劉文鋒魏霞張冰俠印大中湯長發(fā)唐利花陳宗平

1湖南師范大學體適能與運動康復湖南省重點實驗室（湖南長沙 410012）2湖南師范大學蛋白質(zhì)化學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室（湖南長沙 410081）

規(guī)律運動對增齡大鼠比目魚肌細胞凋亡與自噬及PGC-1α信號調(diào)控的影響

劉文鋒1，2魏霞1張冰俠1印大中1，2湯長發(fā)1唐利花1陳宗平1

1湖南師范大學體適能與運動康復湖南省重點實驗室（湖南長沙 410012）2湖南師范大學蛋白質(zhì)化學與發(fā)育生物學教育部重點實驗室（湖南長沙 410081）

目的：探討規(guī)律性運動對骨骼肌肌纖維增齡性老化過程中的細胞凋亡與細胞自噬及PGC-1α信號調(diào)控的作用機制。方法：選用SPF級健康雄性3月齡（青年，n=20）、13月齡（中年，n=24）和22月齡（老年，n=24）大鼠，按體重隨機分為青年對照組（Y-SED）、青年運動組（Y-EX）；中年對照組（M-SED）、中年運動組（M-EX）；老年對照組（O-SED）和老年運動組（O-EX）。對照組3組靜息，運動組3組實施10周規(guī)律的遞增負荷中等強度有氧運動。采用HE染色檢測肌纖維縱橫兩個面的形態(tài)學變化，免疫印跡法檢測SOD表達水平、TUNEL法檢測凋亡，免疫印跡法等檢測自噬及PGC-1α通路的蛋白質(zhì)表達水平。結果：（1）HE染色顯示規(guī)律有氧運動提高了增齡性大鼠比目魚肌肌纖維的成束性和緊密性，而免疫印跡結果顯示其提高了SOD表達水平。（2）各年齡對照組大鼠比目魚肌細胞凋亡的增加呈現(xiàn)增齡性趨勢，而規(guī)律有氧運動各年齡大鼠凋亡指數(shù)分別增加了7.55%、20.26%（Ρ＜0.05）和14.52%（Ρ＜0.05）。（3）各年齡對照組大鼠自噬基因LC-Ⅲ呈現(xiàn)增齡性降低趨勢，規(guī)律有氧運動各年齡大鼠的LC-Ⅲ均顯著上升（Ρ＜0.01），各年齡運動組自身LC-Ⅲ卻呈現(xiàn)增齡性上升趨勢。（4）與相對應的對照組相比較，規(guī)律有氧運動各年齡大鼠自噬因子Beclin1表達均顯著上升（Ρ＜0.05），其中Y-EX組上升最顯著（Ρ＜0.01），各年齡運動組自身Be?clin1的表達水平卻呈現(xiàn)增齡性降低趨勢。（5）與Y-SED組相比，M-SED組的PGC-1α表達水平增加，但OSED組比Y-SED和M-SED兩組的PGC-1α表達水平顯著下降（Ρ＜0.01）。與安靜對照組相比較，Y-EX和M-EX兩組PGC-1α表達水平均呈現(xiàn)上升趨勢，其中與O-SED組相比，O-EX組PGC-1α表達水平顯著上升（Ρ＜0.01，Ρ＜0.05）。結論：自噬與凋亡兩者之間的平衡穩(wěn)定關系影響著比目魚肌增齡性老化的發(fā)生發(fā)展，規(guī)律有氧運動對增齡性老化大鼠比目魚肌細胞自噬與凋亡的影響出現(xiàn)增齡性變化，其機制是通過激發(fā)Beclin1和PGC-1α信號通路參與調(diào)控而達到調(diào)節(jié)比目魚肌的生物學功能與改善骨骼肌老化。

