賀飛燕，閆建俊，白云鳳，馮瑞云，施俊鳳

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原030031；3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原030031；

4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西太原030031）

啟動子的類型及應(yīng)用

賀飛燕1，2，閆建俊2，3，白云鳳2，3，馮瑞云2，施俊鳳4

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，作物遺傳與分子改良山西省重點實驗室，山西太原030031；3.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原030031；

4.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西太原030031）

基因功能和遺傳改良生物現(xiàn)狀是生物學(xué)重點研究內(nèi)容之一，基因表達(dá)的調(diào)控主要由上游的啟動子控制。綜述了啟動子的結(jié)構(gòu)組成和特征，并介紹了3種類型的啟動子即組成性啟動子、組織特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子在植物基因工程中的應(yīng)用，最后探討了啟動子應(yīng)用尚存在的問題，并作出了進一步展望。

組成性啟動子；組織特異性啟動子；誘導(dǎo)型啟動子；調(diào)控；應(yīng)用

基因表達(dá)的程序、時間和位置在不同層次上受不同的調(diào)節(jié)因素控制，這種控制機制不僅決定基因表達(dá)的水平，也決定基因表達(dá)的時空順序。因此，基因表達(dá)具有時間特異性和空間特異性，基因表達(dá)在時空層面上調(diào)控生物體的生長和發(fā)育。而啟動子是基因表達(dá)的重要調(diào)控元件，所以深入研究啟動子的結(jié)構(gòu)和功能，對于從分子層面上更好地了解生物的生長發(fā)育、防御系統(tǒng)、疾病等都具有重要意義。

1 啟動子的結(jié)構(gòu)和特征

1.1 啟動子的結(jié)構(gòu)

啟動子（promoter）是指RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合，能正確有效起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通常位于基因5′端上游。在DNA轉(zhuǎn)錄為RNA這一過程中，啟動子發(fā)揮重要作用。真核啟動子中包含了許多調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的元件，控制著基因時間、空間的特異性表達(dá)，比原核復(fù)雜。啟動子包含核心啟動子元件（core promoter element）和上游啟動子元件（upstreampromoter element）。其中，核心啟動子元件是指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始點（transcription initiation site）和TATA框（TATA box）；轉(zhuǎn)錄起始點也稱帽子位點（cap site），通常位于翻譯起始密碼子（ATG）上游-70～-40 bp處，是與新生RNA鏈第1個核苷酸相對應(yīng)DNA鏈上的堿基，通常為腺嘌呤（A），TATA框位于5′端轉(zhuǎn)錄起始點上游約20～30個核苷酸的地方，是一個短的核苷酸序列，其堿基順序為TATAATAA，為RNA聚合酶的重要接觸點，使RNA聚合酶準(zhǔn)確地識別轉(zhuǎn)錄的起始點并開始轉(zhuǎn)錄。上游啟動子元件通常包括位于-70 bp附近的CAAT盒（CAAT box）和GC盒（GC box）以及距轉(zhuǎn)錄起始點更遠(yuǎn)的上游元件，CAAT盒是位于5′端轉(zhuǎn)錄起始點上游約70～80個核苷酸的地方，其堿基順序為GGCTCAATCT，是RNA聚合酶的另一個結(jié)合點，一般控制著轉(zhuǎn)錄的起始頻率，而不影響轉(zhuǎn)錄的起始點；GC盒通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游約-90 bp處，處于TATA盒與CAAT盒之間，或CAAT框上游，其保守序列通常為5'GGGCGG3′，以單拷貝或多拷貝形式存在；GC盒的方向不影響其功能，但GC盒須與另一種特異的轉(zhuǎn)錄因子SP1結(jié)合才能促進基因轉(zhuǎn)錄；上游啟動子元件通過與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合來提高或改變轉(zhuǎn)錄效率，每個基因的啟動子元件和位置各不相同，這使得不同的基因表達(dá)呈現(xiàn)出不同的時間與空間表達(dá)調(diào)控。

1.2 啟動子的特征

1.2.1 序列特異性 啟動子序列通常含有TATA框、CAAT框和GC框等，序列框中堿基的增加或缺失都會不同程度地影響轉(zhuǎn)錄速度和遲滯轉(zhuǎn)錄啟動的時間。

1.2.2 方向性 啟動子具有方向性，有雙向啟動子和單向啟動子2類，在雙向啟動子即正反2種方向中只有一種具有啟動功能。

1.2.3 位置特異性 啟動子一般位于所啟動轉(zhuǎn)錄基因的上游或基因內(nèi)部靠前處。如果位于基因的上游較遠(yuǎn)處或者位于基因下游，一般不會發(fā)揮作用。

