羅銀珠，張 鈺，潘金春，王 靜，袁 文，何麗芳，吳瑞可, 黃碧洪，郭鵬舉，黃 韌*

(1. 廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所，廣州 510663；2. 廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

廣東小鼠腺病毒血清學(xué)調(diào)查及病毒和抗體在人工感染小鼠體內(nèi)消長規(guī)律研究

羅銀珠1,2，張 鈺1,2，潘金春1,2，王 靜1,2，袁 文1,2，何麗芳1,2，吳瑞可1,2, 黃碧洪1,2，郭鵬舉1,2，黃 韌1,2*

(1. 廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所，廣州 510663；2. 廣東省實(shí)驗(yàn)動物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510663)

目的 了解我省小鼠腺病毒(Mad)自然感染情況及探究人工感染Mad小鼠體內(nèi)各臟器組織中病毒分布規(guī)律及血清抗體變化。方法 采用ELISA方法對2007年和2015年飼養(yǎng)于普通環(huán)境小鼠血清及2013年～2015年廣東省12家監(jiān)督單位和32家委托單位SPF級小鼠血清進(jìn)行病毒抗體檢測。利用腹腔注射方法感染36只3周齡BALB/c小鼠，0.2 mL/只，濃度為4.5×106copies/μL，每天觀察動物臨床表現(xiàn)，并于攻毒前第0天和攻毒后第3、7、10、15、18、21、30、37、44、51、60天剖檢小鼠(各3只)，取組織標(biāo)本(心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、盲腸內(nèi)容物)及血清，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR(QPCR)方法檢測組織病毒核酸，ELISA方法檢測血清抗體水平。結(jié)果 普通飼養(yǎng)小鼠抗體陽性率為24.44%～84.15%，其中以Mad-2型K87株血清型為主。SPF級小鼠Mad血清抗體陽性率均為0%。所有攻毒小鼠均呈隱性感染，無臨床表現(xiàn)。攻毒后第3天及7天小鼠各組織病毒核酸檢測陽性率均為100%(3/3)，其中以脾臟100%陽性率維持時間最長(60 d)。除肝臟外，小鼠各組織病毒含量均在攻毒后7 d達(dá)到高峰，其中以脾臟病毒含量最高(5.5×105copies/μL)，其次是心臟(3.4×105copies/μL)、盲腸內(nèi)容物(2.6×105copies/μL)和胃(2.6×105copies/μL)，腦為0.8×105copies/μL。攻毒后15 d可測出血清抗體，在37 d達(dá)到峰值，此后至60 d一直維持高水平。結(jié)論 SPF級小鼠Mad感染率低，普通環(huán)境飼養(yǎng)小鼠 Mad感染率高。人工感染小鼠脾臟病毒含量最高，陽性率維持時間最長，說明病毒可以在脾臟內(nèi)長期復(fù)制，感染后第7天為組織病毒核酸最佳檢測時間點(diǎn)。血清抗體在感染后15～60 d內(nèi)均可以作為監(jiān)測指標(biāo)。

小鼠腺病毒；血清學(xué)；調(diào)查；人工感染；體內(nèi)分布

小鼠腺病毒(mouse adenovirus，Mad)屬于腺病毒科，哺乳動物腺病毒屬，核酸線性雙股DNA[1,2]。目前已報(bào)道有Mad-1型FL株(1960年Hartley等[3]分離)、Mad-2型K87株(1966年Kazuo Hashimaoto等[4,5]分離)和Mad-3型(2009年Boris Klempa等[6]分離)三個血清型。小鼠是Mad的自然宿主，Becker 等[9]2007年在英國地區(qū)捕獲的野鼠血清流行病調(diào)查中檢測出有較高M(jìn)ad陽性率(68%)，但在實(shí)驗(yàn)鼠自然感染率不高[1,7,8]，隱性感染居多，被感染的小鼠可長期帶毒和排毒并可增加感染其他病原微生物可能性，從而影響小鼠健康，干擾實(shí)驗(yàn)研究。國家實(shí)驗(yàn)動物微生物監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)(GB14922.2-2011)將Mad列入需要排除的檢測項(xiàng)目。為了解我省SPF級與普通級小鼠中Mad流行情況、病毒和抗體在人工感染小鼠體內(nèi)消長規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)對我省2013～2015年SPF級小鼠及2007年和2015年廣州地區(qū)普通環(huán)境飼養(yǎng)小鼠進(jìn)行Mad抗體檢測，并利用Mad-1型FL株低濃度感染低日齡小鼠來模擬自然感染，觀察感染鼠臨床癥狀及抗原抗體消長情況，旨在為我省實(shí)驗(yàn)小鼠質(zhì)量控制工作及Mad科學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)室參考。