規(guī)律有氧運動；細胞凋亡；細胞自噬；過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α

骨骼肌的形態(tài)結構、生理功能、收縮力量及生理生化環(huán)境等都會影響到人體的運動能力，骨骼肌等組織細胞凋亡是細胞接受某種信號或受到某種因素刺激后，為了維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)生的一種主動性消亡過程，涉及到人類生長、發(fā)育和衰老，更涉及到多種現(xiàn)代病的發(fā)病機理。同時，研究表明自噬在維持骨骼肌內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起重要作用，自噬缺陷與多種骨骼肌疾病相關[1]。Garber[2]提出運動訓練對機體代謝的良性效應可利用自噬現(xiàn)象來解釋，使細胞自噬成為運動科學領域的研究熱點。He等[3]研究發(fā)現(xiàn)，從骨骼肌糖代謝的角度顯示，自噬是運動鍛煉促進機體健康的重要生理機制，自噬缺陷還會引起骨骼肌糖、脂代謝異常，胰島素抵抗，造成耐力運動能力下降。通過自噬使降解后的氨基酸和代謝物得以循環(huán)利用是生物體的一種自我修復過程[4]。

有研究表明，在增齡性衰老進程中，機體異常細胞器增多，大自噬途徑超負荷，消耗了必要大自噬體；增齡性衰老過程中的氧化應激造成大自噬失能；以及老化引起的溶酶體內(nèi)蛋白水解酶活性進行性下降都可造成老年個體自噬的失代償[5，6]。活性氧（reactive oxy? gen species，ROS）作為胞內(nèi)的一種信號分子參與II型程序性細胞死亡[7]。如果過度激活自噬則可以導致細胞內(nèi)大量必要分子和細胞器被分解，從而誘導細胞死亡[8]。有氧運動產(chǎn)生適量的ROS通過機體抗逆鍛煉（hormesis or the hardness exercise）重建或加強了機體穩(wěn)態(tài)的緩沖能力（allostasis buffering capacity，ABC），即為一種抗逆鍛煉機制[9-11]。氧化-抗氧化的內(nèi)穩(wěn)態(tài)（oxidant-antioxidant homeostasis，OAH）可調(diào)控 ROS在一定水平[12]。長期規(guī)律性有氧運動本身是一種應激刺激，有氧運動這一應激因子對機體的作用非常符合抗逆鍛煉的基本特征，即適量的體育運動有益于增強體質(zhì)，而過度的體育運動則對機體有害。體育運動增強體質(zhì)和改善骨骼肌功能的過程是否為這樣的一種機制呢？本文探討規(guī)律性運動對骨骼肌肌纖維增齡性老化過程中的細胞凋亡與細胞自噬及其信號調(diào)控的作用機制，為老年性肌力衰退的防治提供研究資料。

1 材料與方法

1.1 實驗對象及分組

選取健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，3月齡20只（體重481.25± 22.17 g）、13月齡24只（體重547.75± 21.94 g）、22月齡24只（體重693.21± 68.85 g），均為SPF（Specific pathogen Free，SPF）級動物，動物許可證號：SCXK（湘）2009-0012。以國家標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，等級為A級。實驗期間室溫保持20～24℃，相對濕度為45%～55%。大鼠自由飲用燒開冷卻的自來水，并保持每天換飲水和適當添加飼料。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物管理條例等規(guī)定。

每個年齡組大鼠按體重隨機分組，分為青年對照組（young sedentary control group，Y-SED，n=10）、青年運動組（young aerobic exercise runner group，Y-EX，n=10）；中年對照組（middle age sedentary control group，M-SED，n=12）、中年運動組（middle age aero?bic exercise runner group，M-EX，n=12）；老年對照組（old age sedentary control group，O-SED，n=12）和老年運動組（old age aerobic exercise runner group，OEX，n=12）。經(jīng)過10周規(guī)律有氧運動后，大鼠實際年齡分別為6月齡、16齡和25月齡。