1.2.4 種屬特異性 不同生物或同一生物的不同種屬以及同一生物的不同組織的啟動子類型不同，但一般來說，2種生物的親緣關(guān)系越近，其啟動子通用的可能性越大。

2 啟動子的類型

2.1 組成型啟動子

組成型啟動子驅(qū)動基因在所有細(xì)胞、組織和器官中持續(xù)表達(dá)，不受時空及外界因素的影響，亦稱之為非特異性表達(dá)啟動子。在植物基因工程中，組成型啟動子主要來自微生物和植物。病毒來源的組成型啟動子如CaMV35S啟動子、BSV啟動子、FMV啟動子等在植物中均可高效啟動基因表達(dá)。農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶Nos啟動子和章魚堿合成酶基因Ocs啟動子是早期構(gòu)建嵌合基因的啟動子，具有與真核生物啟動子類似的TATA盒和CAAT盒，均能在植物細(xì)胞中表達(dá)，并且無組織特異性，其中以Nos啟動子最常用，但Nos啟動子在禾本科植物中的表達(dá)能力很弱。植物來源的啟動子如水稻的actin1基因啟動子、玉米的Ubiquition1基因啟動子、煙草的U－bi.b4基因啟動子等組成型啟動子也已經(jīng)被克隆和使用[1-3]。

2.2 組織特異性啟動子

組織特異性啟動子調(diào)控基因只在某些特定的部位或器官（根、葉片、子房、花粉、花原基、種皮等）中表達(dá)，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性[4]。經(jīng)序列分析研究發(fā)現(xiàn)，組織特異性啟動子中一般具有特異序列，如種子特異性啟動子中的“TACACAT”序列、馬鈴薯塊莖中的“TAAAG”序列等都是基因特異表達(dá)所必需的[5-8]。啟動子中控制基因組織特異性表達(dá)的序列長度一般不超過30 bp，通常位于核心元件TATA框的上游。不同物種間相同基因的啟動子常具有保守的基序[9-11]，如種子特異性啟動子中的RY基序（CATG-CATG）、胚乳特異啟動子中的保守基序TGTAAAG。

果實特異性啟動子可以控制外源基因在果實中高效表達(dá)，研究較多的是對乙烯利應(yīng)答的基因啟動子。常見的果實特異啟動子有番茄PG，2A11，E4/ E8，ACO1啟動子、桃ACO1啟動子、甜瓜cucumisin啟動子、西瓜AGPL1啟動子。此外，其他植物來源如蘋果ACC氧化酶啟動子、矮牽牛FBP7啟動子、草莓抗壞血酸過氧化物酶APX基因啟動子等也具有果實特異的調(diào)控功能。

種子/籽粒特異性啟動子可以啟動與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)有關(guān)的基因表達(dá)，從而提高食品的品質(zhì)和質(zhì)量，如大豆β-conglycinin基因能導(dǎo)致動物產(chǎn)生過敏反應(yīng)，該啟動子只在胚成熟的中、后期發(fā)揮作用；與蛋白有關(guān)的向日葵蛋白基因和菜豆β-phaseolin基因啟動子只在發(fā)育的種子中發(fā)揮作用。

花特異性啟動子有擬南芥花器官發(fā)育特異性啟動子leafy，ap1，ap3，P1等和煙草花粉特異啟動子TA29、番茄花粉特異啟動子lat52等。這類啟動子被廣泛用來創(chuàng)造核雄性不育植物。

根特異性啟動子有煙草的TobRB6啟動子、擬南芥pyk10啟動子、松樹PmPR10-1.14啟動子等。這類啟動子在提高植物利用肥料、適應(yīng)土壤環(huán)境、提高對土壤病害抗性基因工程方面具有重要作用。

葉特異性啟動子與光合作用相關(guān)，如編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亞基的rbcS基因啟動子。

2.3 誘導(dǎo)型啟動子

誘導(dǎo)型啟動子屬于增強子，通常是指在光、溫度、鹽、激素等物理或化學(xué)信號作用下，使得目的基因的轉(zhuǎn)錄水平有所提高。這類啟動子必須有外界信號的刺激，通過自身具有的特異性序列來調(diào)控基因的表達(dá)。誘導(dǎo)型啟動子種類繁多，如光誘導(dǎo)啟動子、溫度誘導(dǎo)啟動子、化學(xué)物質(zhì)（NaCl等）誘導(dǎo)啟動子、激素誘導(dǎo)啟動子以及脅迫誘導(dǎo)型啟動子。脅迫誘導(dǎo)型啟動子在干旱、病害等脅迫因素條件下誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，以保證植物的正常生長。當(dāng)解除脅迫因素，特定基因則停止表達(dá)，不但提高了植物在逆境中的抗性，同時也節(jié)省了植物體內(nèi)的資源。