1 材料和方法

1.1 小鼠血清、病毒和細(xì)胞株

2007年和2015年廣州地區(qū)普通環(huán)境飼養(yǎng)小鼠血清及2013年～2015年廣東省12家監(jiān)督單位和32家委托單位提供的SPF級小鼠。

小鼠腺病毒FL株購自美國典型菌種保藏中心(ATCC VR-550)，BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級BALB/c小鼠，雄性，36只，3周齡，體重15～18 g，購自于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(粵)2013-0002]，飼養(yǎng)于廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所二級生物安全感染實(shí)驗(yàn)室內(nèi)[SYXK(粵)2012-0122]，實(shí)行光照/黑暗各12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食，動物實(shí)驗(yàn)開展經(jīng)廣東省實(shí)驗(yàn)動物監(jiān)測所動物使用和管理委員會審批(I-IACUC2015003)。實(shí)驗(yàn)前，隨機(jī)抽取部分動物血清經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測確定為Mad抗體陰性。

1.3 主要試劑和儀器

熒光定量PCR儀為ABI 7500；酶標(biāo)儀為Thermo MμLtiskan GO；DNA 抽提試劑盒購自 Omega 公司；ELISA抗體檢測試劑盒購于EXPRESS BIO公司；DMEM培養(yǎng)液購自Gibco公司；DNA聚合酶購自大連寶生物公司；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 QPCR引物合成

所用Mad引物參照參考文獻(xiàn)[10]。引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.4.2 病毒滴度測定

將小鼠腺病毒接種BHK-21細(xì)胞，吸附作用1 h后加入含2%血清的維持液，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置生物顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，70%細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)后收獲病毒液，反復(fù)凍融3次，離心取上清液作為感染病毒，并用QPCR對病毒拷貝數(shù)進(jìn)行定量。

1.4.3 人工感染試驗(yàn)

取濃度約為4.5×106copies/μL的病毒液，腹腔注射病毒液每只0.2 mL。動物接種病毒后，觀察60 d。每天觀察動物的皮毛、外觀、行為活動、飲食和精神狀態(tài)。并在感染后第3、7、10、15、18、21、30、37、44、51、60天時，隨機(jī)各取3只，麻醉后眼眶采血以制備血清置-20℃待測，隨后脫頸椎安樂死并快速采集小鼠心臟、肝、脾、肺、腎、腦、胃、盲腸內(nèi)容物置-20℃待測。

1.4.4 QPCR檢測各組織抗原

稱量適量組織，加入600 μL的PBS緩沖液于組織研磨機(jī)上研磨3～5 min，將組織勻漿。研磨后，10000 r/min離心10 min，取200 μL上清抽提核酸，具體步驟參照核酸提取試劑盒(TIANamp Genomic DNA Kit)說明書。最后應(yīng)用ABI 7500 Real-Time PCR System，Taqman RT-PCR兩步法試劑盒(Takara)即95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 30 s,進(jìn)行40個循壞，熒光信號采集設(shè)于60℃，溶解曲線設(shè)置為：95℃ 5 s,65℃ 1 min,50℃ 30 s,進(jìn)行熒光定量PCR檢測鑒定。1.4.5 血清抗體檢測(ELISA)

