李克娟，黃 昊，高 苒

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021)

人源腫瘤異種移植模型在精準腫瘤醫(yī)學(xué)中的研究進展

李克娟，黃 昊，高 苒*

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021)

癌癥是由于物理、化學(xué)、病毒等致癌因子導(dǎo)致的原癌基因和抑癌基因突變從而引發(fā)的一系列異質(zhì)性疾病的統(tǒng)稱。盡管近年來高通量測序技術(shù)與靶向治療取得了突破性的進展，但是臨床轉(zhuǎn)化研究的高失敗率使得抗腫瘤藥物的創(chuàng)新發(fā)展十分有限。人源腫瘤異種移植模型(patient-derived xenograft model，PDX模型)是指直接將病人的新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的環(huán)境生長的一種異種移植模型。這種模型保留了原代腫瘤的基質(zhì)異質(zhì)性、組織學(xué)特性、分子多樣性以及微環(huán)境，為臨床前藥效的個性化篩選評估以及生物標志物的鑒定提供了有效的研發(fā)資源。PDX模型結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，基因組圖譜以及藥效數(shù)據(jù)可以增加藥物特異性，應(yīng)用于腫瘤患者個體化治療，提高臨床治療成功率。本文就PDX模型研究進展進行綜述，包括其在腫瘤新療法中的應(yīng)用、挑戰(zhàn)性與局限性、以及在精準腫瘤醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景。

人源性腫瘤異種移植；PDX模型；個性化治療；精準醫(yī)學(xué)

癌癥是由于多種致癌因素激活原癌基因或(和)滅活腫瘤抑制因子，使細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化并無限增殖，且與腫瘤基因信號通路相關(guān)的一類基因組疾病的統(tǒng)稱[1]。高通量測序技術(shù)的最新進展已經(jīng)闡明了多種癌癥的突變過程并提供了一個全面的癌癥基因目錄[2-6]。此外，癌癥基因組分析也表明癌癥通常是一種高度異質(zhì)性的疾病，即使是基因突變水平以及腫瘤組織病理結(jié)果一致的同種類型的癌癥也存在異質(zhì)性。這種普遍存在的異質(zhì)性可以在某種程度上解釋為什么同一種癌癥類型的患者對某種特定的治療表現(xiàn)出不同的療效。隨著基因組測序技術(shù)以及生物信息與大數(shù)據(jù)科學(xué)的交叉應(yīng)用，新型醫(yī)學(xué)概念與醫(yī)療模式逐漸發(fā)展。美國醫(yī)學(xué)界在2011年首次提出精準醫(yī)學(xué)的概念，2015年美國總統(tǒng)奧巴馬又在國情咨文中提出“精準醫(yī)學(xué)計劃”，希望精準醫(yī)學(xué)可以引領(lǐng)一個醫(yī)學(xué)新時代。精準醫(yī)學(xué)的本質(zhì)是通過精確基因組分析，將患者分為小亞群，通過個體或亞群的精確分類來實現(xiàn)個體化精準治療。

大量的基因組分析已經(jīng)鑒定出了多種腫瘤相關(guān)基因，同時也發(fā)現(xiàn)了許多潛在的靶向治療位點，目前有很多臨床藥物就是根據(jù)這些潛在的靶向位點而設(shè)計的，其中包括伊馬替尼(imatinib)，該藥物通過靶向BCR-ABL1融合蛋白治療慢性粒細胞白血病[7]；曲妥珠單抗(transtuzumab)是通過靶向HER2治療乳腺癌與胃癌[8]；吉非替尼(gifitinib)和厄洛替尼(erlotinib)是通過靶向EGFR突變治療肺癌[9]；克唑替尼(crizotinib)則是通過靶向EML4-ALK融合蛋白治療肺癌[10]。除了將這些藥物轉(zhuǎn)化到臨床，靶向治療的快速發(fā)展也促進了人們對根據(jù)個體化腫瘤的分子分型而制定的個體化治療方案理念的認同[11]。目前基因組分析和靶向治療的結(jié)合已經(jīng)應(yīng)用到幾乎所有類型的腫瘤治療。

