李巧亮，張萍，牛春

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

不同種類植物油及黃豆餅粉對那西肽發(fā)酵的影響

李巧亮，張萍，牛春*

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川 750101)

有機氮源和碳源質(zhì)量的波動是引起那西肽發(fā)酵單位波動的重要原因之一，為選用最有效的有機氮源和碳源生產(chǎn)那西肽并保持穩(wěn)定的發(fā)酵水平，試驗以發(fā)酵搖瓶平均化學(xué)效價為指標(biāo)，比較及評價了6種不同種類植物油及4種不同加工溫度生產(chǎn)的黃豆餅粉對那西肽發(fā)酵產(chǎn)生的影響。結(jié)果表明，低溫黃豆餅粉-菜籽油為最佳組合，其搖瓶平均化學(xué)效價比對照高出44.11%。即不同種類植物油由于所含脂肪酸種類和比例不同，不同加工溫度的黃豆餅粉由于營養(yǎng)物質(zhì)含量不同，均會很大程度影響那西肽發(fā)酵。

那西肽；植物油；黃豆餅粉；效價

那西肽(Nosiheptide)，又稱諾西肽(Multithiomycin)，是含硫多肽類抗生素，目前一般采用活躍鏈霉菌(Streptomycesactuosus)發(fā)酵產(chǎn)生[1]。對革蘭氏陽性菌有良好的抑菌效果[2]，可以促進(jìn)牲畜生長，提高飼料利用率，具有用量少、無藥物殘留、毒性小、對環(huán)境影響小等特點[3]，被批準(zhǔn)為我國國家三類新獸藥。作為那西肽發(fā)酵的有機氮源，蛋白胨、牛肉膏、黃豆餅粉效果都較好，但從生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性、可行性考慮，黃豆餅粉則為最佳選擇。它是發(fā)酵液中發(fā)泡的主要因素，產(chǎn)生的泡沫多而持久，使發(fā)酵液粘度很大。不同產(chǎn)地、不同加工溫度、不同儲存條件的黃豆餅粉質(zhì)量相差很大[4]。植物油在抗生素發(fā)酵過程中充當(dāng)著氧載體、消沫劑、碳源，能夠顯著提高抗生素產(chǎn)量。油脂具有疏水性，微溶于水，因而可以作為緩慢利用碳源，避免因碳源的迅速利用而引起的分解代謝物阻遏作用[5]。油脂作為碳源被利用，主要是脂肪酸發(fā)揮作用[6]。不同植物油由于脂肪酸含量和種類、生產(chǎn)原料、生產(chǎn)季節(jié)、提取方法、儲存條件不同，質(zhì)量也存在很大差異。然而二者對發(fā)酵生產(chǎn)的影響是多尺度并存在交互作用的，宏觀上影響著最大菌絲濃度、氨氮代謝、糖代謝、發(fā)酵周期、發(fā)酵效價等工藝參數(shù)，微觀上對菌絲生長、菌絲結(jié)構(gòu)、初級代謝向次級代謝轉(zhuǎn)換等均有重要影響[7]。為初步探究二者影響那西肽發(fā)酵的機理、降低成本、提高生產(chǎn)水平，本文比較了不同種類植物油及不同加工溫度生產(chǎn)的黃豆餅粉對那西肽發(fā)酵的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 活躍鏈霉菌(Streptomycesactuosus)，經(jīng)寧夏泰瑞制藥股份有限公司自然分離篩選得到的高產(chǎn)、傳代穩(wěn)定的菌株：RNX15-92，單菌落直徑3～5 mm，灰白色，禮帽型，低溫管保藏。

1.1.2 主要設(shè)備 旋轉(zhuǎn)搖瓶機，XDW25/96型，四川長征制藥機械廠；紫外可見分光光度計，UV-1800，日本島津；恒溫、凈化工作系統(tǒng)。

