丁嬋，褚秀玲，蘇建青

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院 山東聊城 252059)

中藥黃芩苷對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的安全濃度和生長(zhǎng)的影響

丁嬋，褚秀玲*，蘇建青

(聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院 山東聊城 252059)

為了研究中藥黃芩中有效成分黃芩苷對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)生長(zhǎng)的影響，應(yīng)用細(xì)胞病變觀察法(CPE)觀察黃芩苷對(duì)CEF細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，并采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定黃芩苷對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的最大安全濃度。黃芩苷濃度在312.5 μg/mL時(shí)為最大安全濃度，低于此濃度時(shí)黃芩苷能促進(jìn)CEF的貼壁及生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈梭形，折光性強(qiáng)。結(jié)果表明，黃芩苷在中、低濃度能促進(jìn)CEF細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)且對(duì)CEF細(xì)胞的作用都具有時(shí)效性，應(yīng)用細(xì)胞病變觀察法與MTT法，最終得出黃芩苷對(duì)CEF的最大安全濃度為312.5 μg/mL。

黃芩苷；CEF細(xì)胞；安全濃度

中藥具有多功能、多靶向和藥食同源的作用，是保障畜禽健康養(yǎng)殖，替代抗生素的重要途徑之一[1-2]。黃芩(Radix Scutellariae)是唇形科植物黃芩屬多年生草本植物，其根可入藥，性寒味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，是臨床畜禽呼吸道疾病常用的一種清熱類中藥[3]。黃芩藥材中主要含有黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等有效成分，其中黃芩苷的含量較高，是黃芩發(fā)揮藥效的主要成分之一[4]。藥理學(xué)研究證實(shí)，黃芩苷具有抗微生物、抗病毒、利膽、保肝和解痙等作用[5-7]。

近幾年，通過(guò)對(duì)黃芩苷的相關(guān)生物學(xué)活性進(jìn)行的初步研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)雞MDV無(wú)論在細(xì)胞上還是在雞體內(nèi)都有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)雞體內(nèi)由MDV引起的淋巴組織增生性腫瘤的形成具有抑制作用,并顯著提高了機(jī)體的免疫力。為了深入探討黃芩苷的生物學(xué)活性，擬以雞馬立克氏病為模型，系統(tǒng)研究黃芩苷的抗病毒活性，并進(jìn)一步闡明其作用機(jī)理，為臨床獲取能有效控制病毒所致腫瘤性疾病的黃酮類化合物提供依據(jù)，并為進(jìn)一步實(shí)施人工合成提供研究思路與方法。

本試驗(yàn)選用體外試驗(yàn)中藥黃芩苷對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的安全濃度和生長(zhǎng)的影響，為下一步體外抗病毒試驗(yàn)做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞胚 SPF雞胚，山東育鳳農(nóng)業(yè)科技有限公司提供。

1.1.2 藥品 黃芩苷，黃芩購(gòu)于聊城利民中藥有限公司，采用煎煮法提取黃芩中的黃芩苷，運(yùn)用紫外分光光度法在278 nm處對(duì)黃芩苷的含量進(jìn)行測(cè)定，分析提取次數(shù)、料液比和提取時(shí)間等因素的影響，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝參數(shù)。得出結(jié)果，當(dāng)提取次數(shù)為2次，料液比為1∶25，每次煎煮50 min時(shí)，黃芩苷的提取效果最好，提取率為20.36%。1.1.3 試劑和耗材 胎牛血清、青霉素、鏈霉素、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)培養(yǎng)粉、胰蛋白酶、細(xì)胞凍存液。MTT溶液、二甲基亞砜(DMSO)，其他試劑為分析純?cè)噭?00 mL培養(yǎng)瓶、96孔板、微孔濾膜、細(xì)胞凍存管,泰安聯(lián)星公司。

1.1.4 主要儀器 水浴鍋、倒置顯微鏡、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、天平、CO2培養(yǎng)箱、鼓風(fēng)式電熱干燥箱、超凈臺(tái)、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、超聲波清洗器、酶標(biāo)儀。

