鄭玉芳，陶永艷，楊代澤，楊春艷，吳雨涵，陳培富**

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201；2.云南省耿馬縣耿馬鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)中心，云南臨滄 677500； 3. 楚雄州動物疫病預防控制中心，云南楚雄 675000)

滇南某豬群致死性呼吸道傳染病的病原學診斷

鄭玉芳1，陶永艷2，楊代澤1，楊春艷3，吳雨涵1，陳培富1**

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201；2.云南省耿馬縣耿馬鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)中心，云南臨滄 677500； 3. 楚雄州動物疫病預防控制中心，云南楚雄 675000)

近期紅河州某規(guī)?；B(yǎng)豬場在引種后，發(fā)生以發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難、瀕死前鼻孔出血為特征的仔豬傳染病，嘗試用多種藥物治療均不能有效控制病情，死亡率很高。為調(diào)查該病病因，本試驗對采集自病死豬只的肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結，取病料組織劃線于血瓊脂平板培養(yǎng)，對形成的溶血性菌落采用高鹽培養(yǎng)、革蘭染色、生化試驗做初步鑒定，同時使用細菌16S rRNA基因通用引物擴增該菌株DNA片段，瓊脂糖凝膠電泳回收擴增產(chǎn)物，經(jīng)TA克隆后測序分析；取病料組織研磨上清，應用PCR技術擴增病原核酸，以類似方法分析核酸序列。結果發(fā)現(xiàn)，該溶血性菌株為革蘭染色陽性球菌，葡萄糖、蔗糖、木糖、山梨醇和6.5% NaCl利用試驗呈陽性，麥芽糖、棉籽糖、蕈糖、七葉苷、水楊苷、VP、 PYR、硝酸鹽和觸酶試驗均呈陰性，PCR擴增出1542 bp的特異性條帶，其基因序列與脲氣球菌同源性最高(94%)；應用PCR技術從病料中分別直接擴增出豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)421 bp和支原體267 bp的特異性條帶，前者為高致病性PRRSV毒株特有核酸片段，后者與豬鼻支原體(MHR)SK76菌株的DNA同源性達99%。試驗結果表明，該豬群發(fā)生以高致病性PRRSV感染為主、伴有豬鼻支原體和類脲氣球菌混合感染的急性傳染病，提示必須高度重視引種攜帶PRRSV的風險。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬鼻支原體；類脲氣球菌；混合感染；PCR

近年來，急性呼吸道疾病已成為嚴重危害豬群健康和制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一類疾病。規(guī)?；B(yǎng)豬場常見的呼吸道疾病有豬繁殖與呼吸綜合征、豬傳染性胸膜肺炎、副豬嗜血桿菌病、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、豬流行性感冒、豬支原體感染等。呼吸道疾病的混合感染在現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中也是常見現(xiàn)象，混合感染比單一的病毒或者細菌感染導致的病情更加嚴重[1]，給飼養(yǎng)人員和獸醫(yī)在診斷和防治疾病方面帶來巨大的困擾和挑戰(zhàn)[2]。2015年秋季，紅河洲某規(guī)?；B(yǎng)豬場暴發(fā)一起急性呼吸道傳染病，經(jīng)應用多種藥物治療，均不能控制病情，其病因值得調(diào)查。本試驗根據(jù)該豬場病豬癥狀，懷疑為豬繁殖與呼吸綜合征與細菌混合感染所致，隨后進行病原菌的分離培養(yǎng)與鑒定，并應用PCR技術檢測病原體核酸，以期做出確診。

1 材料與方法

1.1 材料 病料采集自紅河自治州某規(guī)?；B(yǎng)豬場的2頭病死豬，包括豬肺臟、脾臟、淋巴結和腎臟。病豬有發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難、瀕死前鼻孔出血等臨床癥狀，用β內(nèi)酰胺類治療無效，磺胺類、替米考星等抗菌藥物的療效不佳。到采集病料時，發(fā)病的120頭仔豬中僅剩下數(shù)頭尚未死亡。對病死豬做病例剖檢，可見肺臟呈蝦肉樣病變，并與胸膜粘連，胸腔有積液，肝臟有腫塊。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng)與鑒定 取病死豬脾臟，以接種環(huán)觸碰橫切面，劃線于綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜。觀察菌落形態(tài)，挑取具有溶血能力的單菌落轉種至新培養(yǎng)基，確保獲得純培養(yǎng)物后，做液體擴大培養(yǎng)，取部分菌液加入50%滅菌甘油混勻，-20 ℃保存，隨后取少許剩余菌液，按照常規(guī)步驟進行革蘭染色，鏡檢細菌個體形態(tài)。