抗腫瘤藥物的創(chuàng)新發(fā)展常因為臨床試驗的高失敗率而受到制約。目前抗腫瘤藥物的臨床試驗成功率低于15%，針對實體瘤的成功率則更低[12]。盡管靶向治療具有巨大的潛力，但是在實際操作過程中有相當多的腫瘤都難以被靶向藥物識別。這是因為在一個特定的腫瘤中，基因組的不穩(wěn)定性導(dǎo)致了多種腫瘤相關(guān)的原癌基因或抑癌基因發(fā)生改變進而增加了腫瘤細胞表型的復(fù)雜性。此外，腫瘤本身就是一個異質(zhì)細胞的集合體，其中包括腫瘤細胞，成纖維細胞，血管內(nèi)皮細胞以及免疫細胞，甚至來自同一患者的腫瘤細胞在基因組和轉(zhuǎn)錄組中均可表現(xiàn)出多樣化的特征，這些都可以體現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性。因此，在多數(shù)情況下，藥物療效預(yù)測并不能通過簡單的基因組分析來進行全面的預(yù)期評估。

為了克服這些局限性，針對腫瘤的基因組改變，醫(yī)學(xué)研究者們迫切需求更加精準更加全面的分析以及藥物療效預(yù)測評估的方法。人源腫瘤移植模型(patient derived xenograft model，PDX模型)是指將病人的新鮮腫瘤組織移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的環(huán)境生長的一種異種移植模型。這種模型為臨床前藥效篩選及評估提供了有效的研發(fā)資源。本文就PDX模型研究進展以及在精準腫瘤醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用進行綜述。

1 人源腫瘤移植模型(PDX模型)

傳統(tǒng)的的體內(nèi)藥敏測試方法是將鼠源或人源細胞在體外篩選，經(jīng)過傳代培養(yǎng)，建立穩(wěn)定細胞株，然后移植到小鼠體內(nèi)建立腫瘤模型，這種模型的建立在腫瘤研究中的應(yīng)用已有半個世紀[13]，但是這種模型存在一定的缺陷，因為連續(xù)傳代的腫瘤細胞株適應(yīng)了外界培養(yǎng)皿的環(huán)境，丟失了腫瘤異質(zhì)性，因此不能客觀反應(yīng)原代腫瘤的情況。PDX模型是一種直接將病人的新鮮腫瘤細胞或組織通過原位或者是異位(多為皮下或腎包膜)等方式移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的環(huán)境生長的一種動物模型。其最重要的優(yōu)勢就是可以高度保留患者腫瘤的組織學(xué)特性，遺傳學(xué)特征以及腫瘤特異性，同時也包含了原代腫瘤的微環(huán)境，包括細胞外基質(zhì)，免疫細胞以及腫瘤微環(huán)境因子[14]。PDX模型是目前為止最接近臨床研究的相關(guān)腫瘤模型，這種模擬人腫瘤特異性的模型對腫瘤臨床前期評估、治療和預(yù)后具有重要的轉(zhuǎn)化意義，有望為腫瘤患者個體化治療帶來新突破。

PDX模型的建立方法是將新鮮外科手術(shù)腫瘤組織或活檢組織通過皮下[15]或原位種植到免疫缺陷小鼠身上，也有將腫瘤種植到血供更為豐富的腎包膜下[16]。接種到小鼠身上的腫瘤需要被剪切成2～4 mm大的碎片然后重新種植到新的小鼠身上進行傳代。用于建立PDX模型的小鼠根據(jù)免疫缺陷程度可以分為BALB/c Nude，SCID，NOD SCID，NSG 小鼠以及NOG小鼠。其中NSG小鼠(NOG小鼠)不但缺乏T細胞、B細胞和NK細胞，而且細胞因子信號傳遞能力缺失，對人源細胞和組織幾乎沒有排斥反應(yīng)，是目前國際公認的免疫缺陷程度最高、最適合人源細胞或組織移植的工具小鼠。