1.2 雞胚成纖維細(xì)胞(chick embryo fibroblast，CEF)的制備、培養(yǎng)和保存 雞胚成纖維細(xì)胞的制備按文獻(xiàn)進(jìn)行[8-10]，簡(jiǎn)述如下：選擇9～11日齡照蛋觀察血管粗壯的雞胚于蛋架上，先后消毒氣室部外殼用無(wú)菌眼科鑷子擊破該部位的蛋殼和卵膜，輕輕夾住雞胚頸部取出雞胚，放入無(wú)菌平皿中[11-12]。用滅菌剪刀剪去雞胚頭部、腿部、翅膀和內(nèi)臟，留下軀干組織。用Hanks液沖洗2～3次，除去血液后用滅菌剪刀盡量剪碎(1 mm3小塊),再用Hanks液沖洗2次直至組織發(fā)白為止，然后將洗液上清吸棄。根據(jù)雞胚組織塊的多少加入大約4倍量的胰酶(5～6 mL)，于37 ℃溫箱內(nèi)消化20～30 min，視其組織碎塊變松散(聚合成一團(tuán)、邊緣毛樣模糊)即可。用無(wú)菌紗布過(guò)濾后，2000 rpm 3～5 min離心，將胰蛋白酶去除干凈。加適量DMEM營(yíng)養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹吸數(shù)次，使細(xì)胞分散，制成細(xì)胞懸液。靜置1 min，使未吹散的組織塊沉淀，吸出細(xì)胞懸液分到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶中的營(yíng)養(yǎng)液添至適度。在細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%的單層時(shí)，將培養(yǎng)液倒掉，加入0.25%胰蛋白酶適量進(jìn)行消化，用吸管進(jìn)行吹打，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上吹下來(lái)，計(jì)數(shù)后，2000 r/min離心5 min，棄掉上清培養(yǎng)液，再加入適量細(xì)胞凍存液將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×107個(gè)細(xì)胞/mL，裝入1.5 mL專用細(xì)胞凍存管中，依次從4 ℃放置2 h、-20 ℃放置2 h，-80 ℃過(guò)夜，-180 ℃液氮中保存[13]。

1.3 黃芩苷對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞最大安全濃度的測(cè)定1.3.1 藥物的稀釋 稱取試驗(yàn)藥物1 g溶于50 mL細(xì)胞維持液中，即為0.02 g/mL。吸取試驗(yàn)藥物溶液100 μL至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板第一孔中，然后從第1～10孔，每孔加入100 μL細(xì)胞維持液，再將第1孔內(nèi)液體混勻，吸取100 μL至第2孔內(nèi)，再混勻，吸取100 μL至第三孔內(nèi)，如此反復(fù)至第10孔，則藥物稀釋倍數(shù)分別為21～210。其濃度分別為10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、312.5 μg/mL、156.25 μg/mL、78.13 μg/mL、39.06 μg/mL、19.53 μg/mL[11]。

1.3.2 藥物對(duì)CEF貼壁的影響 CEF原代細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后以105個(gè)/孔濃度接種入96孔培養(yǎng)板上，每孔加入0.1 mL，然后各孔分別加入不同稀釋度的黃芩苷和陽(yáng)性對(duì)照利巴韋林各0.1 mL，每個(gè)稀釋度4孔，并設(shè)置空白細(xì)胞作正常對(duì)照。然后至37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24、48、72 h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，判定藥物對(duì)細(xì)胞貼壁的影響。

1.3.3 藥物對(duì)CEF單層的影響 取細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，密封后，置二氧化碳培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長(zhǎng)成均勻單層后取出，吸出生長(zhǎng)液，加入Hanks液洗1遍，棄去，各孔分別加入各濃度藥物100 μL或細(xì)胞維持液100 μL。每種藥物濃度重復(fù)4孔，同時(shí)設(shè)不加藥物的對(duì)照孔4孔。密封，置37 ℃恒溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24、48、72 h觀察單層細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.3.4 觀察結(jié)果

