陳娟,喻正軍

(湖南中岸生物藥業(yè)有限公司，長(zhǎng)沙 410000)

不同偽狂犬病活疫苗免疫效力比較

陳娟,喻正軍*

(湖南中岸生物藥業(yè)有限公司，長(zhǎng)沙 410000)

為臨床科學(xué)選用疫苗，對(duì)來自三個(gè)生物制品廠的偽狂犬病活疫苗的免疫效力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。試驗(yàn)選取35日齡偽狂犬陰性豬20頭，試驗(yàn)根據(jù)疫苗接種情況分為5組，分別為：免疫疫苗稀釋液的對(duì)照組(第一組)、免疫進(jìn)口活疫苗組(第二組)、免疫國(guó)產(chǎn)活疫苗組(第三組)、免疫本公司ST細(xì)胞系增殖制備活疫苗組(第四組)、免疫本公司雞胚成纖維細(xì)胞增殖制備活疫苗組(第五組)，然后進(jìn)行免疫監(jiān)測(cè)和效力評(píng)價(jià)，觀察不同疫苗組仔豬的抗體水平后攻毒保護(hù)情況。結(jié)果顯示：一次免疫后各組抗偽狂犬病毒抗體水平增長(zhǎng)緩慢，進(jìn)行二次免疫后，抗體水平迅速增加并保持較高水平。攻毒后，從身體耐受性、體溫變化、體重下降率以及gE抗體水平來看，第二組疫苗B和第四組疫苗D耐受性較強(qiáng)，較快恢復(fù)健康，體重下降率較小且gE抗體水平較高。

偽狂犬??；活疫苗；免疫效力

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以發(fā)熱，奇癢，腦脊髓炎為主要特征的一種烈性傳染病。豬是偽狂犬病毒的天然宿主、貯存者和傳播者。偽狂犬病對(duì)我國(guó)的養(yǎng)豬危害極大，常在豬群中爆發(fā)流行。該病毒可感染各個(gè)年齡段的豬，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率及種豬不育。于今偽狂犬病毒在我國(guó)廣泛的存在，尤其是變異株的出現(xiàn)，給防治偽狂犬病帶來新的困難，嚴(yán)重威脅著我國(guó)豬群的健康，并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。目前我國(guó)偽狂犬病活疫苗毒株以經(jīng)典株Bartha株為主，通過市場(chǎng)調(diào)研，各個(gè)廠家疫苗效果不一[3-5]，但目前并未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)報(bào)道出現(xiàn)[6-8]。本試驗(yàn)篩選市場(chǎng)上免疫效果較好的幾個(gè)廠家的偽狂犬病活疫苗進(jìn)行免疫試驗(yàn)和攻毒試驗(yàn)，比較了解不同廠家偽狂犬病活疫苗的免疫效果，為進(jìn)一步防治偽狂犬病提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞、疫苗、實(shí)驗(yàn)豬 細(xì)胞：用于病毒增殖的ST細(xì)胞系由本公司保存，雞胚成纖維細(xì)胞為采用10日齡SPF雞胚制備。疫苗：疫苗B為外購(gòu)進(jìn)口疫苗，批號(hào)L409725；疫苗C為外購(gòu)國(guó)產(chǎn)疫苗，批號(hào)140196901;活疫苗D采用ST細(xì)胞系增殖制備，采用蔗糖牛奶保護(hù)劑，疫苗批號(hào)201504001；活疫苗E由雞胚成纖維細(xì)胞增殖制備，采用蔗糖牛奶保護(hù)劑，疫苗批號(hào)201504004。實(shí)驗(yàn)仔豬：本公司健康動(dòng)物室提供，由2～3胎經(jīng)產(chǎn)母豬所產(chǎn)35日齡左右仔豬20頭，通過IDEXX抗體試劑盒檢測(cè)證實(shí)偽狂犬病毒gE抗體均為陰性。采用法國(guó)LSI豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)檢測(cè)偽狂犬病毒gB抗體均為陰性。

1.1.2 試劑盒 檢測(cè)偽狂犬野毒抗體ELISA診斷試劑盒：IDEXX PRV gPI(gE)抗體ELISA鑒別診斷試劑盒，購(gòu)自北京愛德士元亨生物科技有限公司。檢測(cè)偽狂犬病抗體水平ELISA檢測(cè)試劑盒：法國(guó)LSI豬偽狂犬病病毒gB抗體檢測(cè)試劑盒。

