吳俊杰+汪宏錦+楊帥+劉楊+徐曉玉

[摘要]該研究通過觀察冰片是否具有促進(jìn)梓醇、葛根素透過局灶性腦缺血模型大鼠血腦屏障的作用，及其是否與激活β₂腎上腺素受體-eNOS-NO途徑有關(guān)，從醫(yī)學(xué)生物學(xué)作用角度闡釋冰片“通竅引經(jīng)”的傳統(tǒng)功效及其機(jī)制。該研究采用大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞局灶性腦缺血模型，5 d后神經(jīng)功能障礙評(píng)分達(dá)5分者為造模成功。將模型成功大鼠隨機(jī)分為7組，用藥前經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)各組間無顯著性差異后，灌服給予相應(yīng)藥物[梓醇45 mg·kg^-1、 葛根素200 mg·kg^-1、冰片200 mg·kg^-1、布他沙明（Butoxamine，BTX）1.5 mg·kg^-1]：模型組（M組，溶劑）、梓葛組（ZG組）、梓葛冰組（ZGB組）、梓冰組（ZB組）、葛冰組（GB組）、β₂受體阻斷劑+梓葛組（BTX+ZG組）、β₂受體阻斷劑+梓葛冰組（BTX+ZGB組），另設(shè)假手術(shù)組（S組，溶劑），每組10只。各組給藥10 min后取材，采用UPLC-MS測(cè)定腦脊液中梓醇和葛根素含量，Western blot法測(cè)定腦組織中eNOS含量、β₂受體表達(dá)，Griess法檢測(cè)腦組織中NO含量。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，造模大鼠神經(jīng)功能得分均值均在5分以上，具有顯著差異（P<0.05），顯示造模成功。除假手術(shù)組外，經(jīng)單因素方差分析，給藥前各組之間的神經(jīng)功能評(píng)分均無顯著性差異。給藥后與模型組相比，ZG組梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為26.673 μg·L^-1，葛根素含量在檢測(cè)限以下，腦組織中eNOS表達(dá)和NO含量、β₂受體表達(dá)沒有顯著差異；與ZG組相比，ZGB組、ZB組、GB組腦脊液中梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至40～43 μg·L^-1、葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加至72～75 μg·L^-1，腦組織中eNOS表達(dá)和NO含量、β2受體表達(dá)均有顯著升高（P<0.05），顯示冰片有促進(jìn)作用；與ZG組相比，BTX+ZG組大鼠腦脊液中梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為21.401 μg·L^-1，葛根素檢測(cè)不出，2組無顯著差異，顯示BTX無抑制作用；與ZGB組相比，BTX+ZGB組腦脊液中梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)32.826 μg·L^-1、葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)47.820 μg·L^-1，腦組織中eNOS表達(dá)和NO含量均有顯著下降（P<0.05），顯示BTX有抑制作用。該研究說明冰片能夠顯著促進(jìn)梓醇、葛根素透過局灶性腦缺血大鼠血腦屏障，其作用可被β₂腎上腺素受體阻斷劑布他沙明所阻斷，其機(jī)制可能與上調(diào)β₂腎上腺素受體從而促進(jìn)eNOS表達(dá)，進(jìn)而使NO含量升高有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]冰片； 梓醇； 葛根素； 血腦屏障通透性；β₂受體； eNOS； NO

