郭禮強(qiáng), 張金玲, 李凱, 丁葵英, 吳翠玲

(1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041；2. 安捷倫科技(中國(guó))有限公司，北京 100102)

HPLC-MS/MS法測(cè)定飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量

郭禮強(qiáng)1, 張金玲1, 李凱1, 丁葵英1, 吳翠玲2

(1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濰坊 261041；2. 安捷倫科技(中國(guó))有限公司，北京 100102)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)快速測(cè)定飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑的含量。飼料樣品用乙酸乙酯提取后，經(jīng)PCX固相萃取柱凈化處理，過(guò)0.22 μm濾膜，以乙腈和含0.1%的甲酸水溶液為流動(dòng)相，經(jīng)Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)分離，多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)正離子模式下掃描分析。結(jié)果表明，甲硝唑和二甲硝咪唑在0.2～50 μg/L范圍呈良好線性，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.997，檢出限均為0.2 μg/kg，定量下限均為0.5 μg/kg。樣品在定量下限1倍、2倍、10倍3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為95.3%～103.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.67%～8.46%。該方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑的檢測(cè)分析。

飼料；含量分析；甲硝唑；二甲硝咪唑；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

硝基咪唑類(lèi)藥物(nitromidazoles)是一類(lèi)廣泛應(yīng)用的人工合成的具有5-硝基咪唑基本結(jié)構(gòu)的抗菌、抗原蟲(chóng)藥物，甲硝唑(metronidazole)和二甲硝咪唑(dimetridazole)為硝基咪唑類(lèi)藥物的兩種，對(duì)原蟲(chóng)及各種厭氧細(xì)菌具有顯著抑制作用，也用作生長(zhǎng)促進(jìn)劑，以促進(jìn)牛、豬、禽的生長(zhǎng)及改善飼料轉(zhuǎn)化率。然而，甲硝唑和二甲硝咪唑?qū)θ梭w有多種毒副作用，尤其是具有致突變和致癌性。歐盟在96/23/EC歐盟理事會(huì)指令及EC2377/90[1]中將其列入A類(lèi)禁用藥，日本也將二甲硝咪唑列入肯定列表制度，屬于15種農(nóng)業(yè)化學(xué)品中的一種，不得在任何食品中檢出。為防止二甲硝咪唑等致癌藥物在食源性動(dòng)物殘留對(duì)人體健康產(chǎn)生危害，我國(guó)也于2002年禁用了該類(lèi)藥物[2]。甲硝唑和二甲硝咪唑的檢測(cè)方法有氣相色譜法[3-4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5-6]、液相色譜法[7-11]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-17]，氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法的缺點(diǎn)是需要衍生化，液相色譜法的選擇性和靈敏度較差，具有高特異性和靈敏度的液相色譜-質(zhì)譜法是目前檢測(cè)硝基咪唑類(lèi)藥物含量的首選方法。由于監(jiān)管的滯后和經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，硝基咪唑類(lèi)藥物經(jīng)常被用于動(dòng)物飼料和動(dòng)物疫病防治過(guò)程，因此建立飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量的分析方法，增加了檢驗(yàn)檢疫行政執(zhí)法的手段。飼料成分復(fù)雜，尤其是預(yù)混料，粉塵顆粒較多，若凈化效果不好將嚴(yán)重影響結(jié)果的判斷，本文應(yīng)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)飼料中的甲硝唑和二甲硝咪唑藥物，該方法具有快速高效、高通量、高靈敏度等特點(diǎn)，為從源頭上對(duì)動(dòng)物飼料的監(jiān)控提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1260-6460(美國(guó)Agilent公司)，配電噴霧離子源(ESI)；離心機(jī)：5810R型(Eppendorf公司)；氮吹儀：N-EVAP(Organomation Associates公司)；純水機(jī)：Milli-Q(美國(guó)Millipore公司)；萬(wàn)分之一天平(Mettler AE163)；振蕩器(IKA MS1)；5 mL一次性注射器；0.22 μm針頭過(guò)濾器；混合型陽(yáng)離子交換柱：60 mg/3 mL(Agela公司)。

甲硝唑、二甲硝咪唑和氘代二甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。甲醇、乙酸乙酯、乙腈和甲酸均為色譜純，美國(guó)Biopure公司； 鹽酸和氨水為分析純，天津科密歐公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別配制甲硝唑、二甲硝咪唑和氘代二甲硝咪唑終濃度濃度均為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0～4 ℃冰箱中保存。定容液：取80 mL 0.1% 的甲酸水(V/V)，與20 mL乙腈混勻。

