楊洪早,苗小樓,張世棟,董書偉,閆寶琪,桑夢琪, 那立冬,王東升*,嚴作廷*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，蘭州 730050) (2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

藿芪灌注液中淫羊藿苷和黃芪甲苷穩(wěn)定性試驗研究

楊洪早1,2,苗小樓1,張世棟1,董書偉1,閆寶琪1,桑夢琪1, 那立冬1,2,王東升1*,嚴作廷1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，蘭州 730050) (2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070)

為了研究藿芪灌注液的穩(wěn)定性，采用HPLC法測定藿芪灌注液中淫羊藿苷與黃芪甲苷含量，使用WondaSil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈-水28∶72，柱溫40 ℃，檢測波長270 nm，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min測定淫羊藿苷的含量；使用ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，漂移管溫度為90 ℃，載氣流速為2.5 L/min，流動相：甲醇-水65∶35，柱溫：40 ℃，流速：1 mL/min，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測測定黃芪甲苷的含量。藿芪灌注液于高溫60 ℃放置10 d，高濕度90%±5%放置10 d，經(jīng)強光照射4500±500LX放置10 d，加速試驗在溫度40 ℃±2 ℃、相對濕度75%±5%的條件下放置6個月，長期試驗在溫度25 ℃±2 ℃、相對濕度60%±10%的條件下放置12個月，考察藿芪灌注液在不同條件存放后的性狀、鑒別、pH、淫羊藿苷含量、黃芪甲苷含量以及無菌檢查等項目的變化。結(jié)果表明，藿芪灌注液性質(zhì)穩(wěn)定，在不同條件存放后所有指標(biāo)均未有明顯變化，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

藿芪灌注液；穩(wěn)定性試驗；高效液相色譜法；淫羊藿苷；黃芪甲苷

藿芪灌注液，又名催情助孕液，是由淫羊藿、黃芪、丹參等中藥組成的子宮灌注劑，以中醫(yī)藥學(xué)理論為基礎(chǔ)，運用現(xiàn)代中藥制劑技術(shù)，其成分明確，具有益氣壯陽、催情助孕、補血養(yǎng)陰之功，臨床主治于奶牛卵巢靜止和持久性黃體不孕癥[1]。目前，已有對本品的制備工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效學(xué)進行的相關(guān)研究報道[2-4]。為保證該制劑的質(zhì)量及療效，為其生產(chǎn)、包裝、貯存、運輸和有效期的確定建立科學(xué)依據(jù)，依據(jù)《中國藥典》(2015年版一部)、《中國獸藥典》(2010年版二部)、《獸用中藥、天然藥物穩(wěn)定性試驗技術(shù)指導(dǎo)原則》規(guī)定[5-7]，在擬市售包裝(鈉鈣玻璃模制注射劑瓶，強光照條件下除外)的基礎(chǔ)上對藿芪灌注液進行影響因素試驗、加速試驗和長期試驗研究，考察性狀、pH、有效成分的含量變化以及無菌檢查等來評價制劑穩(wěn)定性。

1 儀器與藥品

1.1 儀器設(shè)備 DL-101-2BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，GH4500型隔水式培養(yǎng)箱，PYX-DHS-40×50-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，HH.BII420 S型電熱恒溫培養(yǎng)箱，MT-250B藥品穩(wěn)定性試驗箱，PHS-3C型pH計。島津LC 20AD高效液相色譜儀，SPD-20A紫外檢測器：一元泵，LabSolutions工作站，柱溫箱，WondaSil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；Agilent 1260 高效液相色譜儀，Alltech ELSD2000ES檢測器：在線脫氣機，四元泵，ChemStation工作站，CSChrom Plus工作站，柱溫箱，ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)。1.2 藥品 藿芪灌注液，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制，含量測定批號20120801、20120802、20120803、20120804、20120805、20120901、20120902、20120903、20120904、20120905；穩(wěn)定性試驗批號20121001、20121002、20121003，模擬市售包裝(鈉鈣玻璃模制注射劑瓶)；淫羊藿苷(批號110737-200415，中國藥品生物制品檢定所)；黃芪甲苷(批號110781-200613，中國藥品生物制品檢定所)；乙腈、甲醇均為色譜純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀、pH、相對密度測定、無菌檢查 參照《中華人民共和國獸藥典》 2010 年版二部附錄Ⅶ，在自然光條件下白色背景中通過肉眼直接觀察灌注液性狀; 使用酸度計測量灌注液pH；使用薄膜過濾法檢查無菌試驗。