1.1.3 儀器、耗材 酶標(biāo)儀、離心機(jī)、恒溫箱、移液槍及配套槍頭、離心管架、1.5 mL離心管、10 mL一次性注射器等。

1.1.4 攻毒毒株 攻毒所用偽狂犬強(qiáng)毒為實(shí)驗(yàn)室自行分離偽狂犬病毒變異株，gE基因未缺失，病毒含量為108.0TCID50/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、免疫接種 本實(shí)驗(yàn)共需35日齡仔豬20頭，隨機(jī)分為5組，每組4頭。第一組為對(duì)照組，免疫疫苗稀釋液1 mL/頭。試驗(yàn)組各疫苗每頭份病毒含量不同，為便于進(jìn)行比較分析，選定測(cè)定結(jié)果最高的一組(106.0TCID50/頭份)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行免疫試驗(yàn)。第二組免疫進(jìn)口活疫苗B，免疫劑量為106.0TCID50/頭；第三組免疫國(guó)產(chǎn)活疫苗C，免疫劑量為106.0TCID50/頭；第四組免疫本公司ST細(xì)胞系增殖制備活疫苗D，免疫劑量為106.0TCID50/頭；第五組免疫本公司雞胚成纖維細(xì)胞增殖制備活疫苗E，免疫劑量為106.0TCID50/頭。免疫方式為頸部肌肉注射。首次免疫后28 d，對(duì)試驗(yàn)組進(jìn)行二次免疫，免疫劑量為106.0TCID50/頭，免疫方式為頸部肌肉注射。1.2.2 攻毒實(shí)驗(yàn) 首次免疫4周后，為保證免疫效果和攻毒效果，對(duì)試驗(yàn)組豬進(jìn)行二次免疫，根據(jù)豬偽狂犬病毒gB抗體水平上升情況，二次免疫4周后，從每組4頭試驗(yàn)豬中隨機(jī)抽選2頭進(jìn)行攻毒。

1.2.3 臨床觀察 在動(dòng)物免疫前后和攻毒前后，觀察其采食和精神狀態(tài)，攻毒前及攻毒后1周分別對(duì)試驗(yàn)豬稱重。攻毒后每天觀察2次，測(cè)量體溫2次并記錄臨床癥狀(死亡的除外)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)血清采集 一次免疫后7 d、14 d、21 d、28 d，二免后7 d、14 d、21 d、28 d，攻毒前和攻毒后7 d、14 d、21 d對(duì)試驗(yàn)豬前腔靜脈采血(攻毒死亡的除外)。采血后將血液連同注射器一起放37 ℃環(huán)境2～3 h，等血清析出；將析出的血清5000 r/min下離心10 min，取上清，表明組號(hào)，實(shí)驗(yàn)日期后，放-25 ℃保存待檢。1.2.5 病料檢測(cè) 采用阻斷ELISA法檢測(cè)PRV gE和PRV gB抗體水平。通過計(jì)算樣品(S)與陰性對(duì)照(N)的比例(S/N)來確定偽狂犬gE抗體的有無。S/N=樣品OD650值/陰性對(duì)照平均OD650值，其中：S/N≥0.6，樣品確定為陽性；S/N>0.7，樣品確定為陰性；0.650%為陽性，45%≤Inh%≤50%為可疑。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)組與對(duì)照組一免和二免后不同時(shí)間豬只血清抗偽狂犬病毒抗體水平檢測(cè)結(jié)果見圖1。免疫1周后，與第一組對(duì)照組相比，4種疫苗免疫組都產(chǎn)生了抗體，其中免疫第二組疫苗B后的豬只抗體產(chǎn)生速度最快，抗體水平最高，平均阻斷率達(dá)到75%以上；其次是第四組疫苗D免疫組，平均阻斷率達(dá)到70%，第三組和第五組一免1周后抗體水平最低，平均阻斷率為55%。一免后的4周，4個(gè)免疫組的抗體水平逐漸升高，其中第二組的抗體水平顯著高于其他3組。一免后第4周進(jìn)行二次免疫，二免后，4組免疫組抗體水平迅速上升，平均阻斷率均達(dá)到95%以上，二免后3周，抗體水平穩(wěn)定，平均阻斷率保持在97%的狀態(tài)，第二、第三、第四免疫組疫苗之間免疫效果差異不明顯，第五組疫苗E的免疫效果略低于前三組。

