姬 霞,傅金英,王冰玉,胡俊攀

(河南省中醫(yī)院，河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450002)

補(bǔ)腎養(yǎng)血方對(duì)卵巢早衰大鼠中抗苗勒氏管激素的影響

姬 霞,傅金英*,王冰玉,胡俊攀

(河南省中醫(yī)院，河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，鄭州 450002)

目的 建立雷公藤多苷致卵巢早衰大鼠的模型，研究補(bǔ)腎養(yǎng)血方對(duì)卵巢早衰大鼠中抗苗勒管素(anti-mullerian hormone, AMH)的影響。 方法 使用雷公藤多苷建立卵巢早衰大鼠模型，造模成功后，分別采用高，中，低劑量補(bǔ)腎養(yǎng)血方對(duì)大鼠灌胃，每日一次，共30 d。給藥完畢后于顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織形態(tài)。酶聯(lián)免疫吸附法、免疫組化染色法和定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(qRT-PCR)分別檢測(cè)大鼠血清中AMH含量以及卵巢內(nèi)AMH的蛋白和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 組織形態(tài)學(xué)顯示高中低劑量組的卵泡和黃體的生長(zhǎng)均比模型組好；酶聯(lián)免疫吸附法、免疫組化和qRT-PCR結(jié)果顯示補(bǔ)腎養(yǎng)血方呈劑量依賴(lài)性逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷導(dǎo)致大鼠血清中AMH濃度以及卵巢中AMH 表達(dá)水平的降低。 結(jié)論 補(bǔ)腎養(yǎng)血方可逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷引起卵巢中AMH水平降低，提示補(bǔ)腎養(yǎng)血方具有防止卵巢早衰的功效。

補(bǔ)腎養(yǎng)血方; 卵巢早衰; AMH

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是一種多因素導(dǎo)致的卵巢功能提前減退的癥狀，指女性在40歲以前出現(xiàn)持續(xù)閉經(jīng)，不育，伴隨雌激素降低，卵泡雌激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和黃體生成素(luteinizing hormone，LH)升高的一種疾病[1]。卵巢早衰是婦科分泌領(lǐng)域的常見(jiàn)病，常出現(xiàn)癥狀：臉色潮紅，性欲低下，午后潮熱多汗，皮膚暗黃長(zhǎng)斑等。對(duì)女性的身心產(chǎn)生嚴(yán)重影響[2]。有學(xué)者認(rèn)為腎陰不足、天葵虧耗、任沖二脈受損是卵巢早衰的主要病機(jī)[3]。通過(guò)補(bǔ)腎，陰陽(yáng)調(diào)和，能夠調(diào)節(jié)激素水平，改善卵巢早衰的臨床癥狀[4]，且基于養(yǎng)血補(bǔ)腎為基礎(chǔ)的補(bǔ)腎養(yǎng)血方對(duì)POF具有積極的治療作用[5]。近年來(lái)，現(xiàn)代中醫(yī)研究發(fā)現(xiàn)，基于當(dāng)歸、熟地黃加減的補(bǔ)腎養(yǎng)血方能夠通過(guò)上調(diào)POF大鼠卵泡及卵巢間質(zhì)Bcl2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，抑制卵泡的過(guò)快凋亡[6]，另有研究證明[7]，養(yǎng)血補(bǔ)腎方能夠促進(jìn)POF大鼠卵泡生長(zhǎng)，降低POF大鼠血清FSH、LH水平，促進(jìn)E2水平上升，改善卵巢功能。近年來(lái)，臨床上使用抗穆勒氏管(anti-mullerian hormone，AMH)做為卵巢功能的評(píng)估[8]，更有研究指出，AMH在雌性動(dòng)物體內(nèi)由卵巢細(xì)胞分泌，在一定程度上可以反映卵巢的功能狀態(tài)[9]。但，關(guān)于養(yǎng)血補(bǔ)腎方對(duì)于POF大鼠中AMH的影響報(bào)道較少，因此本實(shí)驗(yàn)采用雷公藤多苷建立大鼠卵巢早衰大鼠模型，研究補(bǔ)腎養(yǎng)血方對(duì)卵巢早衰大鼠體內(nèi)AMH的影響，為補(bǔ)腎養(yǎng)血方可防治改善卵巢早衰提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

