全香花，趙園園，崔萌納，隋忠國

麒麟菜提取物對(duì)HepG2、H22肝癌細(xì)胞的抗癌作用及機(jī)制研究

全香花，趙園園，崔萌納，隋忠國*

目的 從麒麟菜中提取天然海藻色素糖蛋白(NSPG)，并觀察其抗腫瘤作用。方法 應(yīng)用溶劑浸提法從麒麟菜中提取NSPG，應(yīng)用IR、UV、液相-質(zhì)譜法、凝膠色譜法測(cè)定NSPG樣品的分子量及結(jié)構(gòu)特征等。采用MTT比色法測(cè)定NSPG作用后HepG2人肝癌細(xì)胞、小鼠H22肝癌細(xì)胞的體外活性。結(jié)果 本研究建立了常溫下從麒麟菜中提取NSPG的方法，并測(cè)定其理化性質(zhì)。人HepG2肝癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50、100 mg/L NSPG組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞增殖活性分別為0.62±0.02、0.54±0.01，低于空白對(duì)照組(0.87±0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；小鼠H22肝癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NSPG對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖活性隨NSPG濃度的升高而逐漸降低，抑制率逐漸升高，低、中劑量組的增殖活性、抑制率與高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 NSPG對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞、小鼠H22肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的腫瘤抑制作用。

天然海藻色素糖蛋白；肝癌細(xì)胞；體外抗腫瘤活性

0 引言

天然海藻色素糖蛋白(Natural seaweed pigment glycoprotein，NSPG)是從麒麟菜中提取的一種海藻多糖與藻膽蛋白的天然結(jié)合物。藻膽蛋白是紅藻和藍(lán)藻等藻類特有的捕光色素蛋白[1]，具有抗腫瘤、抗氧化等生物學(xué)功效[2-3]，但由于其含量低、性質(zhì)不穩(wěn)定、提取工藝復(fù)雜等問題，使其開發(fā)、利用受到限制。藻膽蛋白和海藻中的硫酸多糖均具有抗腫瘤作用[4-6]，因此，本研究從麒麟菜中提取了海藻多糖與藻膽蛋白呈天然結(jié)合狀態(tài)的海藻色素糖蛋白，并利用IR、UV、液相-質(zhì)譜法、凝膠色譜法確定NSPG樣品的分子量及結(jié)構(gòu)特征等。本研究采用體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法，評(píng)價(jià)了麒麟菜NSPG對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞、小鼠H22肝癌細(xì)胞的腫瘤抑制作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要材料 麒麟菜干品：青島海隆達(dá)生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器 濃硫酸(分析純)，乙醇(分析純)。紫外分光光度計(jì)(TU-1901型)：德國BRUKER公司；紅外光譜儀(TENSOR型)：德國BRUKER公司；離心機(jī)(TDL-5型)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；液相色譜-質(zhì)譜儀(BrukermaXis UHR-TOF LC型)：德國BRUKER公司；凝膠色譜儀(DAWN HELEOS-Ⅱ與OptilabrEX型，配Waters515HPLC Pump)：美國Wyatt公司；CO2培養(yǎng)箱(BNP-310)：日本TABAI ESPEC 公司；酶標(biāo)儀：瑞典RosysAnthos公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清：購自美國Gibco公司；環(huán)磷酰胺：購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

1.1.3 細(xì)胞株 人HepG2肝癌細(xì)胞株：上海細(xì)胞庫；小鼠H22肝癌細(xì)胞：山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 NSPG的制備與分析

1.2.1 NSPG制備 室溫下將洗凈的麒麟菜切為0.5～1.0 cm的長(zhǎng)條，置于pH 3.0的鹽酸溶液中浸提，將上述酸性浸提液進(jìn)行減壓抽濾，收集濾液調(diào)節(jié)pH值為4.5，再加入3倍體積的95%乙醇，攪拌，放置過夜，析出沉淀，真空抽濾得到濾紙上的沉淀部分，將沉淀分別用無水乙醇、丙酮洗滌，室溫干燥，得NSPG(圖1)。

圖1 NSPG的制備過程

1.2.2 NSPG組成與結(jié)構(gòu)分析 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用硫酸-苯酚法測(cè)定NSPG中多糖的含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定NSPG中蛋白質(zhì)的含量。用紫外、紅外光譜法測(cè)定多糖和蛋白質(zhì)的特征吸收峰。根據(jù)β-消除反應(yīng)和液-質(zhì)譜法確定糖苷鍵的類型，用凝膠色譜分析法測(cè)定NSPG的分子量。