1.3.4.1 觀察細(xì)胞融合、壞死、脫落、漂浮、死亡等細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE) “-”表示細(xì)胞生長(zhǎng)極差，全部為未貼壁圓細(xì)胞，細(xì)胞破碎、不完整或輪廓不清；“+”表示細(xì)胞生長(zhǎng)很差，基本為圓細(xì)胞，極少貼壁細(xì)胞；“++”表示細(xì)胞生長(zhǎng)較差，未形成單層，有大量圓細(xì)胞和空隙；“+++”表示細(xì)胞生長(zhǎng)一般，未形成單層，有較多空隙和極少圓細(xì)胞；“++++”表示細(xì)胞生長(zhǎng)良好，全部或基本形成完整單層，無(wú)空隙，細(xì)胞折光性強(qiáng)。1.3.4.2 用MTT法觀察黃芩苷不同濃度對(duì)CEF生長(zhǎng)的影響 用PH7.4的Hanks液配制成0.5 mg/mL的溶液(需遮光處理)，將在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)了72 h的96孔板取出，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒置顯微鏡下觀察MTT結(jié)晶狀況，然后棄去上清液，每孔內(nèi)加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀A490 nm下測(cè)定光密度(OD)值，設(shè)置細(xì)胞對(duì)照孔和空白對(duì)照孔。選擇加藥孔的A490值顯著大于或與細(xì)胞對(duì)照孔的A490平均值無(wú)顯著差異的藥物最大濃度作為其最大安全濃度[14-16]。

1.3.4.3 數(shù)據(jù)處理 計(jì)算4孔平均值和標(biāo)準(zhǔn)差， 數(shù)據(jù)以“x±s”表示,用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 應(yīng)用細(xì)胞病變觀察法觀察黃芩苷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.1.1 黃芩苷對(duì)CEF貼壁的影響 對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察，黃芩苷濃度高時(shí)，藥物顏色較深，細(xì)胞生長(zhǎng)極差，全部為未貼壁圓細(xì)胞，并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，部分細(xì)胞開(kāi)始死亡(圖1A)，能夠說(shuō)明黃芩苷對(duì)細(xì)胞有一定毒性。黃芩苷濃度低一些時(shí)，毒性也隨之降低，藥物顏色不影響觀察，細(xì)胞表現(xiàn)為部分貼壁，但大部分還處于未貼壁狀態(tài)(圖1B、圖1C)。當(dāng)黃芩苷濃度降到無(wú)毒濃度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好呈梭形，長(zhǎng)成單層的整個(gè)細(xì)胞面只見(jiàn)到極少數(shù)圓細(xì)胞，折光性強(qiáng)(圖1D)。

2.1.2 黃芩苷對(duì)CEF單層的影響 對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察，黃芩苷濃度高時(shí)，藥物顏色較深，基本觀察不到細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的影響很大(圖2A)。黃芩苷濃度逐漸變低時(shí)，能夠觀察到細(xì)胞，并且有極少貼壁，大部分為圓形細(xì)胞，細(xì)胞間隙較大(圖2B、圖2C)。和黃芩苷對(duì)CEF貼壁的影響相同，它對(duì)細(xì)胞的毒性也具有劑量依賴特性，即毒性隨著藥物濃度的降低而降低，黃芩苷毒性降低很快，在細(xì)胞形態(tài)上可能表現(xiàn)為上一個(gè)濃度細(xì)胞狀態(tài)很差，下一個(gè)濃度細(xì)胞就生長(zhǎng)狀態(tài)很好。在黃芩苷無(wú)毒濃度下，對(duì)細(xì)胞單層沒(méi)有影響，細(xì)胞生長(zhǎng)良好、折光性強(qiáng)(圖2D)。

2.1.3 藥物作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞的毒性作用 對(duì)CEF細(xì)胞貼壁的影響 通過(guò)觀察黃芩苷對(duì)CEF細(xì)胞24、48、72 h貼壁作用的影響，發(fā)現(xiàn)藥物作用具有一定的時(shí)效性，藥效要達(dá)到一定時(shí)間才能發(fā)揮出來(lái)。同一濃度下，48 h的細(xì)胞形態(tài)優(yōu)于24 h的細(xì)胞形態(tài)。但72 h的細(xì)胞形態(tài)和48 h的細(xì)胞形態(tài)基本相同(表1)。