處于動(dòng)情期的雌性SD大鼠60只，10～12周齡，SPF級(jí)，體重為230～270 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(京) 2012-0016]，所有大鼠在河南省中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成 [SYXK(豫)2012-009]，采用顆粒型普通飼料喂養(yǎng)，飲自來(lái)水，保持室溫，模擬正常晝夜生理節(jié)律光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

雷公藤多苷片，購(gòu)于安徽新隴海藥業(yè)有限公司，規(guī)格10 mg/片；補(bǔ)腎養(yǎng)血方由本院藥劑科提供，組方：淫羊藿10 g，熟地黃15 g，當(dāng)歸10 g，丹參15 g，菟絲子10 g，枸杞子10 g，山茱萸10 g，白芍8 g，杜仲8 g，川芎5 g，甘草5 g，水煎并濃縮，制成相當(dāng)于生藥材2.0 g/mL的混懸液，放于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。戊酸雌二?補(bǔ)佳樂(lè))，購(gòu)于法國(guó)Delpharm Lille S.A.S，規(guī)格1 mg/片；大鼠抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone，AMH)ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Diagnostic Systems Laboratories公司；AMH抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；AMH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組和造模

將SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，稱(chēng)重，分別設(shè)空白組，模型組，高劑量組，中劑量組，低劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組。除空白組外，其余SD大鼠以雷公藤多苷片50 mg/kg灌胃，每日一次，連續(xù)15 d。

1.3.2 動(dòng)物給藥

造模成功24 h后進(jìn)行給藥，依據(jù)人鼠的劑量換算，折算為人的等效劑量的10倍：空白組，正常飲食；模型組，以生理鹽水2 mL/kg給藥，每日灌胃1次；高劑量給藥組，以補(bǔ)腎養(yǎng)血方20 g/kg給藥，每日灌胃一次；中劑量給藥組，以補(bǔ)腎養(yǎng)血方10 g/kg給藥，每日灌胃一次；低劑量給藥組，以補(bǔ)腎養(yǎng)血方5 g/kg給藥，每日灌胃一次。陽(yáng)性對(duì)照組，以戊酸雌二醇0.12 mg/kg給藥，每日灌胃一次。各組連續(xù)給藥30 d。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清中AMH含量

將各組大鼠稱(chēng)重，尾靜脈取血3 mL，3000 r/min離心15 min，收集上清液待測(cè)。按AMH ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將樣品加入酶標(biāo)包被板中，37℃孵育30 min，洗板；加入生物素化抗體工作液，封板膜封板后37℃孵育1 h，洗板；加入HRP，37℃孵育30 min，洗板。加入顯色劑，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(10 min內(nèi))。

1.3.4 卵巢組織學(xué)觀察

各組大鼠完成給藥24 h后，處死大鼠，取雙側(cè)卵巢，一側(cè)卵巢置于-80℃中保存。另一側(cè)卵巢用10%中性甲醛固定，洗滌，依次用梯度乙醇脫水，于二甲苯中透明15 min，石蠟包埋后切片，烤干，二甲苯脫蠟后再依次用梯度乙醇脫水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，進(jìn)行HE染色。倒置顯微鏡下觀察各組大鼠的卵巢形態(tài)學(xué)。

1.3.5 免疫組化染色法檢測(cè)AMH的蛋白表達(dá)水平

將卵巢組織切片置于二甲苯(I)(II)(III)中脫蠟，依次放入無(wú)水乙醇，90%乙醇，80%乙醇，70%乙醇中，洗滌，置于3%過(guò)氧化氫溶液10 min，封閉，加入AMH抗體，4℃過(guò)夜，顯色。蘇木素復(fù)染，返藍(lán)，乙醇脫水，置于二甲苯中浸泡，加入中性樹(shù)膠，封片晾干。根據(jù)染色細(xì)胞所占面積和細(xì)胞染色強(qiáng)度兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分判斷。綜合評(píng)分=(染色細(xì)胞分?jǐn)?shù)+細(xì)胞染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù))/2；0-0.5分為(-)；0.5-1.5分為(+)；1.5-2.5分為(++)；>2.5分為(+++)。

