韋榮飛，李夢(mèng)媛，楊星九，朱瑞敏，徐大模，高 苒

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

Smad3對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移的影響

韋榮飛，李夢(mèng)媛，楊星九，朱瑞敏，徐大模，高 苒*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

目的 過表達(dá)、敲低或抑制Smad3的活性，探討Smad3對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移的影響。方法 設(shè)計(jì)擴(kuò)增Smad3基因全長(zhǎng)編碼序列cDNA的引物，通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體，同時(shí)設(shè)計(jì)并合成靶向Smad3的siRNA序列，在A549和HeLa細(xì)胞中過表達(dá)或敲低Smad3，或者利用Smad3的抑制劑SIS3 2 μM處理細(xì)胞，采用細(xì)胞劃痕的方法研究Smad3對(duì)A549和HeLa細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果 利用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體。過表達(dá)Smad3促進(jìn)A549和HeLa細(xì)胞的遷移。敲低Smad3抑制A549和HeLa細(xì)胞的遷移。SIS3抑制Smad3的活性導(dǎo)致A549和HeLa細(xì)胞的遷移速率變慢。結(jié)論 Smad3促進(jìn)A549和HeLa細(xì)胞的遷移。

Smad3；過表達(dá)載體；RNA干擾；SIS3；細(xì)胞遷移

TGF-β(transforming grpwth factor beta，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)信號(hào)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要的信號(hào)通路，機(jī)體對(duì)TGF-β信號(hào)通路響應(yīng)的敏感性降低，將會(huì)導(dǎo)致腫瘤的形成[1]。經(jīng)典的TGF-β信號(hào)通路由TGF-β I型和II型受體(TGFBR1，TGFBR2)介導(dǎo)，TGFBR1和TGFBR2與TGF-β結(jié)合后能夠磷酸化下游R-Smads(receptor-activated Smads)蛋白，包括Smad2和Smad3[2,3]。激活的R-Smads蛋白隨后與Smad4結(jié)合并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[4-6]。正常的生理?xiàng)l件下，在多種組織器官中，包括乳房組織，Smad3能夠抑制細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而在乳腺癌晚期，Smad3能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[7]。2015年，Rodney B Luwor等在MolecularCancer雜志發(fā)表文章揭示，與非遷移細(xì)胞相比，遷移的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，Smad3具有更高的活性[8]。除了乳腺癌細(xì)胞，Smad3是否也能影響其他類型的癌細(xì)胞的遷移呢？為探討該科學(xué)問題，我們通過構(gòu)建pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體，檢測(cè)過表達(dá)Smad3后對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞遷移的影響。同時(shí)，通過RNAi干擾及Smad3抑制SIS3處理細(xì)胞敲低Smad3的蛋白水平或抑制Smad3的活性，進(jìn)一步驗(yàn)證Smad3對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

載體構(gòu)建PCR引物由上海維基生物科技有限公司合成；Taq polymerase、dNTP購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；限制性內(nèi)切酶Sal I、Not I及T4 DNA連接酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；質(zhì)粒提取盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；胎牛血清、DMEM、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RIPA裂解液購(gòu)自Sigma公司；蛋白Marker及發(fā)光底物購(gòu)自Thermo公司；Lipofectamine 2000及RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Life Technologies公司。HEK-293T、HeLa和A549細(xì)胞系為本實(shí)驗(yàn)室所凍存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1.1 Smad3 DNA目的片段的獲得

提取HeLa細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行cDNA擴(kuò)增；根據(jù)CDS序列(NM_005902.3)設(shè)計(jì)含有Sal I和Not I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物序列；以反轉(zhuǎn)錄的Smad3 cDNA作為模板，擴(kuò)增Smad3 DNA目的片段，條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min 20 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.1.2 酶切