一般來說，PDX移植瘤的成瘤時間在2～4個月[15]，在藥物敏感性測試實驗中，移植瘤小鼠應(yīng)在早期世代進行傳代擴增。PDX建模的成功率(以獲得可以傳代的PDX腫瘤為標準)在23%～75%之間[17]，與腫瘤類型密切相關(guān)(表1)。據(jù)報道，結(jié)直腸癌(64～89%)與胰腺癌(62%)具有較高的移植率，但是乳腺癌(13%～27%)的成功率則較低[18,19]。此外，腫瘤標本的惡性程度以及分化程度對移植的成功率影響也較大，惡性程度高、分化程度低的腫瘤移植成功率較高[20]。移植位點也是影響移植瘤生長的一個重要影響因素。皮下移植因其操作簡單、容易觀察、方便定期測量和適合傳代等優(yōu)點被廣泛使用，但成功率相對較低，約為40%～60%[21]。在皮下異種移植模型中，其腫瘤一般局限于皮下成團生長，很少出現(xiàn)轉(zhuǎn)移擴散和轉(zhuǎn)移瘤。腎包膜下移植因其血供比較豐富，成功率能達到95%以上[22]。但是腎包膜下移植也有它的局限性，包括腎包膜脆弱操作困難、對受體小鼠的損傷較大、且易導(dǎo)致感染等。與其他兩種移植位點相比，原位移植更加貼近腫瘤微環(huán)境，尤其是在研究癌癥轉(zhuǎn)移方面，原位移植模型最為理想[25]。但是由于原位移植對移植者的技術(shù)要求較高，建模比較困難，也阻止了其廣泛應(yīng)用。此外，移植成功率還被報道與激素補充劑有關(guān)，在乳腺癌中，給雌鼠補充雌二醇顆?？梢詫⒊晒β蕪?.6%提高到21.4%[26]，而在前列腺癌中，給NOD SCID雄鼠補充睪丸素可將成功率提高至38.9%[23]。因此，腫瘤類型、腫瘤惡性程度、移植方式以及激素補充劑等是影響腫瘤異種移植成功率的重要因素。

表1 PDX模型成瘤率總結(jié)

大量的研究表明，PDX模型高度保真并保留了原代腫瘤的組織病理學(xué)、遺傳學(xué)特征以及腫瘤異質(zhì)性[27]。此外，全面的基因表達譜數(shù)據(jù)分析表明PDX腫瘤在很大程度上保留了原代腫瘤中大多數(shù)的關(guān)鍵基因與信號通路活性[28,29]。在乳腺癌PDX模型中也會在臨床相關(guān)位點發(fā)生自發(fā)性轉(zhuǎn)移，包括胸腺、肺、骨及腹膜[30]。在一些傳代實驗中，反復(fù)種植同一個腫瘤可以相對高度地保留基因組偏差，這在結(jié)直腸癌、乳腺癌以及胰腺癌中均有報道[28, 31,32]。但是也有些報道發(fā)現(xiàn)了PDX特有的核苷酸突變，這有可能是由腫瘤對新環(huán)境的適應(yīng)性或在原代腫瘤中低于可檢測極限的亞克隆過度生長所導(dǎo)致的[33,34]。

2 PDX模型應(yīng)用

PDX模型已被證實是一個很有意義的在多種腫瘤類型臨床前藥物測試的研究工具。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌、胰腺癌患者與相應(yīng)的PDX模型對西妥昔單抗和吉西他濱均表現(xiàn)出相同的反應(yīng)性[31, 36, 44]。貝伐單抗在膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)患者與PDX模型中均沒有改善生存期，且使腫瘤變得更具侵略性和侵襲性[49]。白蛋白結(jié)合型紫杉醇和吉西他濱的聯(lián)合療法通過PDX實驗證實對胰腺癌具有效果[51]，該療法隨后被報道在一個隨機III期臨床研究中成功地為晚期胰腺癌患者提供了生存獲益[52]。PDX模型在臨床前的靶向藥物研究中具有獨特的優(yōu)勢，這是因為在評估了PDX模型的基因組特性之后，一個具有相同基因組特征的PDX模型子集可以被用來評估靶向治療的效果。例如，pan-RAF和SRC家族激酶雙重抑制劑的作用就是先前已知的BRAF抑制劑敏感和耐受的黑素瘤PDX模型中評估的[53]。此外，靶向藥物和細胞毒性藥物組合治療，也可以在之前特定的PDX模型中得到測試，如Park團隊[54]最近利用胃癌PDX模型驗證了BCL2L1抑制劑和伊立替康聯(lián)合治療的功效。

