吳景冬,李皓桓

武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，武漢 430060

鞘氨醇激酶1修飾的脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)組織工程化骨成骨效果的影響*

吳景冬,李皓桓△

武漢大學(xué)人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，武漢 430060

目的 研究鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)修飾的脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSC)對(duì)組織工程化骨成骨能力的影響。方法 將從SD大鼠脂肪細(xì)胞中分離提取的ADSC分為對(duì)照組(CON組)與實(shí)驗(yàn)組(SPK1組)，分別感染10 MOI的CON和SPK1慢病毒，在感染病毒14 d后，分別使用茜素紅和油紅O染色，檢測(cè)A595 nm和A490 nm以判定成骨、成脂能力，檢測(cè)兩組成骨細(xì)胞堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性變化。構(gòu)建SD大鼠股骨缺損模型，在CON與SPK1兩組ADSC與β磷酸三鈣陶瓷(β-TCP)結(jié)合后，將組織工程骨填壓至缺損處，4、6周后X線檢測(cè)大鼠骨缺損修復(fù)情況，Western blot檢測(cè)SPK1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein，BMP7)表達(dá)變化。結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CON和SPK1慢病毒感染效率分別為94.4%、94.9%；CON和SPK1組SPK1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.73±0.10)vs.(1.29±0.17)，P<0.05；CON和SPK1組A595 nm分別為(0.20±0.02)vs.(0.41±0.01)，A490 nm分別為(0.72±0.01)vs.(0.51±0.02)，均P<0.05。CON與SPK1的ALP活性分別為(1.42±0.09)vs.(2.68±0.09)，P<0.01。在骨缺損修復(fù)中，第4周SPK1組大鼠骨缺損處形成的高密度組織面積顯著大于CON組，在第6周時(shí)SPK1組大鼠骨缺損治愈，而CON組則尚有缺損。CON和SPK1組在感染病毒48 h后BMP7相對(duì)表達(dá)量分別為(1.13±0.16)vs.(4.46±0.23)，P<0.05。結(jié)論 SPK1修飾的ADSC體外、體內(nèi)成骨能力增強(qiáng)，其機(jī)制可能與BMP7激活相關(guān)。

鞘氨醇激酶1； 脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞； 組織工程化骨； 成骨能力； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白7

各種形式的骨缺損如骨腫瘤的切除[1]、牙槽骨缺損[2]等在臨床上常見，而相應(yīng)的修復(fù)也一直是臨床亟待解決的問題，機(jī)體骨組織的修復(fù)是一個(gè)多因素作用的復(fù)雜過程，主要與骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族(bone morphogenetic proteins，BMP)有關(guān)[3]，近年來應(yīng)用組織工程化骨治療成為一個(gè)新的方向。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived stromal cells，ADSC)是一種起源于脂肪組織的干細(xì)胞，與間充質(zhì)干細(xì)胞相似，ADSC能夠分化為成骨、軟骨與脂肪細(xì)胞，與此同時(shí)ADSC還具有容易獲取、體外易擴(kuò)增培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)[4]，因此ADSC在組織工程骨中得到廣泛的應(yīng)用。然而ADSC實(shí)際應(yīng)用中依然存在新生血管少、成骨能力不足等缺點(diǎn)[5]，因此運(yùn)用特定的基因修飾ADSC來達(dá)到增強(qiáng)成骨能力成為研究的熱點(diǎn)。

鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPK1)是一種在鞘磷脂代謝通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用的激酶。多種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1(interleukin-1，IL-1)[6]、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)[7]、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[8]等能夠通過SPK1調(diào)節(jié)鞘氨醇-1-磷酸進(jìn)而改變骨組織代謝，包括抑制破骨細(xì)胞的分化成熟、破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞遷移[9]，SPK1甚至能夠通過力學(xué)刺激直接作用于骨細(xì)胞從而誘導(dǎo)骨組織重建[10]。因而，運(yùn)用SPK1修飾的ADSC對(duì)于組織工程化骨成骨的改善具有很好的前景。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，IgG、CD19、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司，SPK1、BMP7和GAPDH一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signal Technology公司，SPK1慢病毒過表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Vector BioLabs，β-TCP鈣磷陶瓷購(gòu)自上海組織工程中心，堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.2 ADSC的分離提取與鑒定

SD大鼠頸椎脫臼處死后，分離腹股溝脂肪組織，并使用剪刀盡量剪碎；加入5 mL 0.1%的Ⅰ型膠原酶，37℃搖床振搖45 min；DMEM+10%FBS完全培養(yǎng)液清洗3次，細(xì)胞種于相應(yīng)大小的平皿中，48 h后換液；得到的貼壁細(xì)胞消化后，PBS洗2次，分別標(biāo)記IgG、CD19、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105流式抗體，冰上孵育30 min，流式檢測(cè)熒光陽性細(xì)胞比率。

1.3 CON和SPK1慢病毒包裝純化

CON組載體使用空載pcdh-cmv-mcs-ef1-puro骨架質(zhì)粒構(gòu)建，SPK1組載體使用pcdh-cmv-mcs-ef1-puro骨架質(zhì)粒構(gòu)建，CON和SPK1過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒與PMD2G、psPAX2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，分別收集培養(yǎng)24、36、48 h病毒上清，PEG沉淀純化得到CON和SPK1慢病毒。

1.4 ADSC感染慢病毒與分組

大鼠ADSC分為CON和SPK1組，分別感染10 MOI(病毒∶細(xì)胞=10∶1)CON和SPK1過表達(dá)慢病毒，14 d后檢測(cè)ADSC成骨、成脂能力的變化。