利用Sal I和Not I限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR獲得的Smad3 DNA目的片段及pCMV-Myc-vector進(jìn)行酶切，酶切條件為37℃ 過夜。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，紫外燈下切割含有目的條帶的凝膠塊，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.1.3 連接及轉(zhuǎn)化

利用T4 DNA連接酶將酶切回收后的Smad3 DNA片段和線性pCMV-Myc-vector進(jìn)行連接，連接條件為16℃過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，在含有氨芐霉素的LB平板上篩選克隆。挑取陽(yáng)性克隆，過夜搖菌擴(kuò)增。

1.2.1.4 質(zhì)粒提取、酶切鑒定及測(cè)序

利用質(zhì)粒提取試劑盒提取陽(yáng)性菌中的質(zhì)粒。采用Sal I和Not I限制性內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Smad3進(jìn)行雙酶切鑒定，并以1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證片段大小，同時(shí)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。

1.2.1.5 HeLa細(xì)胞和A549細(xì)胞的培養(yǎng)

HEK-293T、HeLa和A549細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.2.1.6 質(zhì)粒的表達(dá)檢測(cè)

用胰酶將HEK-293T細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液并對(duì)24孔板進(jìn)行鋪板，24 h后，通過Lipofectamine 2000將0.8 μg的pCMV-Myc-vector和重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Smad3分別轉(zhuǎn)染。24 h后，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，加入等體積的2×loading buffer，沸水煮15 min，得到蛋白樣品。隨后利用Myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Smad3的表達(dá)情況。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)

用胰酶將HeLa和A549細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液并對(duì)6孔板進(jìn)行鋪板，24 h后，通過Lipofectamine 2000或RNAiMax轉(zhuǎn)染試劑將3 μg的重組質(zhì)粒pCMV-Myc-Smad3或Smad3的siRNA分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染。40 h后，用20 μL槍頭沿直線對(duì)6孔板中長(zhǎng)滿的細(xì)胞進(jìn)行劃痕，0 h、24 h及48 h時(shí)分別拍照記錄細(xì)胞的遷移情況。Smad3抑制劑SIS3(工作濃度2 μM)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，劃痕及記錄方法同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

細(xì)胞遷移劃痕實(shí)驗(yàn)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，并利用ZEN 2軟件測(cè)量劃痕間距，以時(shí)間點(diǎn)0 h劃痕寬度作為標(biāo)準(zhǔn)即100%，其他時(shí)間點(diǎn)劃痕間距與0 h劃痕間距的比值即為該時(shí)間點(diǎn)劃痕兩側(cè)的相對(duì)距離(百分比)，相對(duì)距離越小，則說明相對(duì)遷移速率越大。利用Graphpad Prism 7對(duì)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，P< 0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體的構(gòu)建

Smad3蛋白由425個(gè)氨基酸組成，其主要包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：MH1和MH2結(jié)構(gòu)域(圖1A)。MH1和MH2對(duì)于Smad3正常生物學(xué)功能的發(fā)揮至關(guān)重要。我們以cDNA作為模板，用引物Smad3-F/R(表1)進(jìn)行擴(kuò)增，選擇Sal I和Not I分別為上下游內(nèi)切酶切割位點(diǎn)(圖1B)，得到與預(yù)期片段大小相符的特異性片段(圖2A)。利用Sal I和Not I對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，通過T4 DNA連接酶將酶切產(chǎn)物連接至pCMV-Myc載體上。經(jīng)測(cè)序比對(duì)及圖2B酶切鑒定結(jié)果顯示，Smad3 DNA全長(zhǎng)片段已成功插入pCMV-Myc載體上。如圖2C，Western blot結(jié)果顯示，與HEK-293T細(xì)胞中只轉(zhuǎn)染了Myc-vector的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染Myc-Smad3過表達(dá)質(zhì)粒24 h后，在約55 kDa大小處檢測(cè)到Smad3的過表達(dá)條帶，表明pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體構(gòu)建成功。

表1 pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體構(gòu)建所需引物

注：(A)為Smad3蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖，主要包括MH1和MH2結(jié)構(gòu)域；(B)為pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體構(gòu)建示意圖，其中，選取Sal I和Not I分別為上下游限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)。圖1 Smad3蛋白和pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體構(gòu)建示意圖 Note.(A)indicates the structure diagram of Smad3, including MH1 and MH2 domain;(B)indicates the plasmid profile of pCMV-Myc-Smad3.Fig.1 Structure diagram of Smad3 and pCMV-Myc-Smad3 plasmid construction.