3 啟動子的應(yīng)用

3.1 組成型啟動子的應(yīng)用

花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子廣泛用于植物基因工程中，尤其是雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。2000年，郝林等[12]研究表明，CaMV35S雙啟動子驅(qū)動報告基因gus的平均表達(dá)強度在擬南芥中是CaMV35S啟動子的12倍以上；2014年，賈小明等[13]研究發(fā)現(xiàn)，CaMV35S啟動子驅(qū)動的FT轉(zhuǎn)基因楊樹具有明顯的早花性；2015年，陽淑金等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因菊花中35S啟動子比2*35S啟動子驅(qū)動gus基因高量表達(dá)；單子葉植物如玉米、水稻、煙草等中有許多啟動子也被廣泛應(yīng)用在單子葉中外源基因表達(dá)載體的構(gòu)建上，這些啟動子有玉米乙醇脫氫酶基因Adh1啟動子、有水稻肌動蛋白基因Act1啟動子、煙草花藥絨氈層細(xì)胞特異性啟動子TA29等[15]。徐子勤等[16]研究玉米泛素-1（Ubi-1）啟動子在可育轉(zhuǎn)基因玉米植株中的表達(dá)活性表明，gus基因在除花藥壁以外的其他所試組織中均可以有效表達(dá)；KANG等[17]研究表明，煙草的Ubi.u4基因的啟動子啟動gus基因的表達(dá)量是CaMV35S的7倍；NORRIS等研究表明，擬南芥泛素UBQ10啟動子和內(nèi)含子同時作用是啟動子單獨作用活性的4倍[18]；INGRID等[19]研究表明，番茄泛素基因Ubq1-1啟動子驅(qū)動報告基因在煙草中表達(dá)；GARBARINO等[20]研究表明，馬鈴薯泛素基因ubi7啟動子和其后的內(nèi)含子序列共同驅(qū)動gus表達(dá)量是啟動子單獨使用時的11倍；BINET等[21]研究表明，向日葵的UbB1啟動子的內(nèi)含子不影響gus基因的表達(dá)。

3.2 組織特異性啟動子的應(yīng)用

將組成型啟動子應(yīng)用于植物基因工程，很有可能會影響植物的正常發(fā)育，而且其安全性也遭到人們的質(zhì)疑。選擇使用能控制外源基因在特異的細(xì)胞、組織、器官中表達(dá)的研究已取得一定進展（表1）。利用組織特異性啟動子限制外源基因只在植物的特定位置表達(dá)，既減少了資源的浪費，還能有效提高外源基因的表達(dá)效果。在作物遺傳育種中可通過應(yīng)用不同的組織特異性啟動子進行多個基因共轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)不同基因在不同部位特異表達(dá)，實現(xiàn)作物品質(zhì)的改良和各種抗性的提高。

表1 組織特異性啟動子在植物基因工程中的作用

續(xù)表1

3.3 誘導(dǎo)型啟動子的應(yīng)用

誘導(dǎo)型啟動子在植物基因工程中應(yīng)用較為廣泛[51-54]。研究者已從小麥、煙草、棉花等多種植物中分離并克隆得到植物捕光葉綠素a/b蛋白復(fù)合體基因（CAB）的啟動子，研究表明，該啟動子具有較強的光依賴性和組織特異性，屬于光誘導(dǎo)啟動子[55]。作為植物光合作用中碳同化途徑的關(guān)鍵酶——核酮糖1，5-二磷酸羧化酶，是由大小2種亞基構(gòu)成。1980年，黃海群等[56]首次從豌豆的cDNA庫中克隆得到第1個小亞基（RBCS）基因，之后相繼從擬南芥、大麥、煙草、水稻等植物中克隆了RBCS基因，研究表明，該基因于光誘導(dǎo)條件下啟動轉(zhuǎn)錄，而且還表現(xiàn)出綠色組織特異性。魏桂民等[57]利用馬鈴薯茄啶半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（solanidine galactosyltransferases，SGT1）基因起始密碼子上游2 183 bp的啟動子序列轉(zhuǎn)化煙草，通過GUS報告基因證明，該啟動子在煙草的根莖葉中均有表達(dá)，而且是一種光誘導(dǎo)型啟動子。脅迫誘導(dǎo)型啟動子如生物脅迫型（Prp1-1基因啟動子、GstA1基因啟動子、PPP1啟動子、PPP2啟動子、PPP3啟動子等）、環(huán)境脅迫型（大麥Lea基因的3個啟動子HVA1s，Dhn4s，Dhn8s，水稻Lea基因的2個啟動子wsi18j和rab16Bj，rd29A啟動子，OsABA2基因啟動子等）、熱誘導(dǎo)型（LeMTsHSP等）、低溫誘導(dǎo)型（擬南芥rd29A，cor15A和adh，油菜bn115，小麥mwes120和玉米mlip 15等基因啟動子）、鹽誘導(dǎo)型（Rab16A，BADH，AmCMO基因啟動子）以及傷誘導(dǎo)啟動子（PinⅡ，Win3基因啟動子）能被相應(yīng)的逆境脅迫信號激活，促進相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子與啟動子中的順式作用元件結(jié)合，調(diào)控下游基因表達(dá)，對脅迫信號產(chǎn)生響應(yīng)，抵御不良環(huán)境，使植物正常生長。此外，激素誘導(dǎo)表達(dá)啟動子如水楊酸效應(yīng)啟動子（as-1，PR-1，GH2/4基因啟動子）、脫落酸效應(yīng)啟動子（RD29B基因啟動子）、赤霉素效應(yīng)啟動子（Amy32b基因啟動子）、生長素效應(yīng)啟動子（ARF，GH3基因啟動子）、乙烯和甲基茉莉酮酸效應(yīng)啟動子（MeLTI6A，Pib基因啟動子）等在激素誘導(dǎo)基因表達(dá)過程中，激素首先與植物體內(nèi)天然受體結(jié)合，受體蛋白激活再作用于相應(yīng)啟動子序列以驅(qū)動下游基因的表達(dá)，從而引起一系列生理反應(yīng)[58]，而不是植物激素直接作用于啟動子序列。