1.2 運動訓練方案

所有SD大鼠在實驗動物房內(nèi)適應性飼養(yǎng)2周后，采用杭州立泰科技有限公司研制的PT動物電動跑臺進行3天5～10 min適應性訓練，坡度0，速度10 m/min。中等強度規(guī)律有氧運動模型：參考本實驗前期動物實驗[13]，以及國內(nèi)張勇等研究報道[14]，以中年大鼠運動負荷為依據(jù)，運動強度相當于最大攝氧量（Maxi?mum oxygen consumption，VO2max）60%～65%逐漸遞增到70%～75%，采用PT動物電動跑臺，坡度0，實驗動物運動時間為期10周。青年、中年和老年大鼠的運動負荷均從每天速度以15 m/min跑臺運動15 min開始，第2周15 m/min速度不變，運動時間遞增5 min，第3周適當遞增運動強度速度增加3 m/min并延長時間5 min，第4周18 m/min速度不變運動時間遞增5 min。根據(jù)增齡性因素，第5周從速度和時間兩方面考慮遞增延續(xù)到第6周作為運動負荷固定的過渡運動期，前6周每周運動6天。后4周固定運動強度：青年組以25 m/min速度跑臺運動45 min，中年組以22 m/min速度跑臺運動40 min，老年組以20 m/min速度跑臺運動35 min，每周運動5天。

1.3 實驗取材與樣本制備

實驗方案結束后，腹腔注射10%水合氯醛溶液，按0.5 ml/100 g麻醉大鼠，使大鼠呈仰臥位于手術臺上，暴露胸腔。升主動脈灌注：生理鹽水（37℃）快速灌注5 min（60 ml）左右以移除血液，直到肝臟發(fā)白（防止殘留的血液導致非特異性染色）。取出大鼠比目魚肌，經(jīng)過液氮速凍后置于－80℃冰箱保存，用于免疫印跡等測試。

每組至少取3只大鼠用于石蠟切片樣本制作：上述升主動脈灌注完生理鹽水后，用4%多聚甲醛0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）（4℃）400～500 ml灌注固定。取組織繼續(xù)保存在4%多聚甲醛0.1 M磷酸緩沖液中4℃冰箱過夜（不要超過24 h），第2天轉(zhuǎn)移至30%蔗糖脫水，然后常規(guī)脫水、透明、進蠟、石蠟包埋。

1.4 蘇木精--伊紅HHEE（Haematoxylin and easin，HE）染色

常規(guī)脫蠟水化、蘇木素染色、1%的鹽酸酒精分色、5%的伊紅染色、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片和鏡檢。

1.5 TTUUNNEELL細胞凋亡檢測程序（In situ cell death de?tection kit--PPOODD法）ple PCI顯微圖像分析軟件測試每100個細胞中的平均陽性凋亡細胞數(shù)，即凋亡指數(shù)（Apoptosis Index，AI）。

1.6 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SSOODD）、輕鏈蛋白--IIIIII（light chhaaiinn，LLCC--Ⅲ）、自噬基因Beecclliinn 11和PPGGCC-- 11 α的免疫印跡測定

使用北京康為世紀科技有限公司動物細胞（組織）總蛋白抽提試劑盒（NO.CW0891），按照1︰99比例加入蛋白酶抑制劑混合物，按組織重量1︰10（g/ml）的比例加入組織蛋白抽提試劑并作冰上F6/10-6G型超細勻漿器勻漿處理；采用Bradford法測定蛋白含量，具體詳細參考說明書。

根據(jù)蛋白Marker、內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和目的蛋白分子量大小，盡量用一塊分離膠來完成檢測。采用碧云天生物技術研究所的Western blot試劑盒配分離膠和配濃縮膠。經(jīng)樣品制備、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后一抗孵育：用封閉液稀釋一抗，每張PVDF膜添加