取250 μL菌液均勻涂布于高鹽瓊脂培養(yǎng)基，或從單菌落蘸取少許細菌劃線接種于該瓊脂培養(yǎng)基，然后置于37 ℃溫箱中過夜培養(yǎng)，觀察細菌在高鹽環(huán)境下的生長情況。

用接種環(huán)挑取菌液分別接種于葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、山梨醇、棉籽糖、VP管、木糖、硝酸鹽、七葉苷、6.5% NaCl、吡咯烷酮(PYR)、蕈糖、水楊苷等13種生化發(fā)酵管，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察顏色變化和氣泡產(chǎn)生情況。觸酶試驗在潔凈玻片完成，受試樣滴加3% H2O2溶液1滴，以滴加生理鹽水1滴作為對照。

為對分離菌株的16S rRNA基因進行克隆與分析，取菌液500 μL用超聲波快速破碎，從中取2 μL細菌裂解物作為模板，加入細菌16S rRNA通用引物(上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物：5′-GGCTGGATCACCTCCTT-3′[3])各1 μL，加入Mix 23 μL及ddH2O 23 μL，按95 ℃預變性5 min，94 ℃變性50 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，進行PCR擴增，共循環(huán)35次，72 ℃充分延伸10 min。取擴增產(chǎn)物做1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查是否產(chǎn)生符合預期大小的單一條帶。依照所購試劑盒說明書，割膠并回收PCR產(chǎn)物，以pMD-19T為核酸載體進行TA克隆，隨后按常規(guī)方法轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，取100～300 μL涂布平板(AMP/IPTG/X-Gal陽性)，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落轉種至含AMP的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖動培養(yǎng)，送專業(yè)公司做DNA測序，所獲核酸序列做在線比對分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

1.2.2 PRRSV核酸片段的RT-PCR擴增 在無菌條件下，取少許混合病料放入研磨器，研磨后取上清液1.5 mL，6700 g離心3 min。應用Trizol試劑提取組織總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。取2 μL RNA作為模板，按照PrimeScriptTMII試劑盒(大連寶生物公司產(chǎn)品)方法，使用隨機六聚體寡核苷酸引物進行反轉錄合成第一鏈cDNA，隨后取反轉錄產(chǎn)物做PCR擴增。PRRSV上游引物為5′-ATGGGCGACAATGTCCCTAAC-3′，下游引物為5′-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG-3′，參照浙江省高致病性藍耳病診斷地方標準合成。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共循環(huán)35次，72 ℃充分延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產(chǎn)物，若有必要，進一步測定其核酸序列。

1.2.3 支原體基因片段的PCR擴增及測序分析取2 μL組織研磨上清作為模板直接進行PCR擴增，具體方法與步驟1.2.2類似，但退火溫度設置為55 ℃。所用支原體上游引物：5′-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3′，下游引物：

5′-GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT-3′[4]。瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產(chǎn)物，回收目的條帶并做TA克隆、轉化和測序分析。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征、生化特性和16S rRNA基因特性 病料劃線接種于血瓊脂平板，形成大量散在的溶血性菌落，轉種后仍形成凸起、白色、圓形、光滑的β溶血菌落(圖1A)，在高鹽培養(yǎng)基上也形成白色菌落(圖略)，在LB液體培養(yǎng)基中呈渾濁狀生長(圖1B)；在光學顯微鏡下可見成片狀或成雙排列的革蘭陽性球菌(圖1C)。該菌株分解葡萄糖、蔗糖、木糖、山梨醇，可耐受6.5% NaCl，不分解麥芽糖、棉籽糖、蕈糖、七葉苷、水楊苷、VP和PYR，不還原硝酸鹽，觸酶試驗為陰性。該菌株16S rRNA基因擴增產(chǎn)物呈單一條帶，經(jīng)測序確認該擴增片段長度為1542 bp(圖2)。BLAST結果顯示與該分離株16S rRNA基因片段同源性最高的細菌為脲氣球菌(94%)，但未達到通常判定為同一個種的標準(97%以上的同源性)。