[Abstract]Previous studies showed that borneol could promote some drugs crossing through the blood-brain-barrier （BBB） at certain conditions. However， the mechanism has not been clarified yet. This study aimed to investigate the effect of bornrol on promoting catalpol and puerarin through BBB and explore the relevant mechanism. The focal cerebral ischemic rats were divided into 7 groups randomly and then were administered corresponding drugs： model group （M， solvent）， catalpol-puerarin group （ZG， catalpol 45 mg·kg^-1+puerarin 200 mg·kg^-1）， catalpol-puerarin-bornrol group（ZGB， catalpol 45 mg·kg^-1+puerarin 200 mg·kg^-1 +bornrol 200 mg·kg^-1）， catalpol-bornrol group（ZB， catalpol 45 mg·kg^-1 +bornrol 200 mg·kg^-1）， puerarin-bornrol group（GB， puerarin 200 mg·kg^-1 +bornrol 200 mg·kg^-1）， butoxamine-ZG group（BTX+ZG， butoxamine 1.5 mg·kg^-1+ catalpol 45 mg·kg^-1+puerarin 200 mg·kg^-1）， and butoxamine-ZGB group（BTX+ZGB， butoxamine 1.5 mg·kg^-1+ catalpol 45 mg·kg^-1+puerarin 200 mg·kg^-1 +bornrol 200 mg·kg^-1）. Another 10 sham-operated rats were set as control （S）. Ten minutes after the administration， the cerebrospinal fluid was taken to test the content of catalpol and puerarin， and the brain tissue was taken to test the expression ofβ₂-adrenergic receptor， eNOS， and NO. Compared with the M group， the ZG group showed content of catalpol is 26.673 μg·L^-1 and the content of puerarin is below the detection limit；the expression levels ofβ₂-adrenergic receptor， eNOS and the contents of NO in brain tissue are no significant difference. Compared with the ZG group， the ZGB， ZB and GB groups showed significantly increased content of catalpol andpuerarin， as well as the expression ofβ₂-adrenergic receptor， eNOS and NO in the brain tissue （P<0.05）. The content of catalpol in BTX+ZG group changed non-significantly. Compared with the ZGB group， the BTX+ZGB group presented significantly decreased content of catalpol and puerarin and reduced expression of eNOS and NO in the brain tissue （P<0.05）.The results demonstrated that borneol could dramatically promote catalpol and puerarin crossing through BBB in the focal cerebral ischemic rats. Moreover， the effect may be related to the up-regulation ofβ₂-adrenergic receptor and the increasing expression of eNOS and NO.

[Key words]bornrol； catalpol； puerarin； blood-brain barrier；β₂-adrenergic receptor； eNOS； NO

doi：10.4268/cjcmm20162117

冰片（1，7，7-三甲基-二環(huán)庚-2-醇）系龍腦香科植物龍腦香Dryobalanops aromatica Caertn F.樹脂的加工品或菊科植物艾納香Blumea balsamiferaDC.葉提取的結(jié)晶，或以樟腦、松節(jié)油等為原料，經(jīng)化學(xué)方法合成的精制品片^[1]，性味辛、苦， 微寒，歸心、脾、肺經(jīng)，具有開竅醒神、清熱止痛的功效^[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)冰片具有抗炎^[3]、抗菌^[4]、鎮(zhèn)痛^[5]作用，并能增加血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的通透性，促進(jìn)砷劑^[6]、慶大霉素^[7]等藥物在腦中的轉(zhuǎn)運(yùn)從而提高藥物生物利用度等，但對(duì)其機(jī)制的研究不多。

本實(shí)驗(yàn)以前期研究顯示抗腦缺血有效^[8-11]的梓醇、葛根素為載體，觀察冰片是否能提高腦缺血模型大鼠腦脊液中梓醇、葛根素的含量，從而從醫(yī)學(xué)生物學(xué)作用角度驗(yàn)證冰片“通竅引經(jīng)”及“佐使有功”的傳統(tǒng)功效記載。同時(shí)，檢測(cè)腦組織中β₂受體，eNOS，NO水平，并觀察β₂受體阻斷劑對(duì)冰片的作用是否有阻斷效應(yīng)，以探求冰片“通竅引經(jīng)”的生物學(xué)作用機(jī)制。

1 材料

賽龍100A高頻電刀（北京市亞可康達(dá)醫(yī)療科技有限公司）；130型雙極電凝鑷（武漢麥朗醫(yī)療科技有限公司）；68001立體定位儀（深圳市瑞沃德生命科技有限公司）；SHH-150L生化培養(yǎng)箱（重慶永生試驗(yàn)儀器廠）；5417R臺(tái)式高速離心機(jī)（德國Eppendorf生命科學(xué)有限公司）；ELX800酶標(biāo)儀（美國BioTek儀器有限公司）；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

SPF級(jí)雄性SD大鼠120只，體重（200±25） g，購于重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，動(dòng)物許可證號(hào)SCXD（渝）2012-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)0003223，飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，使用許可證號(hào)SYXK（渝）2014-0002。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，對(duì)大鼠進(jìn)行篩選，去掉體重過輕、過重、行運(yùn)遲緩及反應(yīng)遲鈍的動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)過程中善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理的有關(guān)規(guī)定。