將PDX模型更加系統(tǒng)地應(yīng)用到腫瘤藥物研發(fā)資源開發(fā)上面，需要建立生物庫或PDX腫瘤生物樣本庫，尤其是基因組高度特異性的PDX庫是發(fā)展高級診斷和癌癥治療的寶貴資源[55]。最近國際上已經(jīng)有一些研究團隊建立了PDX資源庫，并且現(xiàn)在已經(jīng)開始嘗試建立合作網(wǎng)絡(luò)化PDX生物銀行。比如，EurO PDX就是由16個歐洲機構(gòu)聯(lián)合組成的PDX模型庫，旨在發(fā)展建立臨床相關(guān)和標注的PDX網(wǎng)絡(luò)庫，據(jù)稱已經(jīng)擁有1500個PDX模型[35]；美國國家癌癥研究所(NCI)的初期目標是建立1000個PDX模型，目前數(shù)量已經(jīng)完成約三分之一；美國的杰克遜實驗室已經(jīng)擁有超過450個PDX模型；以諾華公司為代表的制藥公司于2015年發(fā)布的藥物篩選工具便使用了1000多個PDX模型。這些模型將幫助醫(yī)學(xué)研究者們更好的研究癌癥的遺傳復(fù)雜性。

隨著基因組高度明確的PDX模型收集以及藥物敏感性和耐藥性相關(guān)的生物標志物逐漸被識別，癌癥的精準醫(yī)療將變成可能?？茖W(xué)家們已經(jīng)利用PDX模型重現(xiàn)了多種已知的癌癥敏感性生物標志物，如野生型KRAS的結(jié)直腸癌對西妥昔單抗敏感[31, 36]和野生型KRAS的肺癌對厄洛替尼敏感[56]。通過分別對藥物敏感和藥物耐受的大腸癌PDX模型進行比較，HER2的擴增被確定為西妥昔單抗治療的耐藥標志物[36]。同時，通過對PDX模型反復(fù)給予某種特定藥物可以建立新型耐藥腫瘤模型。與體外腫瘤細胞培養(yǎng)系統(tǒng)相比，這些耐藥腫瘤更具有臨床相關(guān)性，可以用于耐藥機制的研究和耐藥標志物的鑒定。例如，對BRAF陽性的黑色素瘤PDX模型使用BRAF抑制劑vemurafenib的連續(xù)給藥，可以誘導(dǎo)伴有BRAF突變并且對vemurafenib耐受的黑色素瘤模型的產(chǎn)生，BRAF突變蛋白水平升高已經(jīng)被報道為連續(xù)vemurafenib藥物治療中的判斷耐藥性的一個關(guān)鍵因素[57]。

PDX模型的預(yù)測能力已被應(yīng)用到新型抗癌藥物開發(fā)的聯(lián)合臨床試驗中。一般來講，Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗至少需要5年才可以完成，在這些試驗中，實時分析、數(shù)據(jù)整合、及對藥物呈現(xiàn)不同反應(yīng)的人群進行分層十分有限。為了克服這一障礙，小鼠腫瘤模型的藥物治療實驗與臨床試驗共同進行的聯(lián)合臨床試驗可以被實施，這樣臨床前數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)可以同時得到整合[58]。聯(lián)合臨床試驗的概念最初是為轉(zhuǎn)基因小鼠模型提出的，現(xiàn)在這一觀念也可以應(yīng)用于基因組明確的PDX模型[35]。使用PDX模型的聯(lián)合臨床試驗方法將有利于將患者快速分層、藥物組合優(yōu)化、耐藥機制的研究及生物標志物的鑒定[58]。