應用TdT進行的末端反應即脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記技術（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。按原位細胞凋亡檢測試劑盒（In Situ Cell Death Detection Kit，POD）說明書操作。在普通光學顯微鏡下觀察，陽性凋亡細胞表現(xiàn)為細胞核呈棕黃色或棕褐色著染，部分胞漿也可因胞核DNA碎片溢出而呈陽性著染；正常非凋亡細胞和陰性對照細胞核被蘇木素復染成藍色，核相對較大，形態(tài)大小一致。根據(jù)下列標準確定著色陽性細胞為凋亡細胞：單個散在分布；具有凋亡的核形態(tài)；周圍無炎癥反應。對于缺乏凋亡核形態(tài)的陽性細胞，除非染色強度與背景有鮮明對比，且呈單個分布，否則不認為是凋亡細胞。光學顯微鏡（×400）下每張切片隨機觀察6個視野，每個視野至少500個細胞水平。以Sim?2 ml Abcam公司的SOD（～25 kDa，NO.ab13533，1︰2000）和PGC-1α（～105 kDa，NO.ab54481，1︰2000）一抗；美國Proteintech Group公司的LC-Ⅲ（～16 kDa，NO.12135-1-AP，1︰2000）和Beclin1（～60 kDa，NO.11306-1-AP，1︰2000）；內(nèi)參GAPDH一抗（～36 kDa，NO.10494-1-AP，1︰10000，購自美國 Proteintech Group公司）。二抗孵育：每張PVDF膜添加3 ml的Goat anti-Rabbit IgG（H&L）-HRP和Goat anti-Rat IgG（H&L）-HRP二抗（1︰50000，NO.10285-1-AP，美國Proteintech Group公司），室溫振搖2 h。化學發(fā)光與掃描：Western實驗中，HRP標記在二抗上，與一抗－靶蛋白復合物結合，再用SuperSignal底物進行發(fā)光檢測（Thermo公司提供，NO.32209），用天能5500化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照。圖象分析：采用美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）開發(fā)的Image J對Western blot條帶進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0統(tǒng)計學軟件處理。所有數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示；兩組內(nèi)比較采用t檢驗，顯著性水平為α=0.05，即Ρ＜0.05為具有顯著性差異，Ρ＜0.01為具有非常顯著性差異。

2 結果

2.1 增齡大鼠比目魚肌HHEE染色與細胞凋亡結果

2.1.1 HHEE染色

從圖1可以看出，從比目魚肌縱切面圖像來看，YSED和Y-EX兩組的肌纖維間隙和排列整齊相當；MSED排列基本整齊，肌纖維間隙較大，而M-EX肌纖維間隙比較勻稱，但略顯疏松，細胞核的分布明顯增多；O-SED組大鼠肌纖維的間隔大于O-EX組，O-EX的細胞核數(shù)量明顯增多。從比目魚肌橫切面來看，Y-SED和Y-EX兩組的肌纖維排列成束分布，Y-EX組成束排列緊密；M-SED組肌纖維排列比較凌亂，成束不明顯，而M-EX組肌纖維成束比M-SED組規(guī)則；O-EX組大鼠肌纖維成束明顯比O-SED組好，排列整齊規(guī)則。這表明規(guī)律有氧運動提高了增齡性大鼠比目魚肌肌纖維的成束和緊密程度。

圖1 各組大鼠比目魚肌HE染色顯微圖像

2.1.2 TTUUNNEELL結果

從圖2來看，骨骼肌肌纖維形態(tài)與HE染色呈現(xiàn)的一致，增齡對照與運動組的各組大鼠比目魚肌均出現(xiàn)陽性棕褐色或者棕黃色的細胞凋亡核，而正常細胞核被蘇木素染成藍色。

表1顯示各組大鼠比目魚肌凋亡發(fā)生率為100%。與Y-SED相比較，M-SED細胞凋亡指數(shù)增加了10.56%（Ρ＜0.05），而O-SED細胞凋亡指數(shù)增加了25.92%（Ρ＜0.01）；與M-SED相比較，O-SED增加了13.89%（Ρ＜0.05）。實施規(guī)律有氧運動后，各年齡運動組大鼠比目魚肌細胞凋亡指數(shù)顯著增加，分別增加了7.55%（Ρ＞0.05）、20.26%（Ρ＜0.05）和14.52%（Ρ＜0.05）。

表1 各組大鼠比目魚肌細胞凋亡發(fā)生率和凋亡指數(shù)比較

圖2 各組大鼠比目魚肌細胞凋亡TUNEL染色顯微圖像

2.2 各組大鼠比目魚肌SSOODD表達水平檢測結果

圖3顯示，與Y-SED組相比，M-SED組的SOD/GAPDH值顯著上升8%（Ρ＜0.05），而O-SED組的SOD/GAPDH值卻顯著低于Y-SED組（Ρ＜0.01）和MSED組（Ρ＜0.05）。實施規(guī)律有氧運動的M-EX組比M-SED組上升17.85%、O-EX組比O-SED組的SOD/GAPDH值顯著上升9%（Ρ＜0.05），但Y-EX組SOD/GAPDH比Y-SED組上升4%（Ρ＞0.05）。

