何首烏是常見的補(bǔ)益中藥，它是蓼科植物何首烏的干燥塊根，有很好的通便、潤腸、截瘧、消癰、解毒等作用，通過將何首烏炮制加工，更是有可化濁降脂、強(qiáng)筋骨、烏須發(fā)、益精血、補(bǔ)肝腎等效果[1-2]。但經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，索骨丹、頭花千金藤、白首烏、毛脈蓼、翼蓼很容易和何首烏混偽，給制何首烏和何首烏飲片帶來嚴(yán)重影響，對(duì)此有很多研究者通過各種方法來區(qū)分、鑒別，如分子生藥學(xué)、近紅外光譜、高效液相色譜、高效液相色譜、顯微鑒別、性狀特征[3-6]，但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道通過液相色譜特征圖譜和系統(tǒng)的薄層色譜鑒別方法。本研究就通過液相色譜特征圖譜和系統(tǒng)的薄層色譜來比較分析，皆在為何首烏藥材和飲片的真?zhèn)舞b別提供參考，現(xiàn)將報(bào)道如下。

1 試藥與儀器

1.1 試藥

何首烏和制何首烏藥材及飲片均來源于市場抽樣，翼蓼、毛脈蓼、索骨丹、頭花千金藤、白首烏均來源于市場；水為超純水，甲醇和乙腈都是色譜純；大黃素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷對(duì)照品、大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷對(duì)照品由成都曼思特生物科技有限公司提供；制何首烏對(duì)照藥材、何首烏對(duì)照藥材、大黃素甲醚對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、虎杖苷對(duì)照品、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.2 儀器

高效液相色譜儀（美國waters公司，型號(hào)：2695/2487）；薄層色譜數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司，型號(hào)：TLCVISU ALIZER）；薄層點(diǎn)樣儀（瑞士卡瑪公司，型號(hào)：CAMAG automatic TLC sampler 4）；電子分析天平（德國賽多利斯公司，型號(hào)：SECURA213-1CN）。

2 方法

2.1 性狀鑒別

何首烏最顯著的性狀特征就是云錦花紋，但若經(jīng)過炮制，其性狀會(huì)變化，最明顯的就是轉(zhuǎn)為黑褐色，所以如果用炮制前的特征來鑒別就不明顯，容易被其他類似品冒充[7]。若何首烏是正品，在炮制后的塊片就是不規(guī)則皺縮狀，凹凸不平，但質(zhì)堅(jiān)硬，表面棕褐色或黑褐色，大約厚1 cm，斷面角質(zhì)樣，斷面為黑色或棕褐色，氣微，味微甘伴苦，見圖1-1。本次專項(xiàng)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可以將性狀不合格的制何首烏分為2類：（1）不規(guī)則略皺縮狀塊片，很薄，大約厚0.3 cm，斷面一般角質(zhì)不明顯，氣微，微甘略苦，見圖1-2；（2）不規(guī)則略皺縮狀塊片，黑褐色，大小不一，凹凸不平，斷面無角質(zhì)，氣微，味淡，見圖1-3和1-4。

圖1 制何首烏性狀圖

2.2 高效液相色譜特征圖譜

2.2.1 液相色譜條件 色譜條件：Waters Xbridge C18色譜柱；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫；流速：1.0ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30℃；檢測波長：254 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 稱取6.73mg大黃素甲醚對(duì)照品，6.30mg大黃素對(duì)照品，5.43mg大黃素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷，5.64mg大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷，7.43mg 2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，放入50ml的量瓶，再加入甲醇進(jìn)行溶解，搖勻。

2.2.3 供試品溶液的制備 取適量供試品藥材進(jìn)行粉碎，再過4號(hào)篩，稱取1 g供試品粉末，放入三角瓶，再加入50ml甲醇，80℃加熱回流1 h，過濾再蒸干，將濾液當(dāng)作供試品溶液。

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1 薄層色譜條件 固定相：以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G；展開溶劑：甲醇和三氯甲烷以3∶7比例展至6 cm，晾干，再以1∶20比例為展開劑，展至7 cm，晾干；檢視條件：紫外光燈下檢視。