PDX模型還可以作為“替身”模型用于個體化抗癌藥物篩選。“替身”模型是將小鼠作為特定的人類患者的替代品來測試與篩選抗癌藥物。在一項前瞻性研究中，14名患者的替身小鼠模型被用來研究篩選含63種藥物的232個治療方案中的有效的治療方案，然后將針對移植瘤模型的最有效的治療方案中的17個方案對11名患者進行了治療，其中的15個治療方案對患者成功地起到了持久性的部分緩解療效[18]。在另一項研究中，PDX臨床試驗(PCT)被證實可通過靶向藥物在PDX模型上的反應(yīng)評估靶向藥物對患者的反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)67%的BRAF突變黑色素瘤PDX模型對encorafenib敏感，這與II期臨床試驗中選擇性的BRAF抑制劑對患者的反應(yīng)率是一致的；而對encorafenib不敏感的BRAF突變黑色素瘤PDX模型對BRAF抑制劑與MEK抑制劑聯(lián)合治療顯示反應(yīng)，這也與I/II期臨床試驗中聯(lián)合治療BRAF突變的黑色素瘤患者的結(jié)果相符[59]。因此，臨床醫(yī)生可以根據(jù)個體化的PDX模型對藥物的反應(yīng)，指導(dǎo)并確定最佳治療方案，并根據(jù)療效反應(yīng)及時對治療方案進行優(yōu)化。

PDX模型也可以用于研究腫瘤免疫治療的效果。例如，同時移植了患者來源的胃癌組織以及外周血單核細胞的小鼠對anti-hcd137和anti-hpd1抗體的聯(lián)合療法表現(xiàn)出腫瘤生長抑制[60]。然而，目前構(gòu)建PDX模型使用的小鼠皆為免疫缺陷小鼠，仍不能完全模擬人類體內(nèi)腫瘤及免疫環(huán)境，因此具有患者來源的腫瘤及包含所有人類免疫細胞的人源化的PDX模型則是適合研究腫瘤免疫最佳的臨床前模型。

3 PDX模型研究面臨的挑戰(zhàn)

雖然PDX模型保留了原代腫瘤的組織病理學(xué)、基因組結(jié)構(gòu)以及藥敏反應(yīng)，但在腫瘤移植到免疫缺陷小鼠身上的同時，PDX腫瘤的克隆型分布與患者原始腫瘤相比依然不同。在PDX腫瘤中的連續(xù)傳代過程中，全基因組等位基因變異頻率表明克隆選擇在初期的移植步驟中比在傳代擴增步驟中發(fā)生的更加頻繁，而具體的克隆選擇在同一類型腫瘤不同腫瘤樣本中表現(xiàn)不同[61]。PDX模型的克隆動力學(xué)可能是由預(yù)先存在的克隆而非新生成的克隆選擇行為而產(chǎn)生的[62]。作為克隆選擇的結(jié)果，PDX腫瘤中更具侵略性的腫瘤克隆很可能成為主導(dǎo)，并且在某些情況下，根據(jù)基因組和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明PDX模型的確顯示了更具轉(zhuǎn)移性和復(fù)發(fā)性的跡象[63]。這些更具侵略性的克隆就很可能成為腫瘤治療極為重要的目標。

在使用PDX模型進行臨床前藥物篩選過程中，植入失敗以及PDX建立花費的時間(約4～8個月)也是腫瘤治療所面臨的限制因素。此外，人體基質(zhì)和免疫細胞在移植腫瘤傳代過程中的損耗對后期世代腫瘤微環(huán)境和轉(zhuǎn)移的研究是PDX模型的一個主要限制。腫瘤相關(guān)細胞，如血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、炎癥細胞及腫瘤細胞之間的的相互作用在腫瘤生物學(xué)中起到一個重要的作用。近期研究表明，腫瘤微環(huán)境也與藥物反應(yīng)有關(guān)[64]。此外，免疫調(diào)節(jié)劑如anti-PD1抗體應(yīng)用到PDX模型具有局限性，因為用于建立PDX模型的免疫缺陷小鼠缺乏免疫系統(tǒng)的重要組成部分[35]。將免疫功能低下小鼠體內(nèi)移植人類造血干細胞和祖細胞，即建立人源化的小鼠，則有望克服這一障礙。一些研究表明，通過輸入人類造血干細胞可以在移植瘤中分化出不同譜系的人源功能性免疫細胞，包括人類的免疫細胞和間質(zhì)細胞[65,66]。

