王燕萍，彭丹虹，劉曉琪，謝 蓉，李先濤

(廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣東 510006)

高脂飲食喂養(yǎng)建立高脂血癥模型的驗證及規(guī)律探討

王燕萍，彭丹虹，劉曉琪，謝 蓉，李先濤*

(廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣東 510006)

目的 高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠8周建立高脂血癥，驗證該造模方法的可行性，并探究大鼠在不同時點的血脂變化規(guī)律。方法 正常雄性8周齡SD大鼠30只，適應性喂養(yǎng)1周后，根據體重隨機分為對照組、模型1組、模型2組，每組10只。對照組給予普通飼料，模型組2組喂養(yǎng)高脂高膽固醇飼料，喂養(yǎng)時間為8周，每日計量各組飲食、飲水，4 d更換墊料并稱重。分別在第4周、6周、8周末，動物禁食過夜并眼眶靜脈叢采血，測定各組血脂四項水平。8周末動物處死，收集各組大鼠肝臟、主動脈進行HE染色。結果 與對照組相比，模型1組的日平均飲食量有所增加，但差異無統(tǒng)計學意義；模型2組的日平均飲食量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。日飲水量與對照組相比，模型組2組飲水量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。肝臟/體重指數與對照組相比，模型組2組明顯增重，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)。終末體重與對照組相比，模型組2組的體重增加，但只有模型1組有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。血脂方面，與對照組相比，4周末、6周末模型組2組TC水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01或P< 0.05)，8周末模型1組LDL-c水平明顯升高，HDL-c水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。肝臟HE染色示對照組肝細胞排列正常，染色均勻，而模型組2組肝細胞大面積脂肪變，少數肝血竇內充血及炎癥細胞浸潤。主動脈HE染色示3組主動脈結構正常。結論 高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠建立高脂血成立，所造模型為高膽固醇血癥并伴有嚴重的脂肪肝。同時，高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)SD大鼠形成高脂血癥實驗過程中，血脂波動呈現一個升高-內適應-升高的狀態(tài)。在造模過程中，如何克服動物厭食并膽固醇代謝內調節(jié)這個問題，是高脂飼料喂養(yǎng)成模的關鍵所在。

高脂血癥；動物模型；高脂飲食

高脂血癥是臨床常見疾病，也是導致腦卒中、冠心病、心臟猝死獨立而重要的危險因素[1]。制作高脂血癥的動物模型對于研究代謝性疾病及心腦血管疾病意義重大。

高脂血癥動物模型制作有多種方法，常見的有高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)[2]、脂肪乳灌胃[3]、氫化可的松肌肉注射[4]、Triton WR-1339腹腔注射[5]、Poloxamer 407腹腔注射[6]、帕洛沙姆407腹腔注射[7]等，但后幾種升高血脂作用多為急性的、短暫性的?，F在最常用的造模方法就是高脂飼料喂養(yǎng)，模擬現代人類由于飲食失節(jié)形成的脂質代謝紊亂。但是閱讀高脂血癥造模相關文獻可以知道，關于造模周期問題并未達成共識。有文獻中提及4周成模，有的是6周，有的是8周，部分文獻中提及高脂飼料喂養(yǎng)時間為12周。本實驗采用高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)SD大鼠，試驗周期共8周，分別在第4周、第6周、第8周禁食過夜采血進行血脂四項檢測，分析各組血脂水平，旨在通過科學實驗論證并總結高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)SD大鼠形成高脂血癥的時間及變化規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠30只，8周齡，重量180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供[SCXK(粵)2013-0020]。飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心屏障環(huán)境(SPF級)中[SYXK(粵)2013-0085]。溫度:21～25℃，日溫差±1℃；濕度：50%～70%，12 h光照-陰暗交替。所有實驗操作均按照該中心的操作指南執(zhí)行，并得到動物倫理委員會的許可。

1.2 實驗飼料

普通飼料由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。高脂飼料由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。(加工配方：蔗糖20%、豬油15%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、酪蛋白10%、磷酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、預混料0.4%、基礎飼料52.2%)。

1.3 試劑

血脂四項檢測試劑盒(TC/TG/LDL-c/HDL-c)購買于南京建成試劑有限公司;試劑如水合氯醛、多聚甲醛等購買于廣州亞優(yōu)儀器有限公司；相關耗材如采血管、EP管、手套等購買于廣州杰特偉生物有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 高脂血癥大鼠造模

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后根據體重大小編號，運用隨機數字表法隨機分為3組。正常組10只，模型組20只。