2.3 各組大鼠比目魚肌細胞自噬因子Beecclliinn 11和LLCC--Ⅲ的檢測結果

圖4顯示，與Y-SED組相比，M-SED組的LC-Ⅲ/GAPDH值下降10%，O-SED組的LC-III/GAPDH值也下降46%，呈現(xiàn)增齡性降低趨勢，但均無統(tǒng)計學意義（Ρ＞0.05）。與安靜對照組相比較，實施規(guī)律有氧運動的各組LC-Ⅲ/GAPDH值均顯著上升，分別Y-EX上升70%、M-EX上升1.43倍、O-EX上升1.93倍（Ρ＜0.01），運動各組的LC-Ⅲ/GAPDH值呈現(xiàn)增齡性上升趨勢。

圖3 各組大鼠比目魚肌免疫印跡SOD/GAPDH結果比較

圖4 各組大鼠比目魚肌免疫印跡LC-Ⅲ/GAPDH結果比較

圖5顯示，與Y-SED組相比，M-SED組的Beclin1/GAPDH值顯著上升3.37倍（Ρ＜0.01），O-SED組的Be?clin1/GAPDH值也顯著上升1.05倍（Ρ＜0.01），卻OSED組比M-SED組顯著下降37.5%（Ρ＜0.05）。實施規(guī)律有氧運動的各組均顯著上升，其中Y-EX組比YSED組Beclin1/GAPDH值顯著上升2.75倍（Ρ＜0.01），而M-EX組比M-SED組上升19.04%、O-EX組比OSED組的Beclin1/GAPDH值顯著上升35.29%（Ρ＜0.05），運動各組的Beclin1/GAPDH值呈現(xiàn)增齡性降低趨勢。

圖5 各組大鼠比目魚肌免疫印跡Beclin1/GAPDH結果比較

2.4 各組大鼠比目魚肌PPGGCC-- 11 α信號轉(zhuǎn)導結果

圖6顯示，與Y-SED組相比，M-SED組PGC-1α/GAPDH值顯著上升20%（Ρ＜0.05），但O-SED組比YSED組和M-SED組的PGC-1α/GAPDH值分別顯著下降316%、500%（Ρ＜0.01）。與安靜對照組相比較，實施規(guī)律有氧運動的各組PGC-1α/GAPDH值均呈現(xiàn)上升趨勢，M-EX組與M-SED組相比PGC-1α/GAPDH值顯著上升9%（Ρ＜0.05），而O-EX組與O-SED組相比PGC-1α/GAPDH值顯著上升3.79倍（Ρ＜0.01）。

圖6 各組大鼠比目魚肌免疫印跡PGC-1α/GAPDH結果比較

3 討論

本實驗結果顯示各年齡安靜組大鼠比目魚肌細胞凋亡的增加呈現(xiàn)增齡性趨勢，而實施規(guī)律有氧運動后，各年齡運動組大鼠比目魚肌細胞凋亡指數(shù)顯著增加，分別增加了7.55%、20.26%和14.52%。課題組湯長發(fā)等[15]前期研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細胞的凋亡不但與運動強度有關，而且與肌纖維類型相關；細胞內(nèi)線粒體鈣離子濃度變化是運動誘發(fā)骨骼肌細胞凋亡的可能途徑。Boffi等[16]對純種馬進行了3個月的跑臺訓練，在肌肉活檢中發(fā)現(xiàn)，運動訓練組的肌細胞凋亡顯著性高于控制組（P＜0.001），并推測正是這一新生的更具生命力的細胞不斷代替凋亡的異常肌細胞的過程，是訓練導致體能增長的機制。老化的調(diào)節(jié)因子可通過調(diào)控自噬基因來延緩老化和延長壽命，自噬很可能是動物老化調(diào)控機制的關鍵因素[17，18]。本實驗結果顯示，LC-III呈現(xiàn)增齡性降低趨勢，而與安靜對照組相比較，實施規(guī)律有氧運動的各組LC-III均顯著上升（Ρ＜0.01），運動各組的LC-III/GAPDH值亦呈現(xiàn)增齡性上升趨勢。適宜運動誘導的細胞自噬可以清除細胞內(nèi)受損的物質(zhì)及細胞器，避免受損線粒體促凋亡因子蛋白的釋放，從而抑制細胞凋亡；細胞自噬可以為細胞提供能源物質(zhì)，促進機體運動能力的提高，有利于減少細胞凋亡而使其存活，從而使肌纖維數(shù)量得以維持，防止骨骼肌質(zhì)量因肌纖維數(shù)目減少而下降，對Sarcopenia的防治具有重要意義[19]。Lira等[20]進一步研究了自噬與運動適應的關系，指出運動誘導的骨骼肌適應和運動表現(xiàn)的提高需要自噬，基礎狀態(tài)下在氧化能力強的慢肌纖維自噬水平明顯比混合型肌纖維和快肌纖維高。