2.2 病料PRRSV基因RT-PCR擴增結果 瓊脂糖凝膠電泳顯示特異性擴增產(chǎn)物大小接近400 bp(圖3)，隨后經(jīng)對PCR擴增產(chǎn)物測序證實為421 bp，即與高致病性PRRSV毒株特有的核酸片段相符，而非美洲型PRRSV毒株具有的511 bp。

A. 菌落形態(tài)(血瓊脂)；B. 液體培養(yǎng)(LB培養(yǎng)基)；C. 革蘭染色(1000×)圖1 分離菌株的形態(tài)特征

M．DL 2000 DNA參照物；1．16S rRNA基因PCR擴增產(chǎn)物(1542 bp)圖2 分離菌株16SrRNA 基因PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢查

2.3 病料支原體的PCR擴增與基因序列分析結果 瓊脂糖凝膠電泳顯示擴增產(chǎn)物特異，對其克隆測序發(fā)現(xiàn)大小為267 bp(圖4)，核酸序列與豬鼻支原體的同源性達99%。

M．DL1000 DNA參照物；1．PRRSV的RT-PCR擴增產(chǎn)物(421 bp)圖3 PRRSV的RT-PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢查

3 討論與結論

當前，豬呼吸道疾病以PRRSV引起的豬繁殖與呼吸綜合征最為嚴重，臨床可見發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎、弱仔以及仔豬的呼吸道癥狀[5]。近年來云南省豬藍耳病的發(fā)病率也明顯呈上升趨勢[6]，本次試驗從采集自滇南某規(guī)模化養(yǎng)豬場病料中直接擴增出高致病性PRRSV特有核酸片段。與經(jīng)典PRRSV相比，高致病性PRRSV對豬的致病性更強，可引起所有日齡豬發(fā)病和死亡，這應該是導致該豬場死亡率高的主要原因。PRRSV專門感染豬單核-巨噬細胞，能夠導致免疫抑制，易使豬出現(xiàn)繼發(fā)感染，常伴發(fā)細菌感染是其一大特征[7-9]，這些病原菌可能是副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎防線桿菌、鏈球菌、豬肺炎支原體等。本試驗應用PCR技術，從所采集病料中直接擴增出支原體特異性核酸片段，經(jīng)測序分析為豬鼻支原體(MHR)。MHR是引起豬漿膜炎、肺炎、關節(jié)炎、中耳炎等疾病的主要病原體，會造成嚴重的豬呼吸道綜合征，導致斷奶仔豬的死亡率增加[10]。2006年我國臺灣學者Lin等[11]報道，豬鼻支原體是引起豬地方性肺炎(SEP)的主要病原之一，是豬呼吸道疾病的第2位病原體[12]。本試驗成功鑒定出豬鼻支原體，支持該豬場至少存在PRRSV與支原體混合感染的前期臨床診斷結果。MHR與PRRSV的混合感染會加重豬的肺炎[13-15]，使得豬群臨床發(fā)病情況變的尤為復雜，這也是該豬場的主要病因所在。

M．DL1000 DNA參照物；1．支原體PCR擴增產(chǎn)物(267 bp)圖4 支原體PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳檢查

通常，肺臟蝦肉樣病變被視為肺炎支原體(MHP)引起的豬氣喘病特征性病變，但本試驗從病料中并未檢出肺炎支原體，而是檢測到豬鼻支原體，提示除豬肺炎支原體外，豬鼻支原體目前已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的又一重要因素。有研究表明，目前PRRSV與MHR的混合感染率要高于其與MHP的混合感染。而且在某種程度上支原體的感染應該能夠促進PRRSV的感染和傳播。隨著豬群的集約化、規(guī)模化飼養(yǎng)模式發(fā)展，多病原混合感染日趨嚴重，這一點必須引起我們的高度重視。