2.2 含量測定

2.2.1 淫羊藿苷含量測定

2.2.1.1 色譜條件 固定相：WondaSil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：乙腈-水28∶72，檢測波長270 nm，柱溫40℃，進樣量10 μL，流速1.0 mL/min，理論塔板數(shù)以淫羊藿苷計不低于1500。

2.2.1.2 樣品溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取淫羊藿苷對照品11.68 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成233.6 μg/mL的對照品儲備溶液。精密移取儲備液5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成116.8 μg/mL的對照品溶液①，吸取對照品溶液①1 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，即得濃度為11.68 μg/mL的對照品溶液②。

供試品溶液的制備：精密量取藿芪灌注液1 mL，置25 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

陰性對照溶液的制備：取按處方比例并以相同工藝制備的缺淫羊藿的陰性對照供試品，按供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。

2.2.1.3 樣品含量測定 精密量取10批藿芪灌注液，按2.1.2.2項下供試液樣品的制備方法處理樣品，按以上色譜條件測定淫羊藿苷含量。結(jié)果得平均含量為0.242 mg/mL，RSD為7.49%。考慮到大規(guī)模生產(chǎn)中的各種損失和測量誤差，取其平均值的80%作為其含量限度，即得0.1936 mg/mL，故暫定本品含淫羊藿按淫羊藿苷計不少于0.20 mg/mL。

照影響因素試驗條件下測其含量，按2.1.2.2項下供試液樣品制備方法處理同批次兩份樣品，同以上色譜條件進樣10 μL，按外標(biāo)法測定淫羊藿苷含量，詳見影響因素試驗結(jié)果表。

2.2.2 黃芪甲苷含量測定

2.2.2.1 色譜條件 固定相：ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，漂移管溫度為90 ℃，載氣流速為2.5L/min，流動相：甲醇-水65∶35，流速：1 mL/min，柱溫：40 ℃，進樣量10 μL用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計算應(yīng)不低于3000。

2.2.2.2 樣品溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取黃芪甲苷對照品11.95 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，制成1.195 mg/mL的對照品儲備液，精密量取對照品儲備液1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度0.239 mg/mL的對照品溶液。

供試品溶液的制備：精密量取藿芪灌注液25 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次25 mL，棄去氨液，取正丁醇液，揮干溶劑，殘渣加甲醇溶解并移至5 mL量瓶中，加甲醇稀定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照溶液的制備：取按處方比例并以相同工藝制備的缺黃芪的陰性對照供試品，按供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。

2.2.2.3 樣品含量測定 精密量取10批藿芪灌注液樣品25 mL，按2.2.2.2項下供試品溶液的制備方法制備樣品，按以上色譜條件測定黃芪甲苷含量。結(jié)果10批藿芪灌注液樣品中黃芪甲苷的的平均含量為64.653 μg/mL，考慮到大規(guī)模生產(chǎn)中的各種損失，取其平均值的80%作為其含量限度，即得45.55 μg/mL，故暫定本品黃芪按黃芪甲苷計不少于45.0 μg/mL。

照影響因素試驗條件下測其含量，按2.2.2.2項下供試液樣品制備方法處理同批次兩份樣品，同以上色譜條件進樣10 μL，按外標(biāo)法測定黃芪甲苷含量，詳見影響因素試驗結(jié)果表。

2.3 影響因素試驗

2.3.1 高溫試驗 將三批樣品(批號20121001、20121002、20121003)置于DL-101-2BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(控制溫度：室溫～300 ℃)，在溫度60 ℃的條件下放置10 d。依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案在0、5、10 d各取樣品，考察其性狀、鑒別、含量、相對密度、pH值及無菌。結(jié)果見表1。

2.3.2 高濕試驗 將三批樣品置于GH4500型隔水式培養(yǎng)箱，在溫度25℃，相對濕度90%±5%的條件下放置10 d。在0、5、10 d各取樣品，依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案考察其性狀、鑒別、含量、pH值及無菌。結(jié)果見表1。