1.2 樣品處理 稱(chēng)取5.0 g(預(yù)混合飼料2.0 g)樣品，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL(預(yù)混合飼料加40 μL)，加入15 mL乙酸乙酯均質(zhì)提取1 min，10000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入50 mL聚丙烯離心管，殘?jiān)俅斡?5 mL乙酸乙酯渦混重復(fù)提取，合并提取液，氮?dú)獯蹈?，?.1 mol/L鹽酸25 mL溶解，濾紙過(guò)濾。依次用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L鹽酸活化陽(yáng)離子交換柱，將上述溶解液全部過(guò)柱，依次用5 mL 0.1 mol/L鹽酸，5 mL甲醇淋洗， 6 mL洗脫溶液洗脫并收集，在40 ℃水浴上氮?dú)獯蹈?，?1 mL 初始流動(dòng)相溶液渦旋溶解，過(guò)0.22 μm濾膜，供質(zhì)譜測(cè)定。

1.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相A：甲酸水(1:999,V/V)溶液；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0 min 20%流動(dòng)相B；3.0 min 40%流動(dòng)相B；4.0 min 90%流動(dòng)相B；4.1 min 20%流動(dòng)相B；6.0 min 20%流動(dòng)相B。進(jìn)樣體積20 μL。柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件 大氣壓電噴霧電離源(ESI)，正離子電離模式；干燥氣：10 L/min ；干燥溫度：350 ℃；噴霧氣：45 psi ；電子倍增器電壓：400 V；毛細(xì)管電壓：4000 V；霧化氣壓力：275.8 kPa(40 psi)；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；甲硝唑和二甲硝咪唑的部分質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 甲硝唑和二甲硝咪唑的部分質(zhì)譜參數(shù)

*定量離子

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系、檢出限與定量下限 對(duì)兩種目標(biāo)分析物質(zhì)量濃度在0.20～50 μg/L之間的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以各化合物定量離子與內(nèi)標(biāo)校正離子峰面積之比的平均值(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度 (X，μg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.997。在飼料中添加系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以信噪比(S/N)為3作為方法的檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)為10作為方法的定量下限(LOQ)，甲硝唑和二甲硝咪唑的LOD為0.20 μg/kg，LOQ分別為0.50 μg/kg。兩種目標(biāo)分析物的提取離子流圖見(jiàn)圖1，回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量下限見(jiàn)表2。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.5 μg/L)中甲硝唑和二甲硝咪唑的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖

化合物回歸方程相關(guān)系數(shù)(r)線性范圍/(μg·L-1)檢出限/(μg·kg-1)定量下限/(μg·kg-1)甲硝唑Y=0．335365X+0．1371720．99790．20～50．00．200．50二甲硝咪唑Y=0．486102X-0．48450．99830．20～50．00．200．50

2.2 準(zhǔn)確度與精密度 在牛預(yù)混料空白樣品中添加甲硝唑和二甲硝咪唑定量下限1倍、2倍、10倍3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。以回收率結(jié)果表示方法準(zhǔn)確度，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示方法的精密度，每個(gè)水平平行測(cè)定6個(gè)樣品，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，甲硝唑和二甲硝咪唑在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率分別為95.3%～103.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.67%～8.46%。

表3 檢測(cè)方法的添加精密度和平均回收率(n=6)

2.3 實(shí)際樣品的測(cè)定 對(duì)市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的20份飼料中的甲硝唑和二甲硝咪唑進(jìn)行測(cè)定，在1份雞預(yù)混飼料樣品中檢出了二甲硝咪唑(3.1 μg/kg)，說(shuō)明仍存在企業(yè)違法添加禁用硝基咪唑類(lèi)抗菌藥物。

3 討論與小結(jié)

3.1 樣品提取條件的優(yōu)化 飼料基質(zhì)復(fù)雜，不同的提取溶劑對(duì)回收率的影響很大。本文考察了甲醇[10,17]、乙腈[12,14]、乙酸乙酯[4,15,18]作為提取劑對(duì)甲硝唑和二甲硝咪唑回收率的影響，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用甲醇、乙醇、乙腈作為提取劑用于飼料樣品的提取，會(huì)產(chǎn)生非常多的干擾雜質(zhì)，即使采用陽(yáng)離子固相萃取柱凈化也非常困難，抑制了目標(biāo)分析物的靈敏度和回收率，而使用乙酸乙酯作為提取溶劑，可以顯著降低飼料中的基質(zhì)干擾。試驗(yàn)進(jìn)一步比較了飼料加水浸潤(rùn)后添加標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)乙酸乙酯提取和飼料直接添加標(biāo)準(zhǔn)品后經(jīng)乙酸乙酯提取對(duì)回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼料經(jīng)水浸泡后經(jīng)乙酸乙酯提取，提取回收率反而降低，說(shuō)明飼料浸潤(rùn)提取的雜質(zhì)更多，不利于目標(biāo)分析物的檢測(cè)。試驗(yàn)同時(shí)考察了酸性乙酸乙酯溶液對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，在飼料基質(zhì)中添加15 mL乙酸乙酯后，再加入0.1 mol/L 鹽酸1 mL，結(jié)果發(fā)現(xiàn)回收率非常低，分析后認(rèn)為在震蕩提取的過(guò)程中鹽酸和目標(biāo)分析物結(jié)合，造成大部分目標(biāo)物保留在水相中。飼料浸潤(rùn)和提取酸化反而抑制了目標(biāo)分析物的回收率，最終確定只用乙酸乙酯作為提取溶劑。