4 問題和展望

基因的表達(dá)即遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯，包括組成性和適應(yīng)性表達(dá)2種，具有時空特異性?；蚴欠癖磉_(dá)以及在何時何地表達(dá)都是受調(diào)控的，啟動子作為重要的順式調(diào)控元件，了解啟動子的結(jié)構(gòu)、特點和功能非常重要。近幾年，越來越多的人開展了啟動子研究，并克隆獲得多種啟動子，并就其如何準(zhǔn)確地調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯有了深刻認(rèn)識。但基因表達(dá)過程繁瑣，許多問題有待解決。如將病毒來源的啟動子應(yīng)用到植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，啟動子也有可能與對人類有害的病毒基因發(fā)生重組，致使病毒基因大量表達(dá)，因此，其安全性受到很大的質(zhì)疑；這些啟動子還有可能啟動植物中的基因異常表達(dá)，影響植物的正常生長。再如組織特異性和誘導(dǎo)性的啟動子具有一定的保守性，G-box通常受光敏色素A誘導(dǎo)，參與多種信號調(diào)節(jié)，B-box是種子特異性啟動子的保守區(qū)[59-61]。

隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展，可根據(jù)需要選擇或人工構(gòu)建合適的啟動子，從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平等方面更好地調(diào)控基因的表達(dá)；利用各類啟動子還可闡明植物的生長發(fā)育、分化及繁殖過程和機理以及在植物特定的部位或發(fā)育階段生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)或其他代謝產(chǎn)物。目前，人們已經(jīng)嘗試?yán)弥参镞@個天然的生物反應(yīng)器進行目標(biāo)產(chǎn)物的商業(yè)化生產(chǎn)，并初見成效[62]?？傊瑔幼幼鳛榛虮磉_(dá)的重要調(diào)控元件，將在植物基因工程領(lǐng)域發(fā)揮更為重要的作用。

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Types and Applications of Promoters

HE Feiyan1，2，YANJianjun2，3，BAI Yunfeng2，3，F(xiàn)ENGRuiyun2，SHI Junfeng4
（1.College ofBioengineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofCrop Sciences，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Shanxi KeyLaboratoryofCrop Genetics and Molecular Improvement，Taiyuan 030031，China；3.KeyLaboratoryofLoess Plateau Crop Gene Resources and GermplasmCreation，MinistryofAgriculture，Taiyuan 030031，China；4.Institute ofAgricultural Product Storage and Fresh Keeping，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

To clarify the status of gene function and genetic improvement is one of the key research contents of biology.Regulation of gene expression is mainly controlled by upstream promoter.This paper reviews the start sub structure and characteristics,and introduces the three types of promoter that is composed of start,tissue specific promoter and inducible promoter in plant genetic engineeringapplication.Finally,the existingproblems ofpromoter application are discussed,and makes a prospect offurther.

constitutive promoter;tissue specific promoter;inducible promoter;control;application

Q943

：A

：1002-2481（2017）01-0115-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.01.30

2016-05-10

國家自然科學(xué)基金項目（30971838）；山西省自然科學(xué)基金項目（201601D011075）

賀飛燕（1991-），女，山西臨汾人，在讀碩士，研究方向：作物分子育種。白云鳳為通信作者。