2.3.3 強光照射試驗 將三批樣品置于MT-250B藥品穩(wěn)定性試驗箱，在溫度20 ℃，暴露于4500±500LX的條件下放置10 d。依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案在0、5、10 d各取樣品，考察其性狀、鑒別、含量、pH值及無菌。結(jié)果見表1。

藿芪灌注液影響因素試驗結(jié)果表明高溫和高濕及強光照射條件條件下，其考察項性狀、鑒別、無菌檢查項目無異常，pH和淫羊藿苷含量變化不顯著，黃芪甲苷含量變化差異極顯著(P<0.01)，但未低于最低含量限制(45.0 μg/mL)，故從此變化得出該制劑應(yīng)在室溫下密閉貯存，在生產(chǎn)中要嚴格控制生產(chǎn)與貯存環(huán)境的濕度與溫度，這樣可以保證該制劑全、穩(wěn)定、有效。該試驗為藿芪灌注液大生產(chǎn)中控制車間生產(chǎn)條件與儲存條件提供了理論依據(jù)。

表1 藿芪灌注液影響因素試驗(n=3)

與初始值相比，標(biāo)注(a)表示P<0.05顯著；(aa)表示P<0.01極顯著；同組間相比，標(biāo)注(b)表示P<0.05顯著；(bb)表示P<0.01極顯著；下同。除含量變化百分比外，其余結(jié)果均保留三位有效數(shù)字。淫羊藿苷、黃芪甲苷其含量變化百分比(%)=所測得含量/初始含量，下同。

2.4 加速試驗 將三批樣品(批號20121001、20121002、20121003)置于PYX-DHS-40×50-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，在溫度40±2℃，相對濕度75%±5%的條件下放置6個月。在0、1、2、3、6個月各取樣品，依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案考察其性狀、鑒別、含量、pH值及無菌，結(jié)果顯示：其考察項性狀、鑒別、無菌檢查項目無異常，pH和淫羊藿苷含量變化不顯著，其中黃芪甲苷含量20121002批變化無顯著性，而20121001批和20121003批差異顯著(P<0.05)，但未低于最低含量限制(45.0 μg/mL)，綜合其考察項在6個月內(nèi)變化不明顯，樣品較穩(wěn)定，符合規(guī)定。結(jié)果見表2。

表2 藿芪灌注液加速試驗(n=2)

2.5 長期試驗 將三批樣品置于HH.BII420 S型電熱恒溫培養(yǎng)箱，在溫度25℃±2℃，相對濕度60%±10%的條件下放置24個月。依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案在0、3、6、9、12、18、24個月月末取樣，考察其性狀、鑒別、含量、pH值及無菌，結(jié)果表明：其考察項性狀、鑒別及無菌無異?，F(xiàn)象，淫羊藿苷和黃芪甲苷含量在放置24個月均有顯著差異變化，但都未低于最低含量(淫羊藿苷不少于0.20 mg/mL，黃芪甲苷不少于45.0 μg/mL)，樣品較穩(wěn)定，符合規(guī)定，結(jié)果見表3。

表3 藿芪灌注液長期試驗結(jié)果(n=2)

3 討 論

淫羊藿和黃芪作為該制劑中的君藥，也是發(fā)揮主要藥理活性作用，對其藥材中主要成分淫羊藿苷和黃芪甲苷進行含量測定研究，對完善本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有十分重要的作用，同時也能有效控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，對發(fā)揮臨床藥效具有重要的意義[8-9]。本制劑參考《中國藥典》淫羊藿苷含量測定方法進行研究，對其柱溫、流速、流動相比例進行系統(tǒng)適用性試驗以及波長的選擇，試驗證明以流動相乙腈-水28∶72、檢測波長270 nm、柱溫40 ℃、流速1.0 mL/min的色譜條件對淫羊藿苷的測定具有較強的專屬性，能達到基線平衡、與其他組分離度較高、峰形對稱、陰性對照無干擾、也縮短了分析時間，便于作為該制劑的含量測定研究[10-11]。其黃芪甲苷含量測定參考《中國藥典》方法，考察了流動相比例、流速及溫度的變化，最終確定色譜條件為：漂移管溫度為90 ℃，載氣流速為2.5 L/min，流動相：甲醇-水65∶35，流速：1mL/min，柱溫：40 ℃，其所測得結(jié)果靈敏度高、分離度好、前處理簡便、重現(xiàn)性好[12-13]。其含量測定方法學(xué)研究在此前已進行試驗，在此不做研究說明。