根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行操作：樣本稀釋及加樣，將血清樣本從1∶50稀釋，再向ELISA 微孔板各加100 μL稀釋好的樣本；37℃孵育后洗板，每孔加100 μL酶標(biāo)二抗，37℃孵育后洗板，加顯色液；反應(yīng)完畢，立即用酶標(biāo)儀讀數(shù)，測試波長為405 nm。

結(jié)果判定方法：樣本(或?qū)φ?A值=特異孔A值-非特異孔A值；陽性對照A值≥0.600，陰性對照A值≤0.250，則試驗(yàn)成立；樣本A值≥0.300判為陽性，樣本A值<0.300判為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.01進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠抗體陽性率

小鼠抗體檢測結(jié)果，廣州地區(qū)普通環(huán)境飼養(yǎng)小鼠Mad抗體檢測陽性率較高(見表2)，2015年比2007年高4倍，均以Mad-2 K87血清型流行為主。2013年～2015年廣東省SPF級小鼠Mad陽性率為0%(見表3)，說明SPF級小鼠Mad感染率低或無。

2.2 人工感染小鼠臨床表現(xiàn)、血清及體內(nèi)組織分布結(jié)果

2.2.1 臨床觀察結(jié)果

BALB/c感染Mad后直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(60 d)，除感染初期動物出現(xiàn)輕微立毛，在精神狀態(tài)、運(yùn)動及飲食方面等均無明顯異常，總體呈現(xiàn)隱性感染狀態(tài)。

表1 Mad引物序列

表2 2007和2015年廣州地區(qū)普通環(huán)境飼養(yǎng)小鼠Mad抗體陽性率(%)

表3 2013年～2015年廣東省檢測SPF級動物感染率比較

注：動物來源于廣東省12家監(jiān)督單位和32家委托單位SPF級小鼠。

Note.SPF mice from the 12 supervision companys and 32 units entrusted of Guangdong province.

2.2.2 組織病毒含量變化

感染后第3天及7天小鼠各組織病毒核酸檢測陽性率均為100%(3/3)，其中以脾臟100%陽性檢測率維持時間最長(圖1A)。感染后第7天病毒核酸在脾組織中含量最高，其次是心臟、盲腸和胃，最低是肺和肝(圖1B)。小鼠體內(nèi)各組織病毒含量均在人工感染后第7天達(dá)到高峰(肝在第3天)，隨后病毒核酸開始下降。(圖1C、 圖1D)。

2.2.3 血清抗體滴度變化

感染小鼠體內(nèi)抗體滴度隨著感染時間遷移而升高，接種后15 d可測出陽性抗體(陽性率為100%(3/3))，在37 d達(dá)到峰值，此后至60 d可一直維持高水平, 為便于計(jì)算，抗體滴度用Log2的指數(shù)表示(圖2)。

3 討論

腺病毒科已知分有5類包括哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)、魚類腺病毒屬(Ichtadenovirus)、唾液酸酶腺病毒屬(Siadenovirus)、腺嘧啶富集性腺病毒屬(Atadenovirus)等[11]。鼠腺病毒(Mad)屬于哺乳腺病毒。中國Mad在嚙齒類動物中血清流行病學(xué)情況，20世紀(jì)90年代中期1985～1987 (14個省市38個單位開放飼養(yǎng)和SPF小鼠),開放養(yǎng)小鼠陽性率為4%(24/623)，屏障小鼠陽性率為 0%(0/178)[12],21世紀(jì)初 2003～2007年(21個省/市、47個單位送檢39個品系小鼠)血清陽性率0.24%[13]；近年2012～2013(10余個省市36家實(shí)驗(yàn)動物使用機(jī)構(gòu)) Mad血清陽性率8.3%(27/325)[14]，總體呈現(xiàn)高低高曲線。從我省小鼠血清流行性調(diào)查實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出2013年～2015年間SPF級小鼠Mad感染率為0。說明Mad在實(shí)驗(yàn)用SPF鼠內(nèi)流行率低，而對比之下，廣州地區(qū)普通環(huán)境飼養(yǎng)的小鼠血清病毒抗體檢測陽性率高，2015年達(dá)到80%以上，顯示著該病毒在該鼠群中攜帶率高，并以Mad-2 K87血清型流行為主。以上結(jié)果反映了我省在實(shí)驗(yàn)鼠Mad病毒控制及質(zhì)量控制方面達(dá)到較好的水平，而開放飼養(yǎng)環(huán)境下因飼養(yǎng)過程中有與攜帶病原野鼠接觸的可能性導(dǎo)致Mad在普通級小鼠內(nèi)流行。

