林偉仁，朱 鋒，應(yīng)榮彪，陳亞天，曾玲暉

(1. 浙江省臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，浙江 溫嶺 317502；2. 浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)研究所，浙江 杭州 310015)

◇研究簡報(bào)◇

EZH2抑制劑GSK126對Neuro-2a細(xì)胞增殖分化的影響及其可能機(jī)制

林偉仁1，朱 鋒2，應(yīng)榮彪1，陳亞天2，曾玲暉2

(1. 浙江省臺(tái)州市腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，浙江 溫嶺 317502；2. 浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)院藥學(xué)研究所，浙江 杭州 310015)

EZH2抑制劑；GSK126；Neuro-2a細(xì)胞；mTOR信號(hào)通路；凋亡；分化

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma，NB)是常見的兒童惡性腫瘤，在手術(shù)、放化療及介入等多種手段綜合治療下，總體療效仍然極差。近年來研究發(fā)現(xiàn)，果蠅zeste基因增強(qiáng)子同源物2( enhancer of zeste homolog 2，EZH2)能抑制相關(guān)抑癌基因，明顯增加神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)[1]。GSK126是一種新型的選擇性EZH2抑制劑[2-3]，其在實(shí)體瘤方面的藥效探究目前相對較少。本文將對GSK126在神經(jīng)母細(xì)胞瘤Neuro-2a細(xì)胞中的作用及其可能機(jī)制作初步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 GSK126(上海瀚香生物科技有限公司)；兔多克隆抗體phosph-mTOR(Ser2448)、phosph-S6(Ser240/244)、mTOR和S6(美國Cell Signaling Technology公司)；流式細(xì)胞儀FACSCalibur(美國BD公司)。

1.2 方法 GSK126先溶解于DMSO，保存于-20 ℃，實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)基稀釋到所需終濃度，低、中、高劑量組分別設(shè)定為5、20、50 μmol·L-1。采用SRB法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡，以無血清培養(yǎng)細(xì)胞觀察GSK126對細(xì)胞分化的影響，蛋白印跡法檢測mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。

Tab 1 Cell cycle distribution and apoptotic rate of Neuro-2a cells treated with GSK126

*P<0.05vscontrol group

2 結(jié)果

2.1 GSK126對Neuro-2a細(xì)胞存活率的影響 GSK126在5～25 μmol·L-1間未顯示明顯的抑制作用，抑制率在10%以下，當(dāng)濃度增加到50 μmol·L-1時(shí)則顯示較強(qiáng)抑制作用，抑制率達(dá)到70%以上。

2.2 GSK126對Neuro-2a細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度GSK126(5、20、50 μmol·L-1)處理細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，5、20 μmol·L-1的GSK126給藥組細(xì)胞周期及凋亡比例未發(fā)生明顯改變。但50 μmol·L-1GSK126誘發(fā)明顯的細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞處于G0/G1期及G2/M期的比例明顯下降，細(xì)胞生長主要阻滯在S期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見Tab 1。

2.3 GSK126明顯促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞的分化 10%血清培養(yǎng)對照組細(xì)胞一直處于增殖狀態(tài)。無血清培養(yǎng)基對照組培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞雖有明顯延伸的突起，但突起較細(xì)較短，且分化細(xì)胞數(shù)(突起長度為胞體直徑2倍以上的細(xì)胞)僅占(10.2±1.1)%。而GSK126處理的細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞突起生長明顯，同時(shí)胞體直徑明顯變大，低、中、高GSK126劑量組分化細(xì)胞分別占(15.2±1.5)% (P<0.05)、(20.3±2.1)%(P<0.05)和(30.4±3.1)%(P<0.01)。

2.4 GSK126能有效抑制Neuro-2a細(xì)胞mTOR信號(hào)通路活性 在不同濃度GSK126(5、20、50 μmol·L-1)作用下，磷酸化mTOR蛋白與總蛋白的比值分別下降到對照組的81%(P<0.05)、73%(P<0.05)和61%(P<0.01)，磷酸化S6蛋白與總蛋白的比值分別下降到對照組的82%(P<0.05)、67%(P<0.05)和56%(P<0.01)，隨藥物濃度呈劑量依賴性下降。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)GSK126在低濃度下抑制Neuro-2a細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用并不明顯，但能有效促進(jìn)細(xì)胞分化，并且隨著GSK126藥物濃度的增加，分化細(xì)胞的比例亦相應(yīng)增加。研究表明，EZH2對神經(jīng)細(xì)胞特性的維持和細(xì)胞分化過程具有調(diào)控作用，與多種神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、分級(jí)及治療密切相關(guān)[1,4]。由此提示GSK126作為EZH2的抑制劑，可能通過影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化狀態(tài)，進(jìn)而改變神經(jīng)腫瘤的預(yù)后。