A：濃度為5000 μg/mL的藥物對(duì)CEF的影響，藥物濃度大且有顏色，細(xì)胞生長(zhǎng)較差，破碎不完整或輪廓不清；B：濃度為156.25 μg/mL的藥物對(duì)CEF的影響，細(xì)胞部分貼壁，大多數(shù)為圓細(xì)胞；C：濃度為78.13 μg/mL的藥物對(duì)CEF的影響，細(xì)胞大量貼壁，有少量圓細(xì)胞和空隙；D：正常對(duì)照細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形成了較好的單層。圖1 藥物48 h時(shí)對(duì)CEF細(xì)胞貼壁的影響(100×)

A：濃度為5000 μg/mL的藥物對(duì)單層CEF的影響，藥物濃度大顏色深，對(duì)細(xì)胞觀察有影響；B：濃度為625 μg/mL的藥物對(duì)單層CEF的影響，極少貼壁，大部分為圓細(xì)胞；C：濃度為312 μg/mL的藥物對(duì)單層CEF的影響，細(xì)胞生長(zhǎng)較差，極少貼壁，大部分為圓細(xì)胞，空隙大，死亡細(xì)胞少；D：濃度為78.13 μg/mL的藥物對(duì)單層CEF的影響，細(xì)胞生長(zhǎng)良好、折光性強(qiáng)。圖2 藥物24 h時(shí)對(duì)單層CEF細(xì)胞的影響(100×)

藥物時(shí)間濃度/(μg·mL-1)10000500025001250625312．5156．2578．1339．0619．530黃芩苷24-----++++++++++++++++++48---+++++++++++++++++++++++72---++++++++++++++++++++++++++

++++表示細(xì)胞生長(zhǎng)良好，全部或基本形成完整單層；+++表示細(xì)胞生長(zhǎng)一般，有大量圓形細(xì)胞和空隙；++表示細(xì)胞生長(zhǎng)較差，未形成單層；+表示細(xì)胞基本為圓細(xì)胞，極少貼壁細(xì)胞；-表示細(xì)胞生長(zhǎng)極差，全部為未貼壁圓細(xì)胞。

對(duì)CEF細(xì)胞單層的影響 通過(guò)觀察藥物對(duì)CEF細(xì)胞24、48、72 h影響單層作用的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)藥物對(duì)CEF單層的影響和貼壁的影響相同，也具有時(shí)效依賴性。同一濃度下，24 h的細(xì)胞形態(tài)優(yōu)于48 h的細(xì)胞形態(tài)。但72 h的細(xì)胞形態(tài)和48 h的細(xì)胞形態(tài)基本相同(表2)。

表2 黃芩苷對(duì)CEF單層的影響

++++表示細(xì)胞生長(zhǎng)良好，全部或基本形成完整單層；+++表示細(xì)胞生長(zhǎng)一般，有大量圓形細(xì)胞和空隙；++表示細(xì)胞生長(zhǎng)較差，未形成單層；+表示細(xì)胞基本為圓細(xì)胞，極少貼壁細(xì)胞；-表示細(xì)胞生長(zhǎng)極差，全部為未貼壁圓細(xì)胞。

2.2 MTT法檢測(cè)對(duì)CEF生長(zhǎng)的影響 對(duì)CEF細(xì)胞貼壁的影響,從表3可知，中藥黃芩苷質(zhì)量濃度在625 μg/mL及其更大時(shí)，與細(xì)胞對(duì)照組有顯著差異，質(zhì)量濃度在312.5 μg/mL以及低于這個(gè)濃度時(shí)，與細(xì)胞對(duì)照組無(wú)顯著差異。對(duì)CEF細(xì)胞單層的影響，中藥黃芩苷質(zhì)量濃度在1250 μg/mL及其濃度更高時(shí)，與細(xì)胞對(duì)照組有顯著差異，質(zhì)量濃度在625 μg/mL及其低于此濃度時(shí)，與細(xì)胞對(duì)照組無(wú)顯著差異。

表3 中藥黃芩苷對(duì)CEF貼壁單層生長(zhǎng)(A490)的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母者表示在0.05水平差異顯著。

3 討論與小結(jié)

黃芩苷對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性，無(wú)論是黃芩苷對(duì)CEF細(xì)胞的貼壁，還是單層生長(zhǎng)，對(duì)CEF細(xì)胞的毒性均表現(xiàn)為劑量依賴性，高濃度抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，低濃度對(duì)細(xì)胞不表現(xiàn)毒性。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，藥物在中、低濃度能促進(jìn)CEF細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)，與正常對(duì)照相比，細(xì)胞貼壁和生長(zhǎng)更快，細(xì)胞形態(tài)更好。