注：(A)為利用引物Smad3-F/R擴(kuò)增Smad3 DNA片段；(B)為Sal I/Not I酶切鑒定pCMV-Myc-Smad3質(zhì)粒；(C)為HEK-293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)質(zhì)粒，Myc-vector作為陰性對(duì)照，利用Myc標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)Smad3的過表達(dá)情況。圖2 pCMV-Myc-Smad3過表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)檢測(cè)Note.(A)indicates PCR for amplification of Smad3 DNA;(B)indicates the restriction enzyme digestion for pCMV-Myc-Smad3 by Sal I + Not I;(C)indicates the detection of protein expression level of pCMV-Myc-Smad3 in HEK-293T by Western blot.Fig.2 Construction of pCMV-Myc-Smad3 plasmid

2.2 Smad3抑制劑SIS3對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞和人宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移的影響

SIS3是Smad3的抑制劑，其能有效抑制Smad3的磷酸化，進(jìn)而阻止Smad3進(jìn)入細(xì)胞核參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。為研究SIS3對(duì)細(xì)胞遷移的影響，首先，在A549細(xì)胞中檢測(cè)SIS3對(duì)Smad3的抑制作用，以證明SIS3的活性。如圖3所示，SIS3能夠有效抑制Smad3的磷酸化。與DMSO處理組相比，含2 μM SIS3的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，劃痕后0、24、48 h，A549(圖4A)和HeLa(圖4B)細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，SIS3能夠有效抑制細(xì)胞的遷移。

注：上圖分別為2 μM SIS3處理A549細(xì)胞(A)和HeLa細(xì)胞(B)后進(jìn)行劃痕，0、24、48 h時(shí)拍照觀察細(xì)胞的遷移情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，DMSO處理組作為對(duì)照組。與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.001。圖4 Smad3抑制劑SIS3能夠有效抑制A549細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的遷移Note. The above results indicate the inhibitor of Smad3, SIS3, significantly inhibits cell migration of A549 (A) and HeLa (B) cells;*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，compared with the normal group.Fig.4 The inhibitory effect of SIS3 on cell migration of A549 and HeLa cells

注：上圖為Western blot檢測(cè)A549細(xì)胞中Smad3抑制劑SIS3對(duì)Smad3活性(磷酸化)的抑制作用。圖3 Smad3抑制劑SIS3對(duì)Smad3活性的抑制效應(yīng)Note. The above result shows the inhibitor of Smad3, SIS3, has significant inhibitory effect on Smad3 activity. Fig.3 The inhibitory effect of SIS3 on Smad3

2.3 敲低或過表達(dá)Smad3對(duì)A549和HeLa細(xì)胞遷移的影響

如圖5所示，與對(duì)照組相比，通過RNAi干擾技術(shù)敲低A549(圖5A)和HeLa(圖5B)細(xì)胞中內(nèi)源的Smad3后，劃痕后0、24、48 h細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，敲低Smad3明顯抑制細(xì)胞的遷移。相反，在A549(圖5A)和HeLa(圖5B)細(xì)胞中過表達(dá)Smad3，劃痕后0、24、48 h細(xì)胞遷移結(jié)果顯示，過表達(dá)Smad3明顯促進(jìn)細(xì)胞遷移。以上結(jié)果表明，Smad3促進(jìn)A549和HeLa細(xì)胞的遷移。