冰片（重慶市和平藥房，經(jīng)西南大學(xué)齊紅藝教授鑒定為龍腦香科植物龍腦香D.aromatica的精制品片，純度99.4%）；梓醇（安徽康輝藥業(yè)，純度99.8%）；葛根素（四川玉鑫藥業(yè)，純度100%）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；β₂-AR抗體（0.2 mL/支，AD123114），一氧化氮合成酶-3（內(nèi)皮型）抗體（0.2 mL/支，L8081801）均購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Griess reagent（10 g/瓶，SLBC6343V），β₂受體阻斷劑布他沙明鹽酸鹽（butoxamine hydrochloride）（50 mg/瓶，MKBR6952V）均購于Sigma-Aldrich。

2 方法

2.1 主要藥物溶液的配制

以47.5%乙醇溶液為溶劑，分別將冰片、梓醇、葛根素配制成藥物溶液，其中冰片200 mg·kg^-1、葛根素200 mg·kg^-1、梓醇45 mg·kg^-1；布他沙明（Butoxamine，BTX）配成生理鹽水溶液（1.5 mg·kg^-1）備用。

2.2 動(dòng)物造模

取SD大鼠120只，參考文獻(xiàn)資料采用改良Tamura法制備大鼠局灶性腦缺血模型^[12-13]。大鼠3.5%水合氯醛麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上。剪毛消毒，沿右側(cè)頂顳嵴切開大鼠頭皮，切口約2 cm，鈍性分離顳肌，充分暴露顳窩。用顱骨鉆在鱗狀骨前部打孔至有凹陷即可，使用小手術(shù)鉗向前下方擴(kuò)大骨窗，注意不要破壞硬腦膜。在大腦皮層表面，約在左眼和右耳的連線上，可以看到向上行走的大腦中動(dòng)脈。使用玻璃分針輕輕上抬大腦，使大腦中動(dòng)脈暴露更加充分。用雙極電凝鑷對(duì)大腦中動(dòng)脈進(jìn)行凝斷（電凝強(qiáng)度為2，凝閉時(shí)間為2～3 s）。完成后傷口用青霉素處理，分別縫合肌肉和皮膚。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分及分組

術(shù)后5 d后采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分 （modified neurological severity scores，mNSS）對(duì)造模大鼠進(jìn)行功能評(píng)分^[14-15]。mNSS評(píng)分包括運(yùn)動(dòng)、感覺、反射和平衡木4項(xiàng)測(cè)試，神經(jīng)功能記分在0～18分 （0分為正常，最大神經(jīng)功能缺損為18分）。評(píng)分在5分及5分以上分?jǐn)?shù)的造模大鼠判定為造模成功。行為學(xué)檢查方法：由一個(gè)對(duì)試驗(yàn)實(shí)施過程不了解的觀察者對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)測(cè)，評(píng)測(cè)續(xù)貫進(jìn)行。如果大鼠在一次評(píng)測(cè)中出現(xiàn)恰當(dāng)?shù)男袨?，而以后卻未出現(xiàn)，按前者記分。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為7組，模型組（M組）、梓葛組（ZG組）、梓葛冰組（ZGB組）、梓冰組（ZB組）、葛冰組（GB組）、β₂受體阻斷劑+梓葛組（BTX+ZG組）、β₂受體阻斷劑+梓葛冰組（BTX+ZGB組），每組10只大鼠，經(jīng)用藥前統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)各組間評(píng)分無顯著性差異后給藥。以僅暴露大腦中動(dòng)脈，但不凝斷的大鼠10只作為假手術(shù)組（S組）。

2.4 動(dòng)物給藥及取材

除假手術(shù)組及模型組外，其余各組模型大鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物及劑量，灌服藥物體積為0.01 mL·g^-1，β₂受體阻斷劑布他沙明腹腔注射30 min后再給藥，劑量為1.5 mg·kg-1[16-17]。隨后用3.5%水合氯醛麻醉大鼠，給藥10 min后采集腦脊液（前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠灌胃后10 min冰片開始出現(xiàn)促透作用）：用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚，剪去背毛暴露皮膚。兩耳連線剪一橫切口（1.5 cm左右），在其中點(diǎn)向尾側(cè)沿皮下剪開2 cm，將皮分離兩側(cè)，擴(kuò)大視野。緊貼大鼠頭骨依次逐層剪切各肌層，并斷端依次拉向尾側(cè)擴(kuò)大視野。接近頸后黃韌帶時(shí)，小心地分離附蓋的肌肉，暴露寰枕膜。用微量進(jìn)樣器水平刺入蛛網(wǎng)膜下腔，固定針體，緩慢抽取腦脊液放置在離心管中，-80 ℃保存。斷頭取大鼠缺血側(cè)皮層腦組織，按每約100 mg組織加入700 μL裂解液于冰上研磨，于低溫高速離心機(jī)中12 000 r·min^-1離心30 min，取上清液，-20 ℃保存。