造模方法：每組每5只大鼠為1籠，共6籠。正常組每籠每日給予普通飼料，模型1、2組每籠每日給予高脂飼料，各150 g,飲水500 mL。三組自由飲食、飲水，不限活動。每日稱量剩余飼料量、飲水量，計算前一日的飲食及飲水量。4 d更換一次墊料并每組稱重。造模周期為8周。

1.4.2 血脂四項檢測

動物乙醚麻醉后，眼眶后靜脈叢采血約1 mL，血樣室溫下靜置2 h,4℃、7000 rbp離心8 min。取干凈的1.5 mL EP管，用移液槍將上層血清移至EP管中。血清4℃保存。取血脂四項檢測試劑盒，按操作說明書進行加液操作。用酶標儀測定TC/TG/HDL/LDL的OR值，公式計算得到各組的血脂水平。

1.4.3 肝臟、主動脈HE染色

將各組大鼠標本放入標記好的包埋盒中，用切刀切取3～5 mm邊緣齊整的肝臟及主動脈組織，按從低濃度酒精到高濃度酒精的順序進行組織脫水。然后進行組織透明及浸蠟。用鑷子將經過浸蠟的組織塊從脫水盒中取出，進行蠟塊包埋。包埋后切取完整的5 μm左右的蠟片，置自來水中展開，然后再轉放于40℃的溫水中展平，用載玻片平整撈起，放在攤平機上攤平，放入烤箱烤片。將玻片進行脫蠟、HE染色，并進行人工封片、烤片，置于顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟及主動脈的細胞形態(tài)。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件對各組大鼠的實驗數據進行統(tǒng)計分析，結果以均數±標準差表示(±s)。多組均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法，不符合正態(tài)分布的選用非參數檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況比較

經過8周的高脂飼料喂養(yǎng)，我們得到了3組大鼠一般情況的數據，見表1。表中顯示：與對照組相比，模型2組飲食量、飲水量減少，肝臟指數增重，差異有明顯的統(tǒng)計學意義(P< 0.01)；而模型1組飲水量減少，肝臟指數、終末體重增加，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01、P< 0.05)。

同時，通過繪制3組每日飲食量、飲水量的曲線圖(本文未顯示)我們發(fā)現，3組28 d前的日飲食量穩(wěn)定，模型1組的食量大于對照組及模型2組。從第5周開始，3組的食量出現了下降的趨勢，這可能與4周末禁食采血有關，但對照組經過一段時間的調整，飲食量逐漸恢復正常并趨于穩(wěn)定；而模型1、2組卻出現了飲食量減少并持續(xù)波動的情況，這可能表明模型組大鼠出現厭食。

3組大鼠4周前飲水量相當。從4周末起，3組飲水量出現了較大的起伏，這可能與采血相關，但相對于對照組來說，模型組2組的飲水量都下降。

2.2 血脂四項水平統(tǒng)計

分別在實驗第4、6、8周末檢測3組大鼠的血脂水平并統(tǒng)計，見表2、3、4。表2可以看出：在4周末，與對照組相比，模型組2組TC升高，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.01)；TG、LDL-c的含量出現上升的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義(P> 0.05)；HDL-c出現下降的趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學意義。表明高脂血癥大鼠模型建立成功。

表3可以看出：在6周末，與對照組相比，模型組2組TC、LDL-c升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與4周末相比，模型組2組TC、TG、HDL-c水平下降，LDL-c水平上升。

表4可以看出，在8周末，與對照組相比，模型1組HDL-c水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)；LDL-c水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。同時與6周末相比，模型組TC、HDL、LDL水平升高，TG水平降低。

表1 3組大鼠飲食量、飲水量、體重、肝臟指數

注：與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表2 4周末各組大鼠血脂四項水平(mmol/L)

注：與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

對比大鼠第4周、第6周、第8周的數據可以看到：空白對照組在普通飼料喂養(yǎng)情況下，TC、LDL-c隨著喂養(yǎng)周期的延長，水平逐漸升高；3組的TG水平隨著喂養(yǎng)周期的延長逐漸降低；同時，模型組2組的TC水平在第6周時出現了下降，雖然持續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)后升高，但是并未回到4周末水平。

2.3 肝臟、主動脈HE染色

2.3.1 肝臟HE染色結果

對照組肝臟HE染色可見肝細胞結構正常，排列清楚，染色均勻，核深染，居于正中。模型組肝細胞增大，結構欠清或消失，細胞內大面積脂肪變，核居于一側，部分肝血竇充血，肝臟細胞匯管區(qū)內可見淋巴細胞浸潤，甚至肝臟細胞出現壞死。染色結果見圖1。