2.3.2 對(duì)照品及對(duì)照藥材溶液的制備 對(duì)照品溶液制備：分別取大黃素甲醚對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品，再分別加入甲醇制成1mg/ml的溶液。對(duì)照藥材溶液制備：取0.25 g制何首烏對(duì)照藥材或者何首烏，加入50ml乙醇，加熱回流1 h，濾液濃縮到3ml。

2.3.3 供試品溶液的制備 取0.25 g供試品粉末，再加入50ml乙醇，加熱回流1 h，濾液濃縮到3ml。

3 結(jié)果

3.1 薄層色譜鑒別結(jié)果

本研究在目前的中國藥典標(biāo)準(zhǔn)薄層色譜鑒別上加入了大黃素甲醚對(duì)照品、大黃素對(duì)照品、2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品，通過此種方法來區(qū)分翼蓼藥材、頭花千金藤、索骨丹、白首烏與何首烏的區(qū)別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，何首烏的主要斑點(diǎn)色譜行為和毛脈蓼相似，有研究顯示[8-9]，何首烏和毛脈蓼均含有大黃素甲醚和大黃素，而不同的是何首烏缺少毛脈蓼的虎杖苷，但何首烏有2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，這兩個(gè)苷元都是茋類化合物[10]。通過仔細(xì)觀察圖譜可以發(fā)現(xiàn)，2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷與虎杖苷的區(qū)別在紫外光365 nm下檢視顏色不同，另外虎杖苷斑點(diǎn)上面還有一個(gè)明顯的主斑點(diǎn)，顏色為桔紅色，所以這可以用來區(qū)分毛脈蓼和何首烏。見圖2。

圖2 其他混偽品種和何首烏薄層色譜圖

3.2 高效液相色譜特征圖譜鑒別結(jié)果

其他混偽品種和何首烏的高效液相特征圖譜與薄層色譜基本相同，通過薄層色譜可以很好的區(qū)分翼蓼藥材、頭花千金藤、索骨丹、白首烏與何首烏的區(qū)別。見圖3。

但何首烏和毛脈蓼的圖譜較為相似，見圖4，兩者均有色譜峰2～5，化學(xué)成分分別為大黃素甲醚、大黃素、大黃素甲醚-8-O-β-D-吡喃葡萄苷、大黃素-8-O-β-D-吡喃葡萄苷。何首烏中成分二苯乙烯苷（見圖4峰1）與毛脈蓼藥材中的虎杖苷（見圖4峰6）化學(xué)結(jié)構(gòu)很相似，且色譜峰的保留時(shí)間（9.8 min/10.1 min）也很接近，所以很容易將兩者混淆。仔細(xì)分析圖譜可以發(fā)現(xiàn)，色譜峰7可以區(qū)分毛脈蓼和何首烏，經(jīng)過二極管陣列檢測器檢測發(fā)現(xiàn)，色譜峰7的最大紫外吸收波長和虎杖苷一致，因此可以初步判斷色譜峰7可能具有二苯乙烯類結(jié)構(gòu)母核的苷類化合物，但還需要進(jìn)一步深入研究其化學(xué)信息。

圖3 其他混偽品種與何首烏的高效液特征圖譜

4 討論

本研究所有建立的高效液相色譜特征圖譜、薄層色譜以及性狀鑒別法可有效卻分何首烏與其他常見偽品藥材的區(qū)別，且高效液相色譜特征圖譜和薄層色譜還可以相互補(bǔ)充和驗(yàn)證。本研究有以下2個(gè)方面需要注意：（1）在目前的二苯乙烯苷含量測定項(xiàng)下，何首烏流動(dòng)相條件為乙腈-水,2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰保留時(shí)間約7min，這個(gè)色譜峰保留時(shí)間與毛脈蓼的虎杖苷會(huì)重合，容易導(dǎo)致誤判，作者認(rèn)為應(yīng)將二苯乙烯苷含量測定項(xiàng)下流動(dòng)相調(diào)整，以便兩者分離。（2）毛脈蓼藥材特征圖譜的峰7是區(qū)別何首烏的關(guān)鍵，應(yīng)加大對(duì)其的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究，若不法分子用酸水解毛脈蓼來替代何首烏，可以用這種苷類化合物來判斷。

圖4 其他混偽品種與何首烏的高效液特征圖譜

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