在眾多參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖分化的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中，mTOR處于樞軸位置。已在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者中證實(shí)，mTOR 信號(hào)病理性激活是病情預(yù)后不良的標(biāo)志[5]，下調(diào)EZH2的表達(dá)可抑制mTOR信號(hào)的異常激活[6]。本研究表明，隨著EZH2蛋白特異性抑制劑GSK126藥物濃度的增加，mTOR及S6等mTOR信號(hào)相關(guān)蛋白磷酸化降低，mTOR通路活性下降，且Neuro-2a細(xì)胞變大、突起變粗變長、分化細(xì)胞的比例相應(yīng)增加。由此可見，GSK126適度下調(diào)mTOR活性有利于其調(diào)控Neuro-2a細(xì)胞分化。本研究中，高劑量GSK126作用下亦可抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，這對于Neuro-2a細(xì)胞進(jìn)行分化和維持分化狀態(tài)可能也起到了必不可少的作用。在后續(xù)的研究中，我們將以此為基礎(chǔ)，對GSK126的作用機(jī)制，特別是通過調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化的具體機(jī)制做進(jìn)一步的探究，以期找到可能的關(guān)鍵靶點(diǎn)，從而為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新的方法和策略。

[2] Mccabe M T，Ott H M，Ganji G，et al. EZH2 inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations[J].Nature，2012，492(7427)：108-12.

[3] Chen Y T，Zhu F，Lin W R，et al. The novel EZH2 inhibitor, GSK126, suppresses cell migration and angiogenesis via down regulating VEGF-A[J].CancerChemotherPharmacol，2016， 77(4)：757-65.

[4] 陳小霞，謝 娟，黃 成， 等. EZH2對HSC-T6細(xì)胞增殖活化的影響及其部分機(jī)制研究[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31(8)：1061-5.

[4] Chen X X，Xie J，Huang C，et al. EZH2 plays a role in HSC-T6 cell proliferation and activation affecting MAPK/ERK and PI3K/AKT pathway[J].ChinPharmacolBull， 2015，31(8)：1061-5.

[5] Opel D，Poremba C，Simon T，et al. Activation of Akt predicts poor outcome in neuroblastoma[J].CancerRes，2007，67(2)：735-45.

[6] Zhang W，Lv S H， Liu J，et al. PCI-24781 down-regulates EZH2 expression and then promotes glioma apoptosis by suppressing the PIK3K/Akt/mTOR pathway[J].GenetMolBiol，2014，37(4)：716-24.

Effect of GSK126, a novel EZH2 inhibitor, on proliferation and differentiation of Neuro-2a cells

LIN Wei-ren1, ZHU Feng2， YING Rong-biao1, CHEN Ya-tian2, ZENG Ling-hui2

(1.DeptofInternalMedicine,TaizhouCancerHospital,WenlingZhejiang317502,China; 2.DeptofPharmacy,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversityCityCollege,Hangzhou310015,China)

EZH2 inhibitor；GSK126；Neuro-2a cells；mTOR signaling pathway；apoptosis；differentiation

時(shí)間：2017-1-13 11:38:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170113.1138.054.html

2016-11-16，

2016-12-12

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研資助項(xiàng)目(No 2015KYA148);杭州市科技局重大科技創(chuàng)新資助項(xiàng)目(No 20152013A02)

林偉仁(1971- )，男，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤的診治，E-mail: linweiren1971@163.com； 朱 鋒(1978- )，女，碩士，講師，研究方向：藥理學(xué)，共同第一作者，E-mail: zhuf@zucc.edu.cn； 曾玲暉(1972- )，女，博士，教授，研究方向：藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: zenglh@zucc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.02.027

A

1001-1978(2017)02-0289-02

R329.24；R329.25；R730.264；R739.4；R916.4