藿芪灌注液采用經(jīng)典的水提醇沉工藝制備[2]，可保留較全的有效成分，灌注液性狀棕紅色澄清液體，并通過淫羊藿苷、黃芪甲苷含量以控制灌注液的質(zhì)量。該制劑進行影響因素試驗和加速試驗的目的是考察制劑處方與生產(chǎn)工藝及包裝條件的合理性。在影響因素試驗中淫羊藿苷、黃芪甲苷含量都有不同程度下降，此兩種成分在強光和高溫條件下容易分解[14-15]，說明高溫和強光是影響本品穩(wěn)定性的一個主要因素。因此在提取、濃縮滅菌等生產(chǎn)環(huán)節(jié)需注意對溫度和時間的控制，以及運輸、存放時需注意強光和高溫對本品的穩(wěn)定性影響[16]。而且藥液pH也是影響其穩(wěn)定性的一個重要因素，在酸性、弱堿性和中性條件下其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但在強酸性和強堿性條件下淫羊藿苷、黃芪甲苷穩(wěn)定性差，結(jié)構(gòu)易改變[17]，故在進行批量生產(chǎn)時應(yīng)慎重處理或進一步研究是否調(diào)整藥液pH值。

4 結(jié) 論

綜上所述，根據(jù)本試驗的穩(wěn)定性考察結(jié)果，建議可將藿芪灌注液的有效期暫定為2年，使用棕色無菌聚酯瓶，貯藏條件為密閉，室溫保存。試驗通過對該制劑的穩(wěn)定性研究，進一步為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供理論依據(jù)，也為該新藥的申報資料提供試驗方法和數(shù)據(jù)，對該藥物的進一步深入研究和有效開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

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(編輯：陳希)

Study on Stability of Icariin and Astragaloside in Huoqi Perfusion

YANG Hong-zao1,2, MIAO Xiao-lou1,ZHANG Shi-dong1,DONG Shu-wei1,YAN Bao-qi1, SANG Meng-qi1,NA Li-dong1,2,WANG Dong-sheng1*,YAN Zuo-ting1*

(1.LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticalDiscovery,MinistryofAgriculture,Lanzhou730050 ,China) (2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

To investigate the stability of Huoqi perfusion, the contents oficariin and astragaloside were determined by HPLC.The separation of the icariin was achieved by a WondaSil-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm) and mobile phase composed of acetonitrile-water(28∶72),the detection wavelength was 270 nm,the column temperature was 40 ℃,the injection volume of 10 μL,the flow rate was 1.0 mL/min；The separation of the astragaloside was achieved by a ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),The drift tube temperature is 90 ℃,The carrier gas flow rate is 2.5 L/min and mobile phase composed of methanol-water(65∶35) , the flow rate was 1.0 mL/min;the injection volume of 10 μL; the column temperature was 40 ℃,with evaporative light scattering detector. Huoqi Perfusionwas treated respectively with high temperature(60 ℃)for 10 d, high wet(RH95%±5%)for 10 days,high light(4500±500LX )for 10 days,accelerating testing (40 ℃±2 ℃,RH75%±5%)for six months,and a long-term testing (25 ℃±2 ℃,RH60%±10%) for twelve months,and then the changes of characters,identification, pH,icariin,astragaloside and sterility test under different storage conditions were observed. All of the tested indexes of Huoqi Perfusion were consistent with the quality standards. The tested of Huoqi perfusion is stable and reliable.

Huoqi perfusion;stability test;HPLC;icariin;astragaloside;

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項目(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03)；"十二五"國家科技支撐計劃重點課題(2012BAD12B03)

楊洪早，碩士研究生，從事中獸藥研發(fā)方面研究。

嚴作廷，E-mail：yanzuoting@caas.cn；王東升，E-mail：lzmyswdsh@126.com

2016-08-04

A

1002-1280 (2017) 01-0019-06

S853.74