圖1 一免和二免后試驗(yàn)豬只PR抗體水平變化情況

2.2 攻毒后個(gè)體耐受情況 二免后第4周對(duì)5組豬只進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒后，對(duì)照組試驗(yàn)豬癥狀最明顯，表現(xiàn)為震顫或臥地不起，食欲廢絕，呼吸不暢并伴有噴嚏流涕現(xiàn)象，昏迷以至衰竭死亡。第二組和第四組試驗(yàn)豬開始出現(xiàn)精神沉郁，食欲減退以及輕微的呼吸癥狀。第三組和第五組試驗(yàn)豬伴有四肢行走不協(xié)調(diào)，叫聲嘶啞無力，腹瀉以及鼻炎。病豬身體瘦弱導(dǎo)致體重下降，病程持續(xù) 6～10 d，耐受過后動(dòng)物較快恢復(fù)健康。

2.3 攻毒后體重變化 攻毒后豬只體重變化結(jié)果如圖2顯示。攻毒后，試驗(yàn)仔豬體重明顯下降，攻毒后1周試驗(yàn)組仔豬比攻毒前體重下降近50%(對(duì)照組死亡)。其中第二組、第三組、第五組體重下降最為明顯，分別為52.55%、59.3%和55.45%，第四組攻毒前后體重下降30.25%，相對(duì)較少。結(jié)果說明免疫第四組疫苗D后，豬只對(duì)此株偽狂犬野毒的抵抗能力高于免疫其他3組疫苗。

圖2 攻毒前后試驗(yàn)豬只體重變化情況

2.4 攻毒后體溫變化 攻毒后豬只體溫的變化情況如圖3所示。攻毒后，免疫組豬只開始發(fā)熱，體溫上升至40 ℃以上，最高達(dá)到42 ℃。從攻毒后1 d開始持續(xù)發(fā)熱3～4 d，耐受過后體溫開始下降，慢慢恢復(fù)正常。對(duì)照組豬只攻毒后體溫急劇下降至30 ℃以下，而后體溫開始升高至40 ℃以上，攻毒后4～5 d死亡。各免疫組間豬只體溫變化差異不顯著，說明各免疫組豬只免疫偽狂犬病活疫苗后，對(duì)偽狂犬野毒均有一定的抵抗力。

圖3 攻毒后各組試驗(yàn)豬體溫變化情況

2.5 攻毒后偽狂犬病毒gE ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果免疫組攻毒前后偽狂犬病毒抗體水平檢測(cè)結(jié)果見圖4。攻毒前各免疫組豬只偽狂犬病毒gE抗體均為陰性(S/N>0.7)，攻毒后1周，第四組和第五組試驗(yàn)豬偽狂犬病毒gE抗體出現(xiàn)陽性(S/N<0.6)，而第二組和第三組為可疑(0.6≤S/N≤0.7)。攻毒后第3周，4組免疫組豬只偽狂犬病毒gE抗體均轉(zhuǎn)為陽性(S/N<0.6)。攻毒后第3周第二組S/N值最高，其次是第三組、第五組以及第四組，但各免疫組之間gE抗體水平差異不明顯。

圖4 攻毒前后各免疫組偽狂犬病毒gE抗體水平變化情況

3 討論與小結(jié)

3.1 不同廠家偽狂犬病活疫苗免疫效果 本試驗(yàn)中，在不存在母源抗體的情況下，我們對(duì)不同廠家的偽狂犬病活疫苗的免疫效果進(jìn)行比較。從免疫試驗(yàn)可以看出，一次免疫以后，各免疫組抗體水平上升較慢，二免后抗體水平迅速上升且各組平均阻斷率保持在95%～98%，能較好的預(yù)防偽狂犬病的發(fā)生。隨著偽狂犬病毒變異株出現(xiàn)，傳統(tǒng)毒株疫苗難以保護(hù)的現(xiàn)狀下，一次免疫后免疫效果并不理想，試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，本試驗(yàn)中嘗試在一次免疫后4周進(jìn)行二次免疫，再進(jìn)行攻毒，驗(yàn)證此免疫方法下的免疫效果較好。因此，在實(shí)際免疫過程中，我們可以在一免后2周進(jìn)行二次免疫，能夠得到較好的免疫保護(hù)效果。