注：上圖分別為A549細(xì)胞(A)和HeLa細(xì)胞(B)中敲低或過表達(dá)Smad3后進(jìn)行劃痕，0、24、48 h時(shí)拍照觀察細(xì)胞的遷移情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Con組作為對(duì)照組。與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。圖5 敲低或過表達(dá)Smad3能夠明顯抑制或促進(jìn)A549細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的遷移Note. The above results show silencing of endogenous Smad3 or overexpression of Smad3 in A549 (A) or HeLa(B)cells can effectively inhibits or promotes cell migration;*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，compared with the normal group.Fig.5 Knockdown or overexpression of Smad3 inhibits or promotes cell migration

3 討論

癌癥是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病之一，其中，約90%以上的癌癥患者死于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。近年來，人們對(duì)腫瘤形成的分子機(jī)制展開了大量的研究，為人類治療癌癥提供了多個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[9-11]。前期報(bào)道揭示，TGF-β與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌等[12-14]。在正常的生理?xiàng)l件下，TGF-β信號(hào)能夠抑制上皮細(xì)胞的增殖，然而，在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中，TGF-β則誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及血管生成[15,16]。Smad3是TGF-β信號(hào)通路中的一個(gè)重要分子，前期報(bào)道揭示，在乳腺癌晚期，Smad3異常活化，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[7,8]。SIS3作為Smad3的抑制劑，能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3的磷酸化及Smad3-Smad4的相互作用，進(jìn)而抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[17]。本研究通過過表達(dá)、敲低Smad3或利用SIS3處理A549和HeLa細(xì)胞抑制內(nèi)源Smad3的活性，然后檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化，從而闡明Smad3對(duì)非小細(xì)胞肺癌和宮頸癌細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示，Smad3促進(jìn)A549和HeLa細(xì)胞的遷移。Smad3調(diào)控細(xì)胞遷移的詳細(xì)作用機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，結(jié)合前期相關(guān)報(bào)道，我們發(fā)現(xiàn)，Smad3不僅能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移，也能促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌和宮頸癌細(xì)胞的遷移。這提示，在人類多種腫瘤類型中，Smad3促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移具有一定的普遍性。因此，后續(xù)靶向Smad3活性抑制藥物的開發(fā)將具有很大的臨床應(yīng)用前景，也為腫瘤治療提供新的途徑。

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Effect of Smad3 on cell migration of A549 and HeLa cells

WEI Rong-fei, LI Meng-yuan, YANG Xing-jiu, ZHU Rui-min, XU Da-mo, GAO Ran*

(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences &Comparative Medical Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021，China)

Objective To investigate the effect of Smad3 on cell migration of A549 and HeLa cells. Methods Primers for pCMV-Myc-Smad3 plasmid construction and siRNA targeting Smad3 were designed and synthesized. pCMV-Myc-Smad3 plasmid was constructed with molecular cloning techniques. Overexpression of Smad3 with Myc-tag or silencing of endogenous Smad3, and then scratch assay was used to detect the migration ability of A549 and HeLa cellsinvitro. Results pCMV-Myc-Smad3 plasmid was successfully constructed. Overexpression of Smad3 significantly up-regulated the migration rate of A549 and HeLa cells. Conversely, in the same cells, silencing of endogenous Smad3 or treatment with Smad3 inhibitor, SIS3, down-regulated the migration rate. Conclusions Smad3 promotes cell migration of A549 and HeLa cells.

Smad3; Overexpression vector; RNAi; SIS3; Cell migration

協(xié)和青年基金資助，中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(3332016077)；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資助(2016ZX310033)；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2015000020124G073)。

韋榮飛(1990-)，女，助理研究員，研究方向：免疫與腫瘤。E-mail: weirongfei2010@163.com

高苒(1980-)，女，副研究員，研究方向：腫瘤學(xué)、免疫學(xué)。E-mail: E-mail: gaoran26@hotmail.com

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0011-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.003

2016-06-14