1.1.3 試劑及原料 植物油購自山東青島菜香花生油有限公司。黃豆餅粉購自石家莊市欒城區(qū)華昌化工有限公司，經(jīng)純物理壓榨加工、粉碎、精致而成，主要區(qū)別在于加工溫度不同：生磨豆粉為直接磨制、低溫豆粉為80 ℃左右蒸炒、中溫豆粉為100 ℃左右蒸炒、高溫豆粉為130～140 ℃左右蒸炒。無水乙醇、四硼酸鈉、硼酸、正丁醇、氫氧化鈉等均為分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：口服葡萄糖、蛋白胨、硫酸銨、七水合硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸錳、玉米漿、試劑碳酸鈣、硫酸鋅、氯化銅、氯化鈷、瓊脂，純化水定容，pH 7.00，50/250 mL茄瓶分裝，120～121 ℃、0.10～0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min。種瓶培養(yǎng)基：蔗糖、硫酸銨、蛋白胨、玉米漿、輕質(zhì)碳酸鈣，自來水定容，pH 6.50，50/250 mL三角瓶分裝，120～121℃、0.10～0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉、淀粉酶、黃豆餅粉、乳化劑np-30、硫酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、輕質(zhì)碳酸鈣、植物油，自來水定容，50/250 mL三角瓶分裝，pH 7.00，120～121 ℃、0.10～0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2.2 培養(yǎng)方法 挖取新鮮斜面約1.5 cm2接種至種瓶培養(yǎng)基中并搗碎，培養(yǎng)溫度29 ℃，濕度20%～30%，轉(zhuǎn)速240 r/min，置搖瓶機震蕩培養(yǎng)30 h。將種子液以7%的接種量轉(zhuǎn)至發(fā)酵瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度29 ℃，濕度20%～30%，轉(zhuǎn)速240 r/min，置搖瓶機震蕩培養(yǎng)232～240 h結(jié)束，測定發(fā)酵液的pH、總糖、氨基氮、化學(xué)效價。

1.2.3 單因素實驗 每批發(fā)酵瓶中添加不同種類植物油，以不加植物油為對照。生磨、低溫、中溫、高溫分別代表不同加工溫度生產(chǎn)的黃豆餅粉。分別進(jìn)行植物油及黃豆餅粉的單因素實驗，每批實驗重復(fù)三次，每次設(shè)置三個平行樣同時發(fā)酵。

1.2.4 交互作用實驗 選取2種效價最高的植物油，與2種效價最高的黃豆餅粉進(jìn)行交互作用實驗，驗證它們之間是否有交互作用。

1.2.5 驗證實驗 將效價最高的組合與不加植物油-效價最低黃豆餅粉組合做對比，驗證其組合效果。1.2.6 那西肽的含量測定 從發(fā)酵搖瓶中吸取2.5 mL發(fā)酵液于25 mL比色管中，加入7.5 mL無水乙醇，加蓋，充分搖勻，于39 ℃恒溫水浴鍋保溫30 min，過濾，吸取1 mL上清液，加入10 mL硼砂緩沖液和8 mL正丁醇溶液，充分搖勻，放入39 ℃恒溫水浴鍋保溫20 min，吸取4 mL上層液體與4 mL無水乙醇混合，搖勻，408 nm處測定A值。效價=A×稀釋倍數(shù)×1000。發(fā)酵液中總糖、氨基氮含量的測定分別采用斐林試劑法和甲醛法[8]。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)用EXCEL統(tǒng)計函數(shù)STDEV計算[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同加工溫度的黃豆餅粉對發(fā)酵搖瓶效價的影響 如圖1所示。由圖1可得不同加工溫度的黃豆餅粉對那西肽發(fā)酵效價有很大影響。黃豆餅粉種類不同，發(fā)酵效價差別顯著，效價從高到低的順序依次為：低溫黃豆餅粉>生磨黃豆餅粉>中溫黃豆餅粉>高溫黃豆餅粉。低溫黃豆餅粉比生磨、中溫、高溫黃豆餅粉的發(fā)酵效價分別高出1.53%、25.93%和38.87%。

圖1 不同加工溫度的黃豆餅粉對發(fā)酵搖瓶效價的影響

2.2 低溫黃豆餅粉對發(fā)酵液中氨基氮含量和pH的影響 如圖2所示。從圖2可以看出，氨基氮在整個發(fā)酵過程中的變化表現(xiàn)為：早期40 h有所升高，原因可能是大分子有機氮源被分解，釋放出較多的氨基酸，然后逐漸下降，在88 h降至最低，112～184 h菌體次級代謝活躍，氮源的分解產(chǎn)生了大量的含氮化合物，使氨基氮緩慢上升，184 h以后營養(yǎng)成分不足引起菌體自溶，因此氨基氮的量迅速增加，發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到峰值。