1.3 NSPG體外抗腫瘤活性的測(cè)定 采用MTT比色法測(cè)定海藻色素糖蛋白對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞、小鼠H22肝癌細(xì)胞的抑制率。在無菌條件下，取HepG2人肝癌細(xì)胞和小鼠H22肝癌細(xì)胞懸液，配成瘤細(xì)胞密度為5×105/mL的細(xì)胞懸液，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制。高、中、低劑量組加入的NSPG濃度分別為100、50、10 mg/L，對(duì)照組加入等量雙蒸水，每組設(shè)3個(gè)平行樣，每孔加入100 μL。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中HepG2人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48 h，小鼠H22肝癌細(xì)胞組培養(yǎng)24 h。

用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處的吸光度值A(chǔ)，以此表示各組的細(xì)胞增殖活性，并按下列公式計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率(Inhibition rate，IR)。IR(%)=(腫瘤細(xì)胞對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)÷細(xì)胞對(duì)照組A值×100%。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料比較采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 NSPG的制備與結(jié)構(gòu)分析 利用等電點(diǎn)沉淀法建立從麒麟菜中提取NSPG的方法，制備足量的實(shí)驗(yàn)樣品。

NSPG外觀為棕紅色粉末，溶于水，不溶于乙醇乙醚等有機(jī)溶劑，其提取得率為8.3%。經(jīng)凝膠色譜分析，NSPG相對(duì)分子量為213.8 kDa。NSPG紫外光譜分析(圖2)其特征吸收峰，得吸收值為1.834，在280 nm處蛋白質(zhì)的吸收值為0.417，但吸收峰不明顯，說明蛋白質(zhì)的含量較低。用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定麒麟菜NSPG中蛋白質(zhì)的含量為2.04%，采用苯酚-硫酸法測(cè)定麒麟菜NSPG中多糖含量為93.3%。

NSPG紅外光譜(圖3)顯示，1 651 cm-1處有酰胺鍵的特征吸收。根據(jù)1 034 cm-1附近有吸收峰，確定NSPG的糖苷類型為吡喃型。

NSPG經(jīng)β-消除反應(yīng)前后紫外吸收有變化，提示NSPG中存在O-連接糖苷鍵。液-質(zhì)譜圖中(圖4)相鄰峰m/e有規(guī)律遞減，各峰之間相差均為115，說明其為天冬氨酸。證明NSPG中N-糖基化出現(xiàn)于“AsnX-Thr/Ser”三肽順序中的Asn(天冬氨酸)殘基的氨基氮上，所以NSPG同時(shí)存在N-連接糖苷鍵。

圖2 NSPG紫外光譜圖

圖3 NSPG紅外光譜

2.2 NSPG體外抗腫瘤活性研究

2.2.1 人HepG2肝癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 培養(yǎng)48 h后，50 mg/L NSPG組和100 mg/L NSPG組的細(xì)胞增殖活性分別為0.62±0.02、0.54±0.01，較空白對(duì)照組(0.87±0.01)降低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖4 NSPG液相-質(zhì)譜圖

組別只數(shù)12h增殖活性(A)抑制率(%)24h增殖活性(A)抑制率(%)48h增殖活性(A)抑制率(%)對(duì)照組100.40±0.01—0.55±0.01—0.87±0.01—10mg/L組100.37±0.016.980.51±0.01#7.410.80±0.01*#7.4950mg/L組100.36±0.04*10.970.44±0.01*11.100.62±0.02*#28.11100mg/L組100.34±0.01*14.460.43±0.01*21.880.54±0.01*37.56

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與100 mg/L組比較，P<0.05

2.2.2 小鼠H22肝癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果 由表2可見，高劑量(100 mg/L)NSPG組細(xì)胞增殖抑制率為25.87%。不同劑量NSPG對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖活性隨濃度的增加而降低，抑制率依次增高，低、中劑量(10、50 mg/L)組的增殖活性和抑制率與高劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，顯示NSPG對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖活性具有抑制作用，且呈劑量-效應(yīng)趨勢(shì)。