PDX模型的另一個主要問題是小鼠體內(nèi)的人源腫瘤淋巴瘤，這種現(xiàn)象已在多種組織來源的PDX模型中被報道，其中包括非小細胞肺癌、肝癌、前列腺癌和胃癌[67-70]。這些淋巴瘤大多數(shù)是表達CD45標記的人源淋巴瘤，與B細胞淋巴瘤相一致[67，70]?；颊吣[瘤組織的炎癥增加了罹患人源性淋巴瘤PDX模型的風險，與結(jié)直腸癌相比，胃癌PDX模型具有更高比例的淋巴瘤，部分可能是由于基線炎癥率較高導(dǎo)致的[70]。關(guān)于淋巴瘤的形成機理有一種說法是，免疫缺陷小鼠體內(nèi)缺乏免疫監(jiān)視，EBV感染使B淋巴細胞轉(zhuǎn)換成增殖狀態(tài)，導(dǎo)致B細胞淋巴瘤的產(chǎn)生[70]。因此，在PDX模型構(gòu)建過程中需要運用組織病理學(xué)及CD34等標記物排除淋巴瘤的形成[70]。

4 結(jié)論

癌癥治療的精準醫(yī)學(xué)需要來自基因組分析和藥物反應(yīng)的大數(shù)據(jù)整合，高通量測序技術(shù)的最新進展使患者個人的癌癥基因組分析變成可能。PDX模型保留了原代腫瘤的組織病理、基因組特性、及藥物敏感性，并且可以作為患者“替身”來研究藥物反應(yīng)。這些PDX模型為多樣化的藥物開發(fā)、生物標記物的發(fā)現(xiàn)、臨床前的藥物測試、聯(lián)合臨床實驗以及個體化藥物篩選提供了一個較為理想的平臺，此外，結(jié)合基因組序列及PDX模型藥物篩選，可以指導(dǎo)臨床用藥及提高療效，為精準癌癥醫(yī)學(xué)提供新的機會。最后，結(jié)合測序數(shù)據(jù)以及替身實驗的定向突變PDX模型將會給優(yōu)化治療，提高臨床療效，以及精準癌癥醫(yī)學(xué)提供新的機會。

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Research progress of patient-derived xenografts in precision cancer medicine

LI Ke-juan, HUANG Hao, GAO Ran*

(Institute of laboratory animal sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100021, China)

Cancer is a group of heterogeneous disease caused by diverse genomic alterations in oncogenes and tumor suppressor genes. Despite recent advances in high-throughput sequencing technologies and development of targeted therapies, novel cancer drug development is limited due to the high attrition rate from clinical studies. Patient-derived xenografts (PDX) models are generated by implanting sectioned patient tumor fragments into immunodeficient mice. PDX models retain many of the key characteristics of patients’ tumors including histology, genomic signature, cellular heterogeneity, and drug responsiveness. These models cannot only serve as a platform for co-clinical trials by enabling the integration of clinical data, genomic profiles, and drug responsiveness data to determine precisely targeted therapies, but also be applied to the development of biomarkers for drug responsiveness and personalized drug selection. This review summarizes our current knowledge of this field, including methodologic aspects, applications in drug development, challenges and limitations, and utilization for precision cancer medicine.

Patient-derived xenografts; PDX models; Individual treatment; Precision medicine

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項目(2015000020124G073)。

李克娟(1987-)，女，博士，研究方向：腫瘤模型建立。E-mail：likejuan@cnilas.org

高苒(1980-)，女，副研究員，研究方向：腫瘤模型建立。E-mail：gaoran26@hotmail.com

研究進展

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0091-08

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.018

2016-06-29