本試驗從病死豬脾臟中直接分離培養(yǎng)出具有溶血能力的細菌，隨后通過16S rRNA基因分析將其鑒定為類脲氣球菌。由于溶血性是致病菌常見的一個重要特性，本試驗所獲類脲氣球菌可能是一種新的豬源致病菌或機會致病菌，相關細節(jié)方面有待深入研究。關于脲氣球菌致病性的研究甚少，這類細菌主要源于尿液，會導致人尿道炎和心內(nèi)膜炎[16]。對該養(yǎng)豬場走訪發(fā)現(xiàn)，糞便清理和日常消毒工作不夠完善，在PRRSV引起免疫抑制的情況下，出現(xiàn)這類細菌的感染完全是有可能的。

回顧此次被調(diào)查豬場發(fā)生疫病的過程，得知該豬場在從昆明引入一批種豬前，其自繁自養(yǎng)的豬群來自廣西，且未發(fā)生過類似嚴重疾病，提示引起該次疫病的高致病性PRRSV毒株由昆明引入的種豬攜帶。另發(fā)現(xiàn)，這次疫病中成年豬患病率低，可能是之前接種過相應疫苗，僅表現(xiàn)為病毒攜帶者。遺憾的是，目前尚無有效區(qū)別自然感染PRRSV和接種PRRSV減毒疫苗的血清學方法。建議該養(yǎng)殖場淘汰整個豬群，經(jīng)過休養(yǎng)期后，在再次引進豬只或種豬時，做嚴格的隔離飼養(yǎng)和檢疫，針對不同來源或年齡階段的豬群，應由專門的飼養(yǎng)員分別負責、獨立管理，并保持足夠的圈舍間距，或在被引進種豬群中放入數(shù)頭未人工免疫過的健康仔豬作為“哨兵”動物，混養(yǎng)1～2周，觀察無任何傳染病發(fā)生，即確保種豬健康后，再正式合群。

試驗結果表明，該豬群發(fā)生以引種攜帶的高致病性PRRSV毒株感染為主、伴有豬鼻支原體和類脲氣球菌混合感染的急性傳染病。

[1] 趙偉，陳連華，孫雅紅，等. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染機理及其研究進展[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2008, 35(10): 96-97.

[2] 舒相華，李錫萍，尹革芬，等. 一起豬繁殖與呼吸綜合征、豬傳染性胸膜肺炎、副豬嗜血桿菌病混合感染的診斷[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015，18：132.

[3] Weisburg W G, Barns S M, Pelletier D A,etal. 16 S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study[J]. Journal of Bacteriology, 1991, 173 (2): 697-703.

[4] Young L, Sung J, Stacey G,etal. Detection ofMycoplasmain cell cultures [J]. Nature Protocols, 2010, 5(5): 930.

[5] Wu W H, Fang Y, Farwell R,etal. A 10-kD a structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded by ORF2b [J]. Virology, 2001, 287(1): 183.

[6] 王釗哲，楊亮宇，舒相華，等. 云南省部分規(guī)?；i場豬繁殖與呼吸障礙綜合征流行病學調(diào)查[A]. 第五屆云南省科協(xié)學術年會暨烏蒙山片區(qū)發(fā)展論壇論文集[C].云南省科學技術協(xié)會、昭通市人民政府,2015:4.

[7] 趙坤，張宏，李敬璽，等. PRRSV和PCV-2感染引發(fā)豬免疫抑制的機理及對策[J]. 河南科技學院學報(自然科學版)，2006, 34(4):25-26.

[8] 舒相華，尹革芬，李文貴，等. 云南地區(qū)部分豬場豬呼吸道疾病綜合征致病病毒感染的流行病學調(diào)查[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2010, 42(5):5.

[9] 戴杰. 豬繁殖與呼吸綜合癥病毒引發(fā)的免疫抑制[J]. 內(nèi)蒙古畜牧科學，2002, 23(4):15-18.

[10]危艷武，張志慧，黃立平，等. 豬鼻支原體的分離鑒定及其對巴馬豬的致病性試驗[J]. 中國獸醫(yī)科學，2014, (3):3.