2.3.2 主動脈HE染色結果

3組大鼠主動脈內膜光滑，各層結構清楚，無異常。染色結果見圖2。

表3 6周末各組大鼠血脂四項水平(mmol/L)

注：與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表4 8周末各組大鼠血脂四項水平(mmol/L)

注：與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.Compared with control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 討論

本次實驗擬通過高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠造成高脂血癥，并在不同的時間點內進行血脂檢測，從而對大鼠的血脂水平進行縱向的追蹤。實驗數據表明，模型組的大鼠在4周時TC升高，與對照組相比，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P< 0.01),但6周末檢測血脂水平時發(fā)現TC值出現了回落，第8周時檢測血脂發(fā)現TC水平再次升高，但與4周末相比，水平還是降低的。這一結果表明SD大鼠在造模過程中，可能存在一個內適應的過程，能通過體內代謝調節(jié)血脂水平，使之達到一個比較平衡的狀態(tài)。模型組TG水平由4周末的0.6～0.7 mmol/L降至0.4 mmol/L左右，也證明了這一點。

據以往文獻表明，大鼠的高脂血癥與人類高脂血癥的發(fā)病機制差異較大, 如大鼠內源性膽固醇合成量與人類差異較大,大鼠體內膽固醇轉運依賴高密度脂蛋白,人類體內膽固醇轉運則依賴低密度脂蛋白,且大鼠體內膽固醇血漿清除率明顯高于人類。另外,大鼠對攝入的高膽固醇食物不敏感,而且還可以通過減少自身肝臟合成膽固醇、增加膽汁酸生成等途徑而使血漿脂蛋白保持穩(wěn)定,此外大鼠還具有對抗動脈粥樣硬化形成的能力[8-11]。這可能解釋了模型組大鼠4周后血脂降低的部分原因；其次，通過每日觀察大鼠的剩余飲食量可知，模型組2組大鼠在第5周起出現了很明顯的厭食，自由喂食導致模型組內飲食差異很明顯，組間離散度很大。

本課題組建立大鼠高脂血癥模型,原因是大鼠造模方法簡單,成本適中,采血量較大,可以滿足一次做多種指標,且模型建立的方法最多，更重要的是大鼠的食性與人類相似,所形成的病變與人類早期病理改變相似,且適應性較強 ,是目前國內研究脂質代謝最多的實驗動物[12],這些特性有助于課題組后期的藥物開發(fā)及藥理毒理實驗的進行。目前國際上在血脂代謝的研究中多采用豚鼠或金黃地鼠，但金黃地鼠血量少,尾部采血困難,性情兇猛等給實驗造成困難[13]。

本次試驗設立了兩個模型組，目的在于探究經過隨機分組的大鼠在相同高脂飼料喂養(yǎng)的基礎上，個體的差異性如何。每日飲食量、飲水量統(tǒng)計過程中發(fā)現，模型2組相對于模型1組而言，飲食量明顯的降低，第5周后，2組大鼠出現厭食，模型2組表現更為明顯，日均飲食量與對照組相比出現降低；同時，不同時期血脂四項水平檢測也提示，模型組不同組間的血脂水平及波動情況迥異。這表明根據體重進行隨機分組后的2組大鼠在相同飼養(yǎng)環(huán)境下個體差異性很大，提示在進行隨機分組時應選擇TC水平檢測作為分組根據。

根據國標《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范(2003版》中輔助降血脂功能評價，試驗項目、實驗原則及結果判定中的規(guī)定，“模型對照組和空白對照組比較，血清總膽固醇(TC)或低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)升高，血清甘油三酯(TG)差異無顯著性，判定高膽固醇血癥動物模型成立”。此次實驗得到了高脂飼料喂養(yǎng)形成高脂血癥模型建立中的幾點結論：1.高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠建立高膽固醇血癥模型是成功的。2.高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠，大鼠表現出了中度甚至重度脂肪肝，表明脂質出現了異位沉積。3.高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠，8周無法形成動脈粥樣硬化。4.高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠的造模過程中，大鼠自身存在一個內調節(jié)過程，使血脂水平出現升高-內適應-升高的過程。5.高脂飲食喂養(yǎng)SD大鼠造模過程中，模型組大鼠出現明顯的厭食情況，且模型組內個體差異巨大。