1.3.6 卵巢AMH的mRNA表達(dá)水平

將冷凍的卵巢組織在冰浴中用電動(dòng)勻漿機(jī)充分?jǐn)嚢瑁崛「鹘M卵巢的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)，AMH引物：上游：5’-TCCTAGAGAC CCTCACTCGC -3’；下游：5’- CACGGGGTCTGAAAG GTTGA-3’；β-actin 引物：上游：5’- GTGGGGCGCCC CAGGCACCA -3’；下游：5’- CTCCTTAATGTCACG CACGATTTC-3’；擴(kuò)增條件：94℃ 30s，52℃ 1 min，72℃ 30 s，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，于73℃延伸10 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果在熒光定量操作系統(tǒng)中進(jìn)行分析對(duì)比，目標(biāo)基因的相對(duì)定量用2-△△Ct計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS16.0軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P< 0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中AMH濃度水平

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組的大鼠卵巢中AMH的水平顯著低于空白組；給予補(bǔ)腎養(yǎng)血方后，發(fā)現(xiàn)其呈劑量依賴(lài)性逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷誘導(dǎo)卵巢早衰AMH降低，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 卵巢組織學(xué)觀察

空白組卵巢體積大，可見(jiàn)不同時(shí)期發(fā)育的卵泡，包括原始卵泡、初次卵泡、次級(jí)卵泡、成熟卵泡和閉鎖卵泡，血管形態(tài)正常，可見(jiàn)大量黃體；模型組卵巢萎縮，卵泡和黃體數(shù)量少，閉鎖卵泡增多；低劑量組各級(jí)卵泡生長(zhǎng)情況略好于模型組；中劑量組各級(jí)卵泡與黃體數(shù)量比模型組明顯增多；高劑量組各級(jí)卵泡生長(zhǎng)情況與空白組相似，卵泡與黃體數(shù)量較多；陽(yáng)性對(duì)照組各級(jí)卵泡和黃體數(shù)量顯著高于空白組，卵泡細(xì)胞和黃體細(xì)胞生長(zhǎng)良好。見(jiàn)圖1。

表1 補(bǔ)腎養(yǎng)血方對(duì)卵巢早衰大鼠AMH水平的影響(±s，n=10，pmol/L)

Tab.1 The effect of bushenyangxue prescription on the levels of AMH

表1 補(bǔ)腎養(yǎng)血方對(duì)卵巢早衰大鼠AMH水平的影響(±s，n=10，pmol/L)

組別GroupAMH水平AMHlevels空白組Blankcontrolgroup247±011模型組Modelgroup034±001?低劑量組Low?dosegroup107±008#中劑量組Middle?dosegroup178±013#高劑量組High?dosegroup245±010#陽(yáng)性對(duì)照組Positivecontrolgroup412±031#

注：*P< 0.05，與空白組相比較；#P< 0.05，與模型組相比較。

Note.*P< 0.05 vs. blank control group.#P< 0.05 vs. model group.

2.3 免疫組化染色法檢測(cè)AMH的蛋白表達(dá)水平

AMH在卵巢中的主要表達(dá)竇前卵泡和小竇狀卵泡的顆粒細(xì)胞，成熟卵泡和細(xì)胞間質(zhì)表達(dá)也有表達(dá)。模型組中AMH的表達(dá)明顯低于空白組；低劑量補(bǔ)腎養(yǎng)血方可逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷造成AMH表達(dá)的減少，并隨著劑量增大而逆轉(zhuǎn)效果更為顯著；陽(yáng)性對(duì)照組中AMH的表達(dá)水平顯著高于空白組。見(jiàn)圖2，表2。

