外泌體組比較，cP<0.05。

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)梓醇有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用，如梓醇可顯著提高APP/PS1轉(zhuǎn)基因阿爾茲海默病(Alzheimer's disease，AD)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力[10]；梓醇可以明顯升高衰老CHOm2細(xì)胞M2受體密度，改善海馬組織結(jié)構(gòu)萎縮引起的認(rèn)知和記憶障礙進(jìn)而治療AD[11]；梓醇可下調(diào)腦缺血大鼠感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)和勿動(dòng)蛋白(Nogo)-A及其Nogo受體蛋白表達(dá)，有助于改善軸突再生限制性微環(huán)境[12]；梓醇對(duì)局灶性腦缺血SD大鼠的神經(jīng)血管單元病變有明顯的保護(hù)作用，且能促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)[13]；梓醇能夠改善MPP+損傷小膠質(zhì)細(xì)胞BV2胞內(nèi)20S蛋白酶體含量和功能的藥物可以選擇作為帕金森綜合征治療的潛在藥物[14]；但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合外泌體的最新研究進(jìn)展，觀察梓醇對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞外泌體分泌的影響，并進(jìn)一步采用低血清致SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，觀察梓醇修飾過的外泌體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用。

外泌體可以參與細(xì)胞間信息交流，包括膜表面信號(hào)分子的直接作用，膜融合時(shí)內(nèi)容物的胞內(nèi)調(diào)節(jié)以及生物活性成分的釋放調(diào)節(jié)。在中樞系統(tǒng)疾病中神經(jīng)元軸索損傷后，外泌體充當(dāng)運(yùn)載體的角色促進(jìn)自身核糖體富集而起到神經(jīng)保護(hù)作用[15]。外泌體作為藥物投遞的內(nèi)源納米級(jí)運(yùn)載體，具有向細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)效率高、有靶向性、減輕免疫反應(yīng)及降低藥物毒副作用等特點(diǎn)[16-17]。如姜黃素外泌體通過減輕氧化應(yīng)激、減少緊密連接蛋白和黏附連接蛋白表達(dá)以恢復(fù)巰基丁氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞通透性[18]。在本實(shí)驗(yàn)研究中，梓醇預(yù)處理過的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，其外泌體分泌量明顯增高；并且，梓醇外泌體使細(xì)胞存活率也明顯升高，表明梓醇修飾的外泌體可以起到神經(jīng)保護(hù)作用，通過對(duì)存活率升高幅度的觀察，梓醇外泌體的保護(hù)作用和梓醇直接給藥的保護(hù)作用相似，提示外泌體攜帶了梓醇的藥物信息對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，但梓醇改變了外泌體哪些信號(hào)分子發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用還有待深入研究。

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(本文編輯：禹佳)

Protective effects of catalpol exosomes on damaged SH-SY5Y cells induced by low serum medium

ZHANGXiaoyi,ZHENGHong,WANGYongqiang,etal.

SchoolofTraditionalChineseMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,ChinaCorrespondingauthor:WANGLei,E-mail：tmwangl@ccmu.edu.cn

Objective To explore the protective effects of catalpol exosomes (C-Exos) on damaged SH-SY5Y cells induced by low serum medium. Methods Catalpol was pretreated with SH-SY5Y cells for 72 hours, and then the supernatants of the cells were collected. The polymer precipitation method was used to extract exosomes, acetylcholinesterase (AChE) method was used to detect the content of exosomes. The C-Exos were added in the cells induced by low serum medium for 24 hours, the cells viability was determined by CCK-8 method. Results Compared with the control blank, the contents of exosomes in catalpol group were significantly increased (P<0.05). Compared with the cells in blank exosomes group, the cell viability was significantly increased in the catalpol group (P<0.05)．Conclusion Catalpol can promote the SH-SY5Y cells to secrete exosomes, C-Exos have protective effects on damaged cells induced by low serum medium.

Catalpol; Exosomes; SH-SY5Y cells

國家自然科學(xué)基金(81273742、81573898)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃-長城學(xué)者項(xiàng)目(CIT&TCD20140329)

100069 北京，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院[張小藝(本科生)、鄭宏、王永強(qiáng)(碩士研究生)、王蕾]；中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[張小藝(本科生)、鄭宏、王永強(qiáng)(碩士研究生)、王蕾]

張小藝(1994- )，女，2012級(jí)在讀本科生。研究方向：中醫(yī)藥防治腦病的基礎(chǔ)研究。E-mail：872781176@qq.com

王蕾(1967- )，女，博士，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥防治腦病的基礎(chǔ)研究。E-mail：tmwangl@ccmu.edu.cn

R361+.3

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.02.006

2016-10-30)