實(shí)驗(yàn)小鼠自然感染臨床雖然不多見，但可能會干擾實(shí)驗(yàn)研究，特別是涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟和腸胃系統(tǒng)[8,15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示通過腹腔途徑接種BALB/c小鼠后，感染小鼠無呈現(xiàn)明顯的臨床癥狀，感染后3 d Mad各組織呈現(xiàn)100%陽性檢出率并以脾臟100%陽性檢出率維持時間最長(60 d)。在血液系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)，消化系統(tǒng)等均檢測出病毒核酸，此結(jié)果與1998年報(bào)告[8]將此歸類為多系統(tǒng)性感染疾病結(jié)論一致。腦內(nèi)檢出病毒核酸，與研究[16,17]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞是其主要侵襲目標(biāo)，可破壞小鼠血腦屏障的結(jié)果相吻合。病毒載量結(jié)果顯示各組織載毒量在7 d最高，到15 d大部分組織病毒載量檢測不到或沒有，暗示該病毒致病力有限。心臟在本次實(shí)驗(yàn)中其最高組織病毒載量為3.4×105copies/μL(7 d)，位同時段組織病毒載量第二(第一為脾臟)，這與2015年關(guān)于Mad-1與心肌炎關(guān)系研究[18]，報(bào)道[19-21]Mad感染成年C57小鼠內(nèi)可引起腦脊髓炎出血性腦脊髓炎病癥，小鼠心肌炎結(jié)果形成互相佐證。小鼠脾臟引起本實(shí)驗(yàn)的關(guān)注，其病毒含量明顯高于其他組織，且在脾臟持續(xù)復(fù)制，核酸檢測陽性維持時間最長，說明脾臟是病毒長期復(fù)制的器官。

本試驗(yàn)所感染小鼠大部分組織載毒量在7 d達(dá)到高峰然后逐漸下降至檢測不到，相比之下Mad抗體水平在15 d即可以檢測到抗體(陽性率為100%，n=3)，抗體滴度在37 d達(dá)到峰值，此后至60 d一直維持高水平。提示感染早期(15 d前)以病原核酸檢測為宜， 15 d后以抗體檢測為主，并建議對小鼠群的監(jiān)測每1～2個月進(jìn)行一次，可及時了解小鼠群中Mad流行情況。在感染早期，盲腸內(nèi)容物及胃都出現(xiàn)了高載毒量，證實(shí)該病毒可通過糞便途徑傳播和排毒，糞便、墊料是Mad的重要傳播途徑之一，必須嚴(yán)格執(zhí)行動物房生物安全和衛(wèi)生管理是預(yù)防與控制Mad的傳播重要舉措。

注：(A)100%核酸陽性率在各組織的維持時間；(B)0～18 d心、盲腸內(nèi)容物、胃、腦、腎、肺、肝Mad病毒核酸含量變化圖；(C)各組織感染第7天核酸含量差異；(D)0～60 d脾臟Mad病毒核酸含量變化圖。圖1 Mad病毒在感染小鼠各組織差異(n=3)Note.(A)100% antigen positive rate and difference tissues.(B)0～18 d Mad contents of heart, cecum contents, stomach, brain, kidney, lung, and liver.(C)Contents of Mad in difference tissues(7 d).(D)Content of Mad in spleen(0～60 d).Fig.1 Mad nucleic acids in difference tissues of infected mice