[11]Lin J H, Chen S P, Yeh K S,etal.MycoplasmahyorhinisinTaiwan: diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen [J]. Vet Microbiol, 2006, 15(1-3): 111.

[12]金升藻. 豬支原體肺炎的診斷與綜合防治[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008, (3):52-53.

[13]Kobayashi H, Morozumi T, Miyamoto C,etal.Mycoplasmahyorhinisinfection levels in lungs of piglets with porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRSV) [J]. Vet Med Sci, 1996, 58(2): 109.

[14]Kawashima K, Katsuda K, Tsunemitsu H. Epidemiological investigation of the prevalence and features of post-weaning multisystemic wasting syndrome in Japan [J]. J Vet Diagn Invest, 2007, 19(1): 60.

[15]Tanawongnuwech R, Thackerb, Halbur P,etal. Increased production of prionflammatory cytokines following infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus andMycoplasmahyopneumoniae[J]. Clin Diagn Lab Immunol, 2004, 11(5): 901.

[16]Siddiqui B, Chaucer B, Chevenon M,etal. Aerococcus urinae associated aortic and tricuspid valve infective endocarditis[J]. IDCases, 2016, 2 (4): 30.

(編輯：李文平)

Etiological Diagnosis of Lethal Respiratory Disease in a Pig Group in South Yunnan Province

ZHENG Yu-fang1, TAO Yong-yan2, YANG Dai-ze1, YANG Chun-yan3, WU Yu-han1, CHEN Pei-fu1**

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China；2.AgricultureCenterofGengmaCounty,Lincang,Yunnan677500,China; 3.AnimalDiseasePreventionandControlCenter,Chuxiong,Yunnan675000,China)

There was recently an outbreak of lethal respiratory disease in a large-scale pig farm in Honghe Prefecture shortly after breeding pigs were introduced, which was characteristic of fever, diarrhea, dyspnea, the nosebleed before death. It led to a high mortality rate despite of treatment with various drugs, which made it necessary to investigate its etiology in detail. In this experiment, samples including lung, kidneys, spleen and lymph nodes from diseased pigs were collected. The samples were used to inoculate and culture pathogenic bacteria by plate streaking onto the blood agar to form possible hemolytic colonies, followed by high-salt medium culture, Gram staining, biochemical tests for preliminary identification of this isolate. The universal primers for bacterial 16S rRNA genes were then used to amplify its corresponding DNA fragment using PCR technique. The resulting PCR product was recovered by agar gel electrophoresis, and then subjected to TA cloning as well as sequence analysis. Supernatant from milled tissue samples was used to amplify nucleic acid fragments of other potential pathogens by PCR, followed by similar procedure. As a result, the isolated strain displayed positive in Gram staining, utilization of glucose, sucrose, xylose, sorbitol and 6.5% NaCl, but negative in maltose, raffinose, mushroom sugar, esculin, salicin, VP, pyrrolidone, nitrate and catalase test, and gave a specific band with 1542 bp, which had the highest homology (94%) withAerococcusurinae; Single porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) specific 421 bp band and mycoplasma specific 267 bp band were obtained simply by PCR amplification from the tissue samples, respectively, with the former being specific in highly pathogenic PRRSV strains and the latter having a DNA sequence homology up to 99% withMycoplasmahyorhinisSK76 strain. The above results demonstrate that this outbreak of an acute contagious disease was caused mainly by highly pathogenic PRRSV, with mixed infection caused byM.hyorhinisandA.urinae-like bacterium, indicating the importance of intensive emphasis on potential risk of PRRSV carrying in introduced animals.

PRRSV;Mycoplasmahyorhinis;Aerococusurinae-like organism; mixed infection; PCR

云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室(A3007954)；云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生豬產(chǎn)業(yè)技術體系建設(云財農(nóng)[2009]171號)

鄭玉芳，碩士研究生，從事預防獸醫(yī)學研究。陶永艷，獸醫(yī)師，為共同第一作者。

陳培富。E-mail：cltwins2003@sina.com

2016-10-11

A

1002-1280 (2017) 01-0006-06

S858.28