2.5 UPLC-MS/MS檢測(cè)梓醇、葛根素含量^[18-19]

2.5.1 色譜條件 I-Class色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相10 mmol·L^-1甲酸胺水溶液-乙腈，梯度洗脫，洗脫條件見表1。

2.5.2 質(zhì)譜條件 毛細(xì)管電壓2.7 kV，脫溶劑氣流速700 L·h^-1，錐氣流速50 L·h^-1， ESI正離子模式。質(zhì)譜條件見表2。

2.6 Western blot法測(cè)定缺血側(cè)皮層腦組織中β2受體、eNOS含量

采用BCA法測(cè)定樣品蛋白含量，計(jì)算得到每孔總蛋白上樣量為50 μg。樣品蛋白加入Loading Buffer后渦旋混勻，用PCR儀進(jìn)行蛋白處理（95 ℃，5 min）；再配制5%濃積膠和10%分離膠，經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、切膜后條帶用TBST配制的5% BSA 4 ℃封閉過夜，繼而進(jìn)行一抗孵育[37 ℃，90 min；兔抗eNOS（1∶300）、兔抗β2-AR（1∶300）]；TBST清洗條帶后二抗孵育[室溫、90 min；小鼠抗GAPDH（1∶5 000）]；最后得到的蛋白表達(dá)條帶用TBST洗后采用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影并進(jìn)行圖像分析。

2.7 Griess法檢測(cè)腦組織NO表達(dá)

按試劑盒說明操作，檢測(cè)NO表達(dá)。取一塊96孔板，依次加入S組、M組、ZG組、ZGB組、ZB組、GB模型組、BTX+ZG組、BTX+ZGB組樣品液100 μL，各孔再分別加入Griess reagent 100 μL，室溫反應(yīng)15 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。以吸光度大小衡量NO表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計(jì)處理方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，GraphPad Prism 5.0作圖，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以±s表示。

3 結(jié)果

3.1 模型成功判定結(jié)果及分組差異性檢驗(yàn)

造模后大鼠精神萎靡，飲水、攝食狀況差，部分大鼠在造模后死亡。進(jìn)行局灶性腦缺血造模的大鼠共120只，術(shù)中及術(shù)后死亡共16只，術(shù)后蘇醒進(jìn)入存活率觀察的大鼠共104只。造模5 d后，除假手術(shù)組外，各組造模大鼠神經(jīng)功能評(píng)分在5分以上者76只，造模成功率為63.3%。去除造模后飲水、攝食狀況差所致的體重過輕、健康狀況過差的大鼠6只，按照隨機(jī)表將70只造模成功的大鼠分成7組，每組10只，各組大鼠神經(jīng)功能得分均值均在5分以上，與假手術(shù)組對(duì)照具有顯著差異（P<0.05），顯示造模成功。除假手術(shù)組外，經(jīng)單因素方差分析，給藥前各組的神經(jīng)功能評(píng)分均無顯著性差異，見表3。

3.2 冰片顯著升高局灶性腦缺血模型大鼠腦脊液中梓醇、葛根素含量

給藥10 min后，ZG組大鼠腦脊液中梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（26.673±0.936） μg·L^-1、葛根素含量在檢測(cè)限以下，無法檢出；與ZG組相比，在合用冰片后，ZGB組腦脊液中梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（43.087±7.637） μg·L^-1，葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（75.554±3.555） μg·L^-1；ZB組腦脊液中梓醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（40.652±1.900） μg·L^-1；GB組腦脊液中葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（72.049±2.074） μg·L^-1，ZGB組、ZB組、GB組腦脊液中梓醇或葛根素含量都顯著增加（P<0.05），顯示冰片能顯著促進(jìn)梓醇、葛根素透過局灶性腦缺血大鼠血腦屏障，見表4。