注：抗體滴度是能檢出陽性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)。圖2 感染 BALB/c小鼠抗Mad血清抗體的測定(n=3)Note.Antibody titer is the biggest diluted multiples in checking out the positive sample.Fig.2 Determination of serum antibody against Mad of BALB/c mice infected

QPCR核酸檢測法近年來廣泛被用于微生物核酸檢測，該檢測方法具有快速、敏感、特異、通用、成本低及可定量等優(yōu)點(diǎn)，對腺病毒感染的早期診斷及預(yù)防具有重要意義[22]。本研究利用QPCR法,從Mad感染小鼠不同時間的組織標(biāo)本中檢測到病毒并對病毒核酸含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，可以用來判斷感染小鼠病毒的復(fù)制與所致疾病的病程的關(guān)系，為實(shí)驗(yàn)動物小鼠腺病毒的檢測、流行病學(xué)監(jiān)測、預(yù)防等提供重要的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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Serological Survey of Mad Infection Among Mice in Guangdong and Distribution and Serological Studies in Artificial Infection

LUO Yin-zhu1,2, ZHANG Yu1,2,PAN Jin-chun1,2,WANG Jing, YUAN Wen1,2,HE Li-fang1,2, WU Rui-ke1,2, HUANG Bi-hong1,2, Guo Peng-ju1,2, HUANG Ren1,2*

(1. Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510663, China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663, China)

Objective To investigate the natural infection rate of Mouse Adenovirus(Mad)in Guangdong province and to estimate the tissue distribution and serology changes of Mad in infected mice. Methods Serums of mice from general environment of Guangzhou in 2007 and 2015, and the SPF mice from12 supervision and 32 entrusted units of Guangdong province among 2013～ 2015 were detected by ELISA.Thirty-six 3 weeks old BALB/c mice were each intraperitoneally inoculated with 0.2 mL of Mad in 4.5×106copies/μL concentration. The tissue samples, including heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, stomach , cecum contents and serum were taken at 0 d before inoculation, and 3, 7, 10, 15, 18, 21, 30, 37, 44, 51, 60 d after inoculation (3 animals each time).Real-time fluorescent quantitative PCR (Q - PCR) method was used to detect the virus nucleic acid of tissue. In addition, the antibody against Mad was detected by ELISA.Results Antibody positive rate was 24.44%～84.15% and 0% among the general environment mice and the SPF mice, respectively, which is given priority to with Mad-2 K87 serotype strains. There were no clinical manifestations among all infected mice.The virus nucleic acid positive rate was 100% (3/3) in all tissue samples in 3 d and 7 d, which maintained a longest time to 60 d in spleen. Besides the liver, virus nucleic acid content were highest at 7 d in each tissue of infected mice, with spleen highest (5.5×105copies/μL), heart was second at 3.4×105copies/μL, cecum contents and stomach ranked third ( 2.6×105copies/μL), followed by brain (0.8×105copies/μL). The antibody could be successfully detected at 15 d after inoculated, hit the peak at 37 d and maintained a high level until 60 d.Conclusions Mad infection rate is low in SPF mice, high in general environment mice.Mad nucleic acid content is the highest and positive rate maintain the longest in spleen,suggesting that Mad mainly replicate in spleen. And 7 d is the best pot for nucleic acid testing.Serum neutralizing antibody can be used as a monitoring index within 15 ～ 60 d after infection.

Mouse adenovirus; Serology; Survey; Artificial infection; Distribution.

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B070706006)。

羅銀珠(1983-)，女，碩士，獸醫(yī)師，研究方向：實(shí)驗(yàn)動物病原學(xué)。E-mail: agluo122@sina.com

黃韌(1959-)，男，博士，研究員。E-mail: labking@sohu.com

研究報(bào)告

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】 A 【文章編號】1671-7856(2017) 01-0043-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.009

2016-07-08