2.4 qRT-PCR檢測(cè)卵巢中AMH的mRNA表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，給予雷公藤多苷后大鼠卵巢中AMH的mRNA表達(dá)水平顯著降低；而補(bǔ)腎養(yǎng)血方可明顯逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷導(dǎo)致AMH mRNA表達(dá)的減少，并隨給藥劑量增大而逆轉(zhuǎn)作用增強(qiáng)。見(jiàn)圖3。

3 討論

卵巢早衰在中醫(yī)可以歸屬為“血枯”、“血隔”、“月經(jīng)后期”、“不孕”等范疇[10]。雖然，各醫(yī)家對(duì)本病的病因認(rèn)識(shí)有所區(qū)別，但總體認(rèn)為本病的根本在于“天癸早枯”，腎中精氣虧虛為主導(dǎo)。中醫(yī)認(rèn)為腎藏先天之精，主生殖，精血同源，相互助生，相互轉(zhuǎn)化。因此腎氣不足會(huì)導(dǎo)致精血虧虛，從而影響女子的生育功能。補(bǔ)腎養(yǎng)血方以補(bǔ)腎為主的淫羊藿，菟絲子，杜仲，山茱萸和補(bǔ)氣養(yǎng)血的熟地黃，當(dāng)歸，黨參，枸杞子，白芍，川芎組成，附以甘草調(diào)和諸藥。

注：(A)空白組；(B)模型組；(C)低劑量組；(D)中劑量組；(E)高劑量組；(F)陽(yáng)性對(duì)照組。圖1 各組卵巢卵泡組織形態(tài)Note.(A)blank control group.(B)model group.(C)low-dose group.(D)middle-dose group.(E)high-dose group.(F)positive control group.Fig.1 Representative images of ovarian tissue follicle morphology.

注：(A)空白組；(B)模型組；(C)低劑量組；(D)中劑量組；(E)高劑量組；(F)陽(yáng)性對(duì)照組。圖2 各組大鼠卵巢組織中AMH的表達(dá)Note.(A)blank control group.(B)model group.(C)low-dose group.(D)middle-dose group.(E)high-dose group.(F)positive control group.Fig.2 Immunohistochemical results showing the expression of AMH.

組別Group--++++++++++++空白組Blankcontrolgroup0253模型組Modelgroup 8?200低劑量組Low?dosegroup3#520中劑量組Middle?dosegroup0#550高劑量組High?dosegroup0#361陽(yáng)性對(duì)照組Positivecontrolgroup0#145

注：*P< 0.05，與空白組相比較；#P< 0.05，與模型組相比較。

Note.*P< 0.05 vs. blank control group.#P< 0.05 vs. model group.

注：*P < 0.05，與空白組相比較；#P < 0.05，與模型組相比較。圖3 各組大鼠卵巢中AMH的mRNA表達(dá)水平(±s,n=10)Note. *P < 0.05 vs. blank control group. #P < 0.05 vs. model group. Fig.3 Expression of AMH mRNA in different dosage group

補(bǔ)腎養(yǎng)血方具有滋補(bǔ)肝腎，補(bǔ)氣活血斂陰，補(bǔ)而不滯，滋而不膩的特點(diǎn)，使得腎氣盛而天癸至，對(duì)女子卵巢早衰之經(jīng)閉具有治療功效，調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌功能失調(diào)。