3.2 樣品凈化條件的優(yōu)化 乙酸乙酯提取液中依然含有一定量極性的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂肪和色素等脂溶性物質(zhì)，尤其是牛預(yù)混料，提取液顏色為棕紅色，對(duì)甲硝唑和二甲硝咪唑有一定的干擾。為提高方法的靈敏度和通用性，采用固相萃取進(jìn)一步凈化樣品?？疾炝薓CX、PCX、WCX三種凈化柱對(duì)目標(biāo)物回收率和穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)MCX和PCX凈化柱回收率分別為85.2%和84.1%，要好于WCX凈化柱，因MCX和PCX凈化柱回收率差異不明顯，從性?xún)r(jià)比考慮最終選用PCX凈化柱。乙酸乙酯屬于中等極性化合物，若直接將乙酸乙酯提取液過(guò)PCX凈化柱，降低了PCX凈化柱吸附目標(biāo)物，影響回收率；凈化效果差，依然有一些色素殘留，干擾目標(biāo)物分析。為提高方法的回收率和靈敏度，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了甲酸、乙酸和鹽酸溶解目標(biāo)物經(jīng)PCX柱凈化對(duì)回收率的影響。提取液經(jīng)氮?dú)獯蹈?，分別用0.1 mol/L 的甲酸、乙酸和鹽酸溶解，經(jīng)PCX柱凈化后經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三種酸性溶液均能將目標(biāo)物回收率提高到80%以上，但鹽酸質(zhì)譜噪音低，靈敏度比甲酸和乙酸高20%以上，最終選用鹽酸溶液溶解。預(yù)混料粉塵多，乙酸乙酯殘?jiān)名}酸溶液溶解后上柱，粉塵會(huì)堵塞固相萃取柱，過(guò)濾速度慢，通過(guò)試驗(yàn)嘗試，上柱前先將溶解液濾紙過(guò)濾，能夠很好解決上柱慢的問(wèn)題。

3.3 定量方法的選擇 研究發(fā)現(xiàn)，不同飼料樣品對(duì)甲硝唑和二甲硝咪唑的吸附有一定的差異，如雞預(yù)混料粉塵顆粒較多，對(duì)目標(biāo)分析物吸附要比雞濃縮料和雞全價(jià)料高，造成提取回收率偏低，因此在定量方法選擇時(shí)采用內(nèi)標(biāo)法定量，可以有效的消除不同飼料基質(zhì)帶來(lái)的干擾，本方法采用氘代二甲硝咪唑作為甲硝唑和二甲硝咪唑的內(nèi)標(biāo)，提高了定量方法的準(zhǔn)確度。

3.4 色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化 分別配制500 μg/L的甲硝唑和二甲硝咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，選用正離子模式掃描，優(yōu)化各化合物的毛細(xì)管電壓和碰撞能量，以響應(yīng)值最高的兩個(gè)碎片離子和母離子組成定量離子對(duì)和定性離子對(duì)，并進(jìn)行MRM參數(shù)的優(yōu)化。比較了甲醇和乙腈作為流動(dòng)相對(duì)甲硝唑和二甲硝咪唑的影響，發(fā)現(xiàn)使用乙腈為流動(dòng)相兩種目標(biāo)物的MRM的提取離子流圖峰型較好，保留時(shí)間穩(wěn)定。

本文建立了飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的檢測(cè)方法。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可以滿(mǎn)足復(fù)雜飼料中甲硝唑和二甲硝咪唑含量的檢測(cè)要求。

[1] EEC2377/90關(guān)于確定動(dòng)物源性食品中獸藥制品最高殘留限量程序的規(guī)定,國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. 歐盟食品衛(wèi)生法規(guī)匯編[M]. 青島:中國(guó)海洋大學(xué)出版社, 2003：819.

[2] 農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第193號(hào)[S].

[3] 賈斌, 馮書(shū)惠, 王鐵良, 等. 氣相色譜法測(cè)定飼料中二甲硝咪唑方法的研究[J]. 飼料博覽, 2007,7:31-32.

[4] 劉波，黃為紅，王金中. 氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定硝基咪唑類(lèi)藥物[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào), 2008，24(5)：586-588.