本實驗結果顯示，實施規(guī)律有氧運動的M-EX組比M-SED組、O-EX組比O-SED組的SOD/GAPDH值顯著上升。骨骼肌是體內(nèi)主要的氧化應激組織，在骨骼肌尤其是慢肌纖維內(nèi)線粒體含量豐富，而線粒體是主要的ROS來源。細胞通過自身抗氧化系統(tǒng)，如SOD、過氧化氫酶及時清除ROS，可保護線粒體不受損傷，SOD2基因（Mn-SOD）高表達或化學ROS清除劑能夠降低自噬水平[21]。本實驗結果顯示，大鼠比目魚肌MSED組Beclin1表達水平最顯著，實施規(guī)律有氧運動的各組Beclin1表達均顯著上升，運動各組Beclin1的表達水平呈現(xiàn)增齡性降低趨勢。Pattingre等[22，23]研究表明，Beclinl可通過與B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lympho?ma-2，Bcl-2）、紫外線輻射耐受相關基因（UV radia?tion resistance associated，UVRAG）、mVps34基因（The mammalian homologue of yeast vacuolar protein sort?ing defective 34）等因子組成復合物，在自噬誘導階段發(fā)揮關鍵作用；當細胞能量缺乏或受到氧化應激信號刺激時，Beclin l能通過減少與Bcl-2的相互作用，提高自噬水平。Furuya等[24]研究發(fā)現(xiàn)Beclin1可通過增強半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（caspase-9）的活性加強化療藥物CDDP誘導的人胃癌細胞MKN28發(fā)生凋亡，說明Beclin1作為自噬重要調(diào)控基因也參與了細胞凋亡的調(diào)控。但自噬活性過強則會過多降解胞漿中的蛋白質(zhì)與細胞器，從而導致II型程序性細胞死亡，甚至可能導致一系列疾病的產(chǎn)生。錢帥偉等[25]通過建立急性遞增負荷運動的時相性模型，檢測骨骼肌細胞自噬啟動階段關鍵基因Beclin1、膜螯合關鍵基因自噬相關基因-9（autophagy related gene 9，ATG9）、自噬泡延伸階段關鍵基因ATG7和LC-III表達的動態(tài)變化，探討自噬發(fā)生不同階段的關鍵基因在運動中的適應性情況。

本實驗結果顯示，與Y-SED組相比，M-SED組的PGC-1α表達水平顯著上升，但O-SED組比Y-SED和M-SED組的PGC-1α表達水平顯著下降（Ρ＜0.01）。與安靜對照組相比較，實施規(guī)律有氧運動的各組PGC-1α表達水平均呈現(xiàn)上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activat?ed receptorγ，PPARγ）是能量代謝過程中的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，其輔激活因子1（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator-1，PGC-1）可能在運動誘導骨骼肌的適應機制中起著重要作用，其已成為探索運動耐力提升的新的分子靶點[26]。Brault等[27]研究證明，PGC-1α的過表達能夠增加線粒體含量并且抑制肌萎縮；運動能夠增加線粒體的合成，提高線粒體功能，并且其產(chǎn)生的許多有益效應是通過PGC-1α來發(fā)揮作用的。漆正堂等[28]報道除ROS、一氧化氮（nitric oxide，NO）之外，線粒體還通過線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondri?al permeability transition pore，mPTP）釋放細胞色素C啟動細胞凋亡程序，通過H+／Ca2+交換調(diào)節(jié)胞漿內(nèi)鈣信號通路，通過蛋白輸入機制易位p53、PGC-1α、維生素D受體、Bax/Bad、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化蛋白-5（signal transduction and activator of transcription 5，Stat5）等信號蛋白激活或抑制細胞的某些生理過程。