針對大鼠厭食這一問題，我們課題組通過查看文獻及組內討論分析認為，可以在厭食出現的時期內增加高脂乳灌胃這一措施，從而保證模型組的外源性脂肪及膽固醇攝入[14]。 同時，部分文獻還提到，可以采用高脂-普通飲食交替飼養(yǎng)的方法，但具體結果如何，課題組并未進行驗證。

該實驗還存在2個不足之處。第一：通過數據可以看出，對照組的血脂水平如TC、TG、LDL從4周末到8周末也呈現著上升的趨勢，且與以往其他人做的文獻相比[15-17]，血脂水平也較高。肝臟HE染色也顯示有極少數的對照組大鼠肝細胞出現脂質沉積、脂肪樣變。課題組討論認為，這可能與不限大鼠飲食、每日確保飲食供應量，大鼠籠內飼養(yǎng)，運動量少有關，其次，可能與動物本身的個體差異性有關。

第二：該實驗只進行到第8周，并未繼續(xù)造模觀察大鼠12周的血脂水平。通過文獻可以得知，部分研究者高脂飼料喂養(yǎng)老鼠12周造高脂血癥[18-20]，且數據表明造模成功。此次實驗中，8周末模型組TC、LDL水平與第6周相比，都出現了升高，與對照組相比，有升高的趨勢；HDL水平與對照組相比，也出現了降低的趨勢。數據表明，隨著高脂飼料的喂養(yǎng)，動物血脂水平可能繼續(xù)升高。所以繼續(xù)喂養(yǎng)4周，觀察血脂的動態(tài)演變過程，其實是很有必要的。

針對實驗中出現的這些不足，可采用實驗前TC檢測隨機分組的方法，盡量消除組間的個體差異。同時實驗過程中可考慮增加造模手段控制大鼠脂肪供應，防止大鼠因厭食而出現血脂降低。針對對照組血脂異常的情況，也可適度地限制大鼠的飲食來減少造模過程中的誤差與偏倚，得到可靠的高脂血癥動物模型。

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Validation Research And Regulation Exploration Of High Fat-introduced Hyperlipidemia Model In Rat

WANG Yan-ping , PENG Dan-hong , LIU Xiao-qi , XIE Rong , LI Xian-tao*

(School of Basic Medical Science of Guangzhou University of Chinese Medicine,GuangDong 510006，China)

Objective To investigate the feasibility of high fat-introduced hyperlipeidemia model in male SD rat and study the time rule of molding. Methods 30 Male adult rats of SD Strain bred in the animal house of the institute were divided into 3 groups after 1 week adaptation , group 1: control group, normal diet; group 2: model 1 group, high fat high cholesterol diet;group 3: model 2 group, high fat high cholesterol diet. The period of experiment was 8 weeks. Food and water intake were measured everyday and body weight were measured every four days. Blood were collected by orbital venous at the end of fourth,sixth,eighth week to test their serum lipid level.At the end of experiment,animals were killed to collect liver and aorta tissue for HE stain. Results Compared with control group,the food intake of model 1 was higher and model 2 was significant lower,water intake of model 2 was significant lower,the ratio of liver/weight of two model groups were significant heavier,and weight of model groups were higher.High fat diet significantly increased TC levels of model groups at the end of fourth,sixth week. The level of LDL-c in model 1 group were higher and the HDL-c were lower compared with control group.HE stain showed the livers of control group were regular,arrangements of the liver cells were trim, dyeing present uniformity. The two model groups showed a large range of hepatocyte fatty change,a few liver blood sinus were in congestion and infiltrated with inflammatory cells. Aorta HE stain showed no significant change among 3 groups. Conclusions The method of high fat-introduced hyperlipeidemia model in male SD rat is feasible and the model turned out to present hypercholesterolemia with severe fatty liver.On the other hand,levers of serum lipid increased within an increase—inter-adjustment—increase state.In the process of modeling,how to overcome the symptom of anorexia and the state of cholesterol inter-adjustment in animals is the key to successfully establish hyperlipeidemia model.

Hyperlipeidemia; Animal models; High fat diet

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(2014CB542901)。

王燕萍(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：臨床流行病學應用研究。E-mail: 993880947@qq.com

李先濤(1966-)，男，研究員，研究方向：臨床流行病學應用研究、中醫(yī)證候學。E-mail: lixiantao@gzucm.edu.cn

研究報告

R-332

A

1671-7856(2017) 01-0005-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.01.002

2016-06-23