3.3β₂受體阻斷劑顯著抑制冰片對(duì)梓醇、葛根素的促透作用

在給藥前30 min用布他沙明預(yù)處理之后，與ZG組相比，BTX+ZG組腦脊液中梓醇和葛根素含量無顯著變化；與ZGB組相比，BTX+ZGB組腦脊液中梓醇和葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（32.826±1.813），（47.820±2.574）μg·L^-1，均顯著降低（P<0.05），說明阻斷β₂腎上腺素受體能顯著降低冰片對(duì)梓醇、葛根素的促透作用，見表4。

3.4 冰片配伍梓醇、葛根素后顯著促進(jìn)局灶性腦缺血模型大鼠腦內(nèi)eNOS表達(dá)與NO含量升高

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠eNOS表達(dá)量無顯著變化，NO含量顯著提高（P<0.05）；與模型組相比，ZG組eNOS表達(dá)和NO含量無顯著變化；而與ZG組相比，ZGB組、ZB組和GB組eNOS表達(dá)和NO含量都顯著升高（P<0.05），說明冰片配伍梓醇、葛根素后能顯著促進(jìn)腦內(nèi)eNOS與NO的水平，見圖1，2。

3.5 β₂受體阻斷劑顯著抑制冰片配伍梓醇、葛根素后上調(diào)eNOS表達(dá)和NO含量作用

與ZG組相比，BTX+ZG組eNOS表達(dá)和NO含量均沒有顯著變化，說明在沒有合用冰片條件下β₂受體阻斷劑布他沙明對(duì)eNOS表達(dá)和NO含量沒有影響；但是與ZGB組相比，給藥前30 min用β₂受體阻斷劑布他沙明預(yù)處理之后，BTX+ZGB組的eNOS表達(dá)量顯著下降（P<0.01）、NO含量顯著降低（P<0.05），說明β₂受體阻斷劑能抑制冰片對(duì)eNOS表達(dá)和NO含量的促進(jìn)作用，見圖1，2。

3.6 冰片配伍梓醇、葛根素后顯著上調(diào)局灶性腦缺血模型大鼠腦內(nèi)β₂受體表達(dá)

與假手術(shù)組相比，模型組β₂受體表達(dá)無顯著變化；與模型組相比，ZG組β₂受體表達(dá)無顯著變化；與ZG組相比，ZGB組β₂受體表達(dá)量極顯著上升（P<0.01），同時(shí)ZB組、GB組β₂受體表達(dá)量也顯著上升（P<0.05），說明冰片配伍梓醇、葛根素后能顯著上調(diào)局灶性腦缺血模型大鼠腦內(nèi)β₂受體表達(dá)，見圖3。

4 討論

4.1 冰片“通竅引經(jīng)”功效的生物學(xué)作用驗(yàn)證

冰片引藥上行的作用自古就有記載?！侗静菥V目》稱其能“通諸竅、散郁火”， 而《本草衍義》總結(jié)出的其作用特點(diǎn)“獨(dú)行則勢(shì)弱， 佐使則有功”。后世冰片多作為中醫(yī)方劑配伍之佐使藥， 以引經(jīng)直達(dá)病所^[20]。曾有研究表明，冰片內(nèi)服后可經(jīng)胃腸道迅速吸收，5 min后即可通過血腦屏障進(jìn)入腦組織，說明能夠快速打開血腦屏障^[21-22]。本實(shí)驗(yàn)通過配伍研究發(fā)現(xiàn)，在給藥10 min后，配伍了冰片的給藥組比單純使用梓醇或葛根素的組別腦脊液中梓醇或葛根素的含量均顯著提高，說明冰片能夠顯著促進(jìn)梓醇和葛根素透過血腦屏障。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果從生物學(xué)作用的角度，印證了冰片“通竅引經(jīng)”及“佐使有功”的傳統(tǒng)功效記載。