圖2 低溫黃豆餅粉發(fā)酵液中氨基氮含量和pH變化曲線

從圖2中可以看出，隨著菌體的生長和代謝，pH變化呈S形波動趨勢，即先下降，后升高。菌體的生長與合成代謝產(chǎn)物的相對pH有所不同：菌體生長階段pH范圍約為6.65～6.96，此時菌種具有最大的比生長速率；菌體代謝階段pH約為7.37～7.46，此時那西肽合成效價最高；菌體自溶階段pH約為8.32～8.84，此時菌體快速溶解，發(fā)酵結(jié)束。

實驗同時測定了四種黃豆餅粉發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中氨基氮的最終含量，三組實驗，三個平行，結(jié)果如表1，可以發(fā)現(xiàn)效價最高的黃豆餅粉，氨基氮的最終含量也最高。說明低溫黃豆餅粉可以更好的被菌體利用，積累大量的菌絲，菌濃的增加使抗生素合成總量加大，從而提高發(fā)酵效價。

表1 不同種類黃豆餅粉發(fā)酵液中氨基氮終含量

2.3 不同種類植物油對發(fā)酵搖瓶效價的影響 不同種類植物油對那西肽效價影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，植物油種類不同，那西肽效價也有很大差異，其效果從高到低依次為：菜籽油>大豆油>玉米油>花生油>橄欖油>芝麻油。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，植物油的加入對那西肽的合成、發(fā)酵液外觀都有很大影響。和不加植物油的對照相比，當(dāng)添加植物油后，發(fā)酵搖瓶的泡沫顯著減少，顏色更偏黃綠色，效價顯著提高。實驗可以證明菌種脂肪酶活性較強，在發(fā)酵的某階段，可將植物油分解成甘油和脂肪酸，然后脂肪再經(jīng)氧化分解，參與菌體代謝。

圖3 不同種類植物油對發(fā)酵搖瓶效價的影響

2.4 不同種類植物油對發(fā)酵液pH的影響 不同種類植物油對發(fā)酵搖瓶pH的影響如圖4所示。從圖4中可以看出，不加植物油的對照組，pH變化大，不能有效的使發(fā)酵液的酸堿度維持在適合菌種生長和代謝的環(huán)境。而在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同種類的植物油以后，對發(fā)酵過程中pH的穩(wěn)定能起到很大作用。

圖4 不同種類植物油對發(fā)酵搖瓶pH的影響

2.5 不同種類植物油對發(fā)酵液總糖含量的影響

圖5 不同種類植物油發(fā)酵液中總糖含量變化曲線

不同種類植物油對發(fā)酵液總糖含量的影響如圖5所示。從圖中可以看出，在發(fā)酵前期，菌體快速生長，糖被快速消耗，菌體大量繁殖；發(fā)酵中期菌絲成網(wǎng)且形成菌核，那西肽迅速產(chǎn)生，此時總糖的量也接近最低水平；至發(fā)酵后期，菌絲和菌體自溶，總糖含量略有升高。這一過程符合抗生素發(fā)酵的一般規(guī)律。

實驗同時測定了四種效價較高植物油發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中總糖含量(表2)，發(fā)現(xiàn)植物油效價越高，發(fā)酵液總糖終含量越低。說明植物油效價越高，糖被利用的越徹底，效價越高。

表2 不同種類植物油發(fā)酵液中總糖最終含量

2.6 交互作用實驗 在實驗中發(fā)現(xiàn)，黃豆餅粉和植物油的組合種類不同，發(fā)酵搖瓶效價也有很大差別，即二者之間有交互作用。因此進(jìn)行了二者的交互作用實驗，并得出了一定規(guī)律，具體結(jié)果如表3所示。從表3中可以看出，當(dāng)使用生磨豆餅粉時，3次實驗結(jié)果都是添加豆油的效價高于添加菜籽油的效價；而當(dāng)使用低溫豆餅粉時，3次實驗結(jié)果都是添加菜籽油的效價高于添加豆油的效價；且低溫黃豆餅粉-菜籽油組合效價最高，確定為最佳組合。

表3 交互作用實驗

2.7 驗證實驗 將最佳組合低溫黃豆餅粉-菜籽油與高溫黃豆餅粉-不加植物油組合做對比，此組合平均效價可以達(dá)到5789 U/mL，和對照4017 U/mL相比，發(fā)酵搖瓶效價提高了44.11%，效果非常顯著(圖6)。