卵巢功能的評(píng)估指標(biāo)主要包含：年齡、濾泡刺激激素(FSH)、黃體生成素(LH)、抑制素B(Inhibin B)、卵巢大小(Ovarian volume)、竇卵泡數(shù)目(Antral follicle count)和雌激素(oestrogen-2，E2)等，但憑單一指標(biāo)卻無(wú)法真實(shí)反應(yīng)卵巢狀況。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，卵巢功能開(kāi)始衰退前期，在 FSH、E2、inhibin B 尚未產(chǎn)生變化，AMH即可明確反應(yīng)出衰退的征兆[11]。血清抗苗勒管素(AMH)是一種以二硫鍵連接的二聚體糖蛋白，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)家族的成員之一，雌性體內(nèi)由卵巢顆粒細(xì)胞分泌[12]。AMH抑制卵泡的生長(zhǎng)過(guò)快，防止卵泡過(guò)早消耗。血清中AMH水平可以反映早期卵泡數(shù)量，預(yù)示著女性的生殖能力，因此，可以利用AMH水平來(lái)反映女性卵巢衰老的變化[11]。衰老是生命活動(dòng)的普遍現(xiàn)象，其機(jī)制至今仍不完全清楚。而卵巢衰老主要表現(xiàn)為卵泡數(shù)量及卵泡質(zhì)量的下降，卵巢生殖和內(nèi)分泌功能減退，從而繼發(fā)全身各器官功能改變[12]。本實(shí)驗(yàn)采用雷公藤多苷對(duì)大鼠灌胃，通過(guò)顯微觀察大鼠卵巢形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷可導(dǎo)致卵巢早衰的特征出現(xiàn)，如卵泡和黃體數(shù)量少，閉鎖卵泡增多等；給予不同劑量的補(bǔ)腎養(yǎng)血方后，均在一定程度上逆轉(zhuǎn)大鼠卵巢早衰的癥狀，卵泡和黃體數(shù)量明顯增加；高劑量組的逆轉(zhuǎn)作用更為顯著，表明補(bǔ)腎養(yǎng)血方具有抑制卵巢早衰的功效。另一方面，雷公藤多苷給藥后，大鼠血清中AMH水平顯著降低，提示卵巢功能下降，衰竭；而給予補(bǔ)腎養(yǎng)血方的大鼠，其血清中AMH水平呈劑量依賴(lài)性上升，其中高劑量組血清中AMH水平接近空白組，提示補(bǔ)腎養(yǎng)血方可增加卵巢中AMH水平。免疫組化染色和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，雷公藤多苷可導(dǎo)致卵巢中AMH蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著下降，補(bǔ)腎養(yǎng)血方呈劑量依賴(lài)性逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷導(dǎo)致AMH蛋白和mRNA表達(dá)水平下降。綜上所述，補(bǔ)腎養(yǎng)血方能有效逆轉(zhuǎn)雷公藤多苷導(dǎo)致大鼠卵巢早衰中AMH水平下降。

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Effect of bushenyangxue prescription on the levels of anti-mullerian hormone in rat with premature ovarian failure

JI Xia, FU Jin-ying*, WANG Bing-yu, HU Jun-pan

(Department of Obstetrics and Gynecology, Henan Province Hospital of TCM, the Second Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, China)

Objective Establish premature ovarian failure (POF) model in female Sprague Dawley by tripterygium wilfordii, and investigate the effect of bushenyangxue prescription on the levels of anti-mullerian hormone (AMH). Methods After POF model was established, rats were gave by gavage of different dosage of Bushenyangxue prescription for 30 days. The changes of histomorphology on rat ovarian tissue were observed by hematoxylin-eosin staining. Serum AMH concentraction, protein and mRNA expression of AMH were measure with ELISA, immunohistochemical staining and qRT-PCR, respectively. Results The follicle and corpus luteum were atrophied after tripterygium wilfordii challenge, which was improved after treatment with Bushenyangxue prescription. Serum AMH, protein and mRNA expression of AMH were decreased tripterygium wilfordii-treated rats; this decrease was inhibited after treatment with Bushenyangxue prescription. Conclusions Our study indicates that Bushenyangxue prescription could preserve the AMH levels of POF rats. These findings suggest that Bushenyangxue prescription may be a useful strategy to treat POF.

Bushenyangxue prescription; Premature ovarian failure (POF); AMH

河南省中醫(yī)藥管理局科研課題(2014ZY02013)。

姬霞(1968-)，女，副主任醫(yī)師, 本科, 研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療婦產(chǎn)科疾病的基礎(chǔ)與臨床研究。

E-mail: jx.1120@163.com

傅金英(1968-)，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，研究方向：婦科生殖內(nèi)分泌。E-mail: fujinying2003@163.com

研究報(bào)告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0049-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.010

2016-04-02