4 小結

自噬與凋亡兩者之間的平衡穩(wěn)定關系影響著比目魚肌增齡性老化的發(fā)生發(fā)展，規(guī)律有氧運動對增齡性老化大鼠比目魚肌細胞自噬與凋亡的影響出現(xiàn)增齡性變化，其機制是通過激發(fā)Beclin1和PGC-1α信號通路參與調(diào)控而達到調(diào)節(jié)比目魚肌的生物學功能與改善骨骼肌老化。

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The Effects of Regular Aerobic Exercise on Soleus Apoptosis and Autophagy as well as PGC-1α Signal Regulation of Aging Rats

Liu Wenfeng1，2,Wei Xia1,Zhang Bingxia2,Yin Dazhong1，2,Tang Changfa1,Tang Lihua1,Chen Zongping1
1 Hunan Provincial Key Laboratory of Physical Fitness and Sports Rehabilitation,Hunan Normal University, Changsha 410012,China
2 The Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology of Ministry of Education,Hunan Normal University,Changsha 410081,China

Tang Changfa,Email：tangchangfa@sina.com

ObjectiveTo explore the effect of regular aerobic exercises on soleus apoptosis and au?tophagy as well as PGC-1 alpha(PGC-1α)signal regulation in aging rats.MethodsIn this study，3-month-old，13-month-old and 22-month-old specific pathogen free(SPF)male Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into a young(Y-SED),a middle-aged(M-SED)and an old-aged(O-SED) sedentary control group，and the corresponding young,middle-aged and old-aged aerobic exercise(YEX，M-EX and O-EX)groups.The 10-week regular moderate-intensity aerobic exercise intervention with progressive intensity was carried out in the EX groups,while the control groups were not given any intervention.Haematoxylin and easin(HE)staining was used to observe the morphological changes of muscular fibers horizontally and vertically.Western blotting was performed to decide the expression of superoxide dismutase(SOD),screen and verify the related signal pathways for the autophagy and apoptosis.TUNEL assay was used to measure apoptosis.ResultsThe regular aerobic exercise significant?ly improved the bundling and density of soleus muscle fibers,as well as the SOD expression.In con?trol groups apoptosis increased as the age increased,while that of Y-EX，M-EX and O-EX groups in?creased by 7.55%and 20.26%(Ρ＜0.05)and 14.52%(Ρ＜0.05)respectively.The LC-Ⅲ autophagy gene reduced with age in each sedentary group，but increased significantly(Ρ＜0.01)in regular aerobic exercise rats with age.Compared with the corresponding control groups，the expression of autophagy fac?tor Beclin1 increased significantly in EX groups(Ρ＜0.05),with most significant increase in Y-EX group.Compared with Y-SED group，the average expression of PGC-1 alpha in M-SED group in?creased，but that of O-SED group decreased significantly（Ρ＜0.01）compared to Y-SED and M-SED groups.Compared with the sedentary control groups，the average PGC-1 alpha expression in the group Y-EX and M-EX increased;but compared with O-SED group，that of O-EX group improved significant?ly(Ρ＜0.01).Conclusions The balance and stability between cell autophagy and apoptosis may influ?ence the development of aging in soleus.Cell autophagy and apoptosis in the soleus were changed in regular aerobic exercise rats with age,which may be involved in stimulating the expression of PGC-1 alpha signaling pathways to regulate and adjust the biological function and skeletal muscle ageing of so?leus.

regular aerobic exercise,apoptosis,cell autophagy,PGC-1

2016.01.31

國家自然科學基金（31271257）；國家高科技 863計劃（2008AA02Z411）；湖南省自然科學基金（11JJ6082和14JJ7035）；湖南教育廳優(yōu)秀青年基金（12B088）；湖南師范大學青年優(yōu)秀人才培養(yǎng)計劃（ET1507）共同資助

湯長發(fā)，Email：tangchangfa@sina.com