圖6 驗證實驗

3 討論與小結(jié)

pH是那西肽發(fā)酵生長和產(chǎn)物合成非常重要的工藝參數(shù)，是代謝活動的綜合指標(biāo)。菌種在發(fā)酵過程中，pH變化會影響基質(zhì)利用速率、各種酶活和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而影響菌體生長和產(chǎn)物合成。速效氮源的使用會造成培養(yǎng)基的pH偏高，對菌體生長不利；而有機氮源營養(yǎng)豐富，且菌體本身含有豐富的蛋白酶系，可以持續(xù)對其分解利用，且生長過程中始終能使培養(yǎng)基的pH保持相對穩(wěn)定，對菌體生長有利[10]。黃豆餅粉的主要區(qū)別在于加工溫度不同，從而蛋白、脂肪、水份、灰份和酸價等指標(biāo)均存在顯著差異，低溫黃豆餅粉水份、蛋白、脂肪和灰份含量分別為≤12%、≥41%、≤10%、≤8%，而高溫黃豆餅粉則分別為≤8%、≥40%、≤8%、≤10%[11]，即黃豆餅粉蛋白、水份和脂肪含量越高，灰份含量越低，越有利于穩(wěn)定搖瓶發(fā)酵過程中的pH和提高最終平均化學(xué)效價。黃豆餅粉亦是發(fā)酵液中發(fā)泡的主要因素，產(chǎn)生的泡沫多而持久，使發(fā)酵液粘度很大。而植物油作為消沫劑，可以很好的解決這一問題。添加植物油之后，搖瓶發(fā)酵液泡沫會顯著減少。

油脂的主要成分是碳原子數(shù)量不同的短鏈和長鏈脂肪酸，主要是C-12、C-16、C-18脂肪酸。如大豆油主要含有硬脂酸、油酸、棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸等；菜籽油除了含有以上主要成份外，還含有芥酸[12]。而芝麻油的成份則比較簡單，根據(jù)不同植物油中脂肪酸種類和比例的不同結(jié)合實驗結(jié)果，可得不同種類植物油對那西肽效價產(chǎn)生不同影響的原因可能有以下兩點：一是脂肪酸組成的復(fù)雜性造成的，即植物油所含脂肪酸種類越復(fù)雜，那西肽的發(fā)酵效價就越高；二是飽和和不飽和脂肪酸的比例造成的，即不飽和脂肪酸和那西肽效價呈正相關(guān)關(guān)系[13]。

不同產(chǎn)地、不同加工溫度、不同儲存條件的黃豆餅粉質(zhì)量相差很大。不同植物油由于脂肪酸含量和種類、生產(chǎn)原料、生產(chǎn)季節(jié)、提取方法、儲存條件不同，質(zhì)量也存在很大差異。本文對原材料加工方法、品種等相關(guān)條件進(jìn)行了試驗及分析，有效避免了因碳源和氮源質(zhì)量波動而引起的那西肽發(fā)酵pH和生產(chǎn)效價波動，亦改善了發(fā)酵泡沫引起的染菌等問題，顯著提高了發(fā)酵水平，對于那西肽的生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

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(編輯：侯向輝)

Effect of Vegetable Oils and Soybean Powder on Nosiheptide Fermentation

LI Qiao-Liang, ZHANG Ping, NIU Chun*

(NingxiatairuiPharmaceuticalCoLtdStrainsInstitute,Yinchuan750101,China)

The titer of nosiheptide in the shake flask was significantly influced by the quality of organic nitrogens and carbon sources. In this paper we compeared and evaluated the influence of six kinds of vegetable oils and four kinds of soybean powder pruduced by different processing temperatures, in order to maintain a stable level and select the most effective organic nitrogen and carbon sources by the average titer of nosiheptide in the shake flask. The results showed that low temperature soybean and rapeseed was the best combinationl, the average titer of nosiheptide in the shake flask was 44.11% higher than the contrast. So the average titer of nosiheptide in the shake flask was significantly influced by the nutrient contents of soybean powder and different percentages of fatty acids in vegetable oils.

nosiheptide; vegetable oils; soybean powder; titer

李巧亮，研究生，從事菌種生產(chǎn)和研究。

牛春。E-mail: niuchun1974@163.com

2016-08-04

A

1002-1280 (2017) 01-0025-05

S859.796