表2 不同劑量NSPG對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與高劑量組比較，P<0.05

3 討論

本研究首次建立了常溫下從麒麟菜中提取NSPG的方法，經(jīng)過對(duì)提取樣品分析測(cè)定，確定NSPG的相對(duì)分子量為213.8 kDa，多糖含量為93.3%，蛋白質(zhì)含量為2.04%。多糖和蛋白質(zhì)的連接方式為O-連接糖苷鍵，同時(shí)存在N-連接的糖苷鍵，樣品提取得率為8.3%。該方法與傳統(tǒng)的單純提取藻膽蛋白相比，具有提取工藝簡(jiǎn)便、成本低、產(chǎn)品穩(wěn)定性高、提取得率高等特點(diǎn)，適于大規(guī)模生產(chǎn)。

在對(duì)NSPG進(jìn)行HepG2人肝癌細(xì)胞增殖活性影響的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，50 mg/L和100 mg/L劑量組在12 h、24 h、48 h 時(shí)與對(duì)照組比較均有顯著差異，并且隨NSPG濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的抑制作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)。與王源等[7]報(bào)道藻膽蛋白濃度>30 mg/L時(shí)，對(duì)SMMC-7721細(xì)胞存在抑制作用，且隨蛋白濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)結(jié)果一致。小鼠H22肝癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量NSPG組細(xì)胞增殖抑制率為25.87%，不同劑量組NSPG對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性隨濃度的增加依次降低，而抑制率依次增高，且低、中劑量組的增殖活性和抑制率與高劑量組有顯著差異，表明NSPG對(duì)小鼠H22肝癌細(xì)胞的增殖活性具有抑制作用，且呈劑量-效應(yīng)的趨勢(shì)。

本研究顯示，100 mg/L NSPG對(duì)人HepG2肝癌細(xì)胞和小鼠H22肝癌細(xì)胞的抑制率分別為37.56%和25.87%，高劑量組人HepG2肝癌細(xì)胞和小鼠H22肝癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性較中、低劑量組顯著降低。與王勇等[8]研究結(jié)果(藻蛋白對(duì)體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，隨著藻膽蛋白的劑量從10 mg/L增高至80 mg/L，抑制率逐步提高)一致。

通過對(duì)NSPG進(jìn)行體外抗腫瘤活性測(cè)試，證實(shí)NSPG對(duì)人HepG2肝癌細(xì)胞和小鼠H22肝癌細(xì)胞具有較好的細(xì)胞抑制作用，表明NSPG同樣具有藻膽蛋白抑制腫瘤的生物活性特征。同時(shí)，NSPG具有提取工藝簡(jiǎn)單、得率高、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，適于大規(guī)模生產(chǎn)，為藻膽蛋白的開發(fā)應(yīng)用和抗腫瘤藥物的篩選提供了一個(gè)重要的研究方向，目前進(jìn)一步的研究仍在進(jìn)行中。

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Inhibitory effect of eucheuma abstracts on hepatoma HepG2 and H22 cells and its mechanisms

QUAN Xiang-hua,ZHAO Yuan-yuan,CUI Meng-na,SUI Zhong-guo*

(Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao 266003,China)

Objective To extract the natural seaweed pigment glycoprotein (NSPG) fromEucheuma,and evaluate the anti-tumor activity.Methods NSPG was extracted fromEucheumaby using isoelectric precipitation method,and the molecular weight and structural characteristics were determined by IR,UV,liquid chromatography mass spectrometric method and gel permeation chromatography.The cytotoxicityinvitroof HepG2 cells and H22 cells was assayed by MTT assay.Results The extraction method of NSPG fromEucheumaat room temperature was established and the physiochemical properties were elucidated.The proliferation activation of HepG2 in 50 mg/L NSPG group (0.62±0.02) and 100 mg/L NSPG group (0.54±0.01) were lower than that of control group (0.87±0.01) after being cultured for 48 hinvitro(P<0.05).The proliferation activity of H22 cellsinvitrodecreased gradually with the increase of dosage of NSPG (P<0.05).Conclusion NSPG exhibits different inhibitory activities on HepG2 cells and H22 hepatoma cellsinvitro.

Natural seaweed pigment glycoprotein(NSPG);Hepatoma cells;Anti-tumor activityinvitro

2016-06-06

青島大學(xué)附屬醫(yī)院，青島 266003

青島市科技發(fā)展資金項(xiàng)目(2014-14-046-SW)

10.14053/j.cnki.ppcr.201701006

*通信作者