4.2 eNOS來源的NO具有血腦屏障保護(hù)作用

NO是血腦屏障通透性的重要調(diào)節(jié)分子，由nNOS，eNOS，iNOS 3種一氧化氮合成酶催化合成。在腦缺血的發(fā)展過程中，不同細(xì)胞中不同類型的酶催化合成的NO及其量的多少、氧化或還原狀態(tài)不同則會(huì)產(chǎn)生不同的生物學(xué)作用。腦缺血發(fā)生后，nNOS產(chǎn)生的NO介導(dǎo)早期谷氨酸興奮毒性并導(dǎo)致缺血初期的神經(jīng)損傷^[23-25]。亞急性期之后，iNOS在有充足底物和協(xié)同因子的條件下可持續(xù)由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等組織細(xì)胞大量表達(dá)^[26-27]，并由其主要介導(dǎo)病理性損傷過程，產(chǎn)生過量NO，導(dǎo)致遲發(fā)性神經(jīng)損傷和促使微血管通透性增加誘發(fā)腦水腫，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)半暗帶區(qū)進(jìn)展為梗塞灶^[28-32]。有研究使用同源重組技術(shù)發(fā)現(xiàn)，nNOS及iNOS基因敲除小鼠在腦缺血后的梗死灶減小，證實(shí)nNOS和iNOS在腦缺血后的表達(dá)具有毒性作用^[33-34]，使用nNOS和iNOS阻斷劑可以分別減少腦缺血早期或晚期所誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和組織損傷^{[23-25，35-37]}；而eNOS基因缺陷小鼠在腦缺血后的梗死灶較野生型大， 提示eNOS源性NO在腦缺血中具有保護(hù)性作用^[38]。但eNOS主要通過擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、減少白細(xì)胞黏附增強(qiáng)側(cè)支循環(huán)而改善缺血后腦血流的神經(jīng)保護(hù)作用很快就會(huì)被iNOS介導(dǎo)的毒性作用所取代^[38-39]。所以抑制iNOS的表達(dá)或促進(jìn)eNOS的表達(dá)是腦缺血的一種良好治療策略。

4.3 冰片通過升高eNOS表達(dá)增加NO的含量

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織中NO含量相比假手術(shù)組顯著升高，可能與病理?xiàng)l件下iNOS表達(dá)上調(diào)從而生成NO增多有關(guān)；與梓醇+葛根素組相比，梓醇+葛根素+冰片組eNOS表達(dá)和NO含量進(jìn)一步上升，提示冰片可進(jìn)一步促進(jìn)eNOS的表達(dá)，從而促使eNOS源性的NO增多，對(duì)血腦屏障的開放增強(qiáng)。并且有研究顯示，冰片能夠抑制iNOS的表達(dá)及其活性，減少iNOS源性的NO過度產(chǎn)生^[40-42]；將iNOS源性NO導(dǎo)致血腦屏障損傷性病理性開放轉(zhuǎn)變?yōu)閑NOS源性的NO對(duì)血腦屏障可逆性生理性的開放。冰片的這種血腦屏障促透作用與病理性血腦屏障擴(kuò)張不同，不會(huì)損傷或加重血腦屏障損傷，具有顯著的腦和血腦屏障保護(hù)作用^{[40，42-44]}。

4.4 冰片通過上調(diào)β₂腎上腺素受體升高eNOS表達(dá)

曾有研究顯示，通過介導(dǎo)β₂受體能促進(jìn)eNOS表達(dá)^[45-48]，并使其磷酸化水平增強(qiáng)^[49]，且這種作用能夠被β₂受體阻斷劑所抑制^[50]。這引起了作者思考：冰片能否通過介導(dǎo)β₂腎上腺素受體上調(diào)eNOS表達(dá)、增加NO含量進(jìn)而促進(jìn)血腦屏障開放。本研究結(jié)果首次證實(shí)，冰片能顯著上調(diào)局灶性腦缺血模型大鼠腦內(nèi)β₂受體表達(dá)；在使用β₂受體阻斷劑布他沙明預(yù)處理后，eNOS表達(dá)和NO含量比未予阻斷組顯著減少，腦脊液中梓醇和葛根素含量也顯著降低，說明通過阻斷β₂受體能顯著抑制冰片對(duì)eNOS表達(dá)和NO含量的上調(diào)作用，進(jìn)而抑制冰片對(duì)血腦屏障的開放作用。這提示冰片可能通過上調(diào)β₂腎上腺素受體進(jìn)而上調(diào)eNOS表達(dá)和增加NO含量，促進(jìn)血腦屏障的開放。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為冰片“通竅引經(jīng)”的傳統(tǒng)功效提供了生物學(xué)作用信號(hào)通路的依據(jù)。但是冰片對(duì)β₂腎上腺素受體的調(diào)控是如何具體實(shí)現(xiàn)的，有待進(jìn)一步深入研究。

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[責(zé)任編輯 陳玲]