無(wú)論是黃芩苷對(duì)CEF細(xì)胞的貼壁，還是單層生長(zhǎng)，藥物對(duì)CEF細(xì)胞的作用都具有時(shí)效性，藥效要達(dá)到一定時(shí)間才發(fā)揮出來(lái)。同一濃度下，48 h的細(xì)胞形態(tài)優(yōu)于24 h的細(xì)胞形態(tài)，但72 h的細(xì)胞形態(tài)和48 h的細(xì)胞形態(tài)基本相同。通過(guò)觀察，發(fā)現(xiàn)黃芩苷對(duì)CEF細(xì)胞貼壁的影響大于對(duì)CEF細(xì)胞單層的影響，可能是由于CEF細(xì)胞長(zhǎng)成單層后對(duì)外界的抵御能力要大于未貼壁的CEF細(xì)胞。

以藥物對(duì)CEF細(xì)胞貼壁和單層均沒(méi)有影響的最低稀釋倍數(shù)，作為藥物對(duì)CEF的最大安全濃度。應(yīng)用MTT法，根據(jù)A490 nm測(cè)定結(jié)果判定中藥對(duì)CEF的安全濃度，選擇A490 nm與對(duì)照差異不顯著的試驗(yàn)組的最高黃芩苷濃度作為安全濃度的上限，綜合貼壁試驗(yàn)、單層試驗(yàn)結(jié)果，能夠看出，黃芩苷的最大安全濃度，即最小稀釋濃度為312.5 μg/mL。應(yīng)用細(xì)胞病變觀察法，綜合貼壁試驗(yàn)、單層試驗(yàn)結(jié)果，可以看出，黃芩苷的最大安全濃度為625 μg/mL。綜合兩種測(cè)定結(jié)果，最終得出黃芩苷對(duì)CEF的最大安全濃度為312.5 μg/mL。

在進(jìn)行黃芩苷對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞的最大安全濃度測(cè)定中，最常用的方法是觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，但此種方法有一定的主觀性，且不能進(jìn)行精確的定量分析。MTT比色法簡(jiǎn)單直觀，與CPE法相結(jié)合可準(zhǔn)確測(cè)定黃芩苷對(duì)CEF的最大安全濃度。本試驗(yàn)結(jié)合兩種方法，提高了試驗(yàn)的準(zhǔn)確度，結(jié)果表明，黃芩苷對(duì)CEF的最大安全濃度為312.5 μg/mL，低于最大安全濃度時(shí)，黃芩苷能促進(jìn)CEF的貼壁及生長(zhǎng)。

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(編輯：陳希)

Effect of Baicalin on Safety Concentrations and Growth of Chicken Embryo Fibroblast

DING Chan，CHU Xiu-ling*，SU Jian-qing

(AgriculturalCollegeofLiaochengUniversity,Shandong,Liaocheng252059，China)

The cell culture of Chinese herbs skullcap active ingredients baicalin on chick embryo growth of fibroblasts (CEF)invitro. Cytopathic observation (CPE) to investigate the effects of baicalin on CEF cell growth, and the use of tetrazolium blue (MTT) colorimetric assay of baicalin on chick embryo fibroblasts maximum safe concentration, the concentration of baicalin at 312.5 μg/mL is the maximum safe concentration, below which the concentration of baicalin can promote the growth of CEF and adherent cells grew well, fusiform, strong refraction. Baicalin in low concentration could promote CEF cell adherence and growth and the role of CEF cells for both time-sensitive applications cytopathic observation and MTT assay, the final results of baicalin maximum safe concentration of CEF for 312.5 μg/mL.

baicalin; CEF cells; safe concentration

山東省自然科學(xué)基金(ZR2013CL010)

丁嬋，碩士研究生，從事動(dòng)物疫病發(fā)生機(jī)理及防控方向研究。

褚秀玲。E-mail：chuxiul@163.com

2016-09-05

A

1002-1280 (2017) 01-0035-06

S853.74