[5] 傅哲, 彭智, 肖志勇. 氣相色譜法測(cè)定動(dòng)物血中甲硝唑濃度及藥動(dòng)學(xué)研究[J]. 長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院, 2010，12:5-9.

[6] 汪紀(jì)倉(cāng), 馬素英, 王大菊, 等. 氣相色譜-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定豬肌肉中硝基咪唑類(lèi)藥物殘留量[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2008, 39(12):1772-1778.

[7] 李玉文, 田穎, 孫曉偉. 高效液相色譜法測(cè)定飼料中二甲硝咪唑[J]. 飼料工業(yè), 2001, 22(6): 37.

[8] 戴華, 李擁軍, 袁智能, 等. 豬飼料中甲硝唑、二甲硝咪唑藥物含量的HPLC法測(cè)定[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室, 2004, 21(2):313-316.

[9] 胡海燕, 徐倩, 孫雷. 雞肉組織中硝基咪唑類(lèi)藥物及代謝物多殘留檢測(cè)高效液相色譜法研究[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2008, 42(8):9-12.

[10]馮學(xué)忠, 黎華鵬, 盤(pán)苑芷, 等. HPLC同時(shí)測(cè)定復(fù)方二甲硝咪唑可溶性粉中地美硝唑、甲氧芐啶、磺胺對(duì)甲氧嘧啶的含量[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 32(7):55-60.

[11]秦松, 張蓓. RP-HPLC法測(cè)定人工牛黃甲硝唑膠囊中甲硝唑的溶出度[J]. 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué), 2015, 5(21): 48-53.

[12]郭少飛, 王鵬, 荊濤林，等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中甲硝唑、二甲硝咪唑和洛硝噠唑殘留[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2008, 37(6): 830-833.

[13]劉永明, 曹彥忠, 李金, 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定蜂蜜中3種硝基咪唑類(lèi)藥物殘留[J]. 色譜, 2010, 28(6): 596-600.

[14]徐娟, 陳捷, 邵琳智, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)口腔衛(wèi)生用品中的硝基咪唑類(lèi)藥物[J]. 色譜, 2011, 29(5): 450-453.

[15]張鴻偉, 簡(jiǎn)慧敏, 林黎明, 等. 液相色譜-四極桿/離子阱質(zhì)譜快速測(cè)定蜂蜜中痕量硝基咪唑類(lèi)藥物及其代謝物殘留[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2012, 31(7): 763-770.

[16]班付國(guó), 胡興娟, 吳寧鵬, 等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中66種獸藥殘留的研究[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2014, 48(6):40-51.

[17]郭菁, 丁立平, 吳文凡, 等. 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中硝基咪唑類(lèi)化合物及其代謝物殘留[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2015, 34(1): 28-34.

[18]GB/T 21995-2008. 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn). 飼料中硝基咪唑類(lèi)藥物的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]．

(編輯：侯向輝)

Determination of Metronidazole and Dimetridazole in Feed by High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

GUO Li-qiang1, ZHANG Jing-lin1, LI Kai1, DING Kui-ying1, WU Cui-ling2

(1.WeifangEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Weifang，Shandong261041,China； 2.AgilenttechnologiesCo.,LtdinChina,Beijing100102,China)

A method for the determination of metronidazole and dimetridazole in feed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) is presented. The sample were purified with solid phase extraction column of PCX after extraction by ethyl acetate. After filtered with a 0.22 μm membrane, the sample was separated on a eclipse plus C18 column(3.0 mm × 100 mm, 1.8 μm)using gradient elution with mobile phases of acetonitrile and aqueous solution containing 0.1% formic acid, and detected on positive electrospray ionization with a multiple reaction monitoring (MRM) as survey scan. The results showed that the calibration curves were linear in the range of 0.2～50 μg/L for metronidazole and dimetridazole with correlation coefficient (r) more than 0.997. The LODs for metronidazole and dimetridazole was 0.2 μg/kg and the LOQs was 0.5 μg/kg. The average recoveries (n=6) in feed samples at three spiked levels(1 tismes, 2 times, 10 times) ranged from 95.3% to 103.2% with relative standard deviations (RSDs) of 4.67 - 8.46%. The method was sensitive, convenient and accurate, and could satisfy the demand of detection and analysis of metronidazole and dimetridazole in feed.

feed; content analysis; metronidazole；dimetridazole；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

濰坊市2015年科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(2015ZJ1101)；山東出入境檢驗(yàn)檢疫局科研基金項(xiàng)目(SK201349)

郭禮強(qiáng)，碩士，工程師，從事農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)研究。E-mail：glq1980@sina.com

2016-08-19

A

1002-1280 (2017) 01-0052-05

S859.83