3.2 不同廠家偽狂犬病活疫苗攻毒情況 為進(jìn)一步比較不同疫苗的免疫效果，我們采用偽狂犬病毒變異株對(duì)5組豬只進(jìn)行攻毒。試驗(yàn)結(jié)果顯示，攻毒后，第二組疫苗B和第四組疫苗D耐受性較強(qiáng)，較快恢復(fù)健康，體重下降率較小且gE抗體水平較高，整體上免疫效力優(yōu)于第三組疫苗C和第五組疫苗E。攻毒后，對(duì)照組豬只全部死亡，說明免疫偽狂犬病活疫苗在一定期限內(nèi)能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫效果，抵御偽狂犬病毒變異株的侵害。但4個(gè)試驗(yàn)組的豬只體重下降都在30%以上，且對(duì)照組全部死亡，說明攻毒毒株毒力較強(qiáng)，但傳統(tǒng)的經(jīng)典毒株疫苗可以起到一定的保護(hù)效果。

通過本次試驗(yàn)，說明在無母源抗體存在的情況下，仔豬免疫偽狂犬病活疫苗有一定的保護(hù)作用。因毒株變異等原因，影響到傳統(tǒng)毒株活疫苗免疫效果，可以在一次免疫后進(jìn)行二次免疫，能夠達(dá)到較好的保護(hù)。攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，第二組進(jìn)口疫苗B的免疫效果較好，能夠有效的抵御偽狂犬病野毒的侵襲，采用傳代細(xì)胞制備的第四組疫苗D的免疫效果跟第二組進(jìn)口疫苗B相當(dāng)，同時(shí)從經(jīng)濟(jì)成本和免疫效果考慮，可以使用有效的國(guó)產(chǎn)疫苗。

[1] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 中國(guó)獸用生物制品規(guī)程[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[2] 鄧仕偉，汪勇，薛春芳. 我國(guó)偽狂犬病流行現(xiàn)狀及新特點(diǎn)[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展， 2006， 27(9): 105-107.

[3] 袁章，郭萬柱，余光勇, 等. 豬偽狂犬病毒載體的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(6): 1673-1674.

[4] 楊毅，李文剛，饒寶, 等. 豬偽狂犬病疫苗的研究進(jìn)展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22(3): 154-157.

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[7] 孔令達(dá). 我國(guó)偽狂犬病現(xiàn)狀及偽狂犬病疫苗的應(yīng)用[J]. 養(yǎng)豬, 2000, 1: 39-40.[8] 董瑜，黎建雄，黃輝. 偽狂犬滅活疫苗及弱毒疫苗對(duì)商品仔豬免疫效果比較試驗(yàn)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008, (9):169-170.

(編輯：李文平)

Comparision of Immune Efficacy of Pseudorabies Vaccines from Different Bio-factories

CHEN Juan，YU Zheng-jun*

(HunanSinolandBiologicalPharmaceuticalCo.Ltd,Changsha410000,China)

Immune Efficacy of pseudorabies vaccine from three bio-factories was evaluated to provide data for the selection of this kind of vaccine in practice. Twenty 35-day pigs with both sero-geative and pathogen negative was selected and divided into five groups, the first group was the blank control, the second to the fifth group was invidually intramuscular injected with one kind of imported vaccine from a famous company, one kind of vaccine from a company in China, ST origin vaccine from our factory, CEF origin vaccine from our factory. Antibody titres and immune efficacy was monitored at two time points. The data demonstrated antibody titres for the gB fragment of pocine pseudorabies rised slowly after the first innoculation, then this certain antibody titres for gB elevated rapidly and stably after the second vaccination. Furthermore, some clinic index, including body resistaned, temperature fluctuation, weight loss, etc. and antibody levels for gE after poison attacking was comprehensively evaluated. The result showed that there were more tolerance, more recovery, higher gE antibody and less weight losing in the second and the fourth group.

pseudorabies; live vaccine; immune efficacy

陳娟，碩士，從事生物制品品質(zhì)提升與研發(fā)工作。

喻正軍。E-mail: yuzj@ringpu.com

2016-07-29

A

1002-1280 (2017) 01-0015-04

S852.5