1.5 蛋白印跡檢測(cè)

采用Western blot法，收集感染CON和SPK1慢病毒的ADSC細(xì)胞，使用RIPA裂解，并加入蛋白上樣緩沖液得到蛋白樣本，上樣量為20 μg，濃縮膠以80 V電泳50 min，分離膠以100 V電泳2 h，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入SPK1(1∶200)、BMP7(1∶200)和GAPDH(1∶200)一抗，4℃孵育過夜，二抗(1∶1 000)孵育2 h，ECL液顯影，Quantity One 1-D分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡條帶進(jìn)行定量測(cè)定。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白測(cè)定值/ GAPDH，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.6 ADSC成骨與成脂誘導(dǎo)染色

CON和SPK1組ADSC分別培養(yǎng)于成骨、成脂誘導(dǎo)液中，成骨誘導(dǎo)液配方為α-MEM+ 10%FBS、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油和100 nmol/L地塞米松，每3天換液，14 d后使用茜素紅染色確定成骨細(xì)胞。成脂誘導(dǎo)液配方為HD-DMEM+10%FBS、1 μmol/L地塞米松、10 μg/mL胰島素、200 μmol/L吲哚美辛和0.5 mmol/L IBMX，14 d后使用油紅O染色確定成脂細(xì)胞。所有誘導(dǎo)均設(shè)立復(fù)孔，在茜素紅和油紅O染色后，使用分光光度計(jì)分別檢測(cè)595 nm與490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值以確定成骨、成脂能力的變化。

1.7 ADSC細(xì)胞與β-TCP復(fù)合

將CON組和SPK1組ADSC取1×106個(gè)細(xì)胞，懸浮于30 μL完全培養(yǎng)液中，隨后接種于消毒后的β-TCP上，37℃、5% CO2靜置4 h后，待細(xì)胞貼附于β-TCP，將材料放置于96孔板中，隔2～3 d換液。

1.8 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書進(jìn)行，細(xì)胞感染病毒后14 d裂解取上清，加入到顯色底物溶液中，并設(shè)立空白對(duì)照，37℃孵育5～10 min，每孔加入100 μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)405 nm波長(zhǎng)處吸光度值來判定ALP活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.9 大鼠骨損傷模型的構(gòu)建以及ADSC療效評(píng)估

60只SD大鼠隨機(jī)分為CON、SPK1組、未處理組和單用β-TCP組，每組15只，使用3 mg/kg水合氯醛麻醉后，在股骨處做一縱切口，并分離肌肉以暴露股骨，使用外科錐做一2 mm×2 mm的股骨缺損，深至骨髓可見，并將組織工程骨即CON或SPK1細(xì)胞與材料的復(fù)合物填充至缺損處，同時(shí)設(shè)立未做任何處理組以及單用β-TCP組，縫合切口。4、6周后處死大鼠，使用X線檢測(cè)骨缺損的改變。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析，兩組間均數(shù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠ADSC的分離提取及純度測(cè)定

SD大鼠ADSC中CD19 0.128%、CD34 0.099%、CD11b 0.031%、CD45 0.132%、HLA-DR 0.017%，均為陰性；而CD73 98.4%、CD90 98.4%、CD105 97.9%，均為陽性，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ADSC中CD19、CD34、CD11b、CD45、HLA-DR、CD73、CD90、CD105陽性細(xì)胞的比例Fig.1 Percentages of CD19+，CD34+，CD11b+，CD45+，HLA-DR+，CD73+，CD90+，CD105+ ADSC detected by flow cytometry

2.2 CON和SPK1慢病毒的包裝純化與感染復(fù)數(shù)測(cè)試

流式細(xì)胞儀檢測(cè)CON和SPK1組紅色熒光蛋白R(shí)FP陽性細(xì)胞比例以確定感染效率，結(jié)果表明，CON組感染效率為94.4%，SPK1為94.9%(圖2A)；Western blot檢測(cè)SPK1蛋白水平的變化，結(jié)果表明在CON和SPK1組的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為(0.63±0.10)vs.(1.29±0.17)，P<0.05(圖2B)。

2.3 SPK1過表達(dá)對(duì)ADSC成骨、成脂能力的影響

相對(duì)于CON組，SPK1組ADSC分化偏向成骨，而成脂則相對(duì)變少(圖3A)；CON和SPK1 ADSC成骨能力A595 nm分別為(0.20±0.02)vs.(0.41±0.01)，P<0.05，成脂能力A490nm分別為(0.72±0.01)vs.(0.51±0.02)，P<0.05(圖3B)；進(jìn)一步測(cè)定成骨細(xì)胞標(biāo)志酶ALP活性的變化，結(jié)果表明CON與SPK1 ALP活性分別為(1.42±0.09)vs.(2.68±0.09)，P<0.01(圖3C)。

2.4 SPK1過表達(dá)增強(qiáng)組織工程化骨成骨能力

CON和SPK1組ADSC與β-TCP結(jié)合后將組織工程化骨填壓到SD大鼠股骨缺損處，在4、6周后處死SD大鼠，X線檢測(cè)大鼠骨缺損的修復(fù)狀況后發(fā)現(xiàn)，在第4周時(shí)，SPK1組大鼠骨缺損處形成的高密度組織面積顯著大于CON組，在第6周時(shí)SPK1組大鼠骨缺損基本治愈，而CON組則尚有缺損，未處理組與單用β-TCP組無明顯修復(fù)痕跡(圖4A)。同時(shí)CON和SPK1感染ADSC 48 h使用Western blot檢測(cè)BMP7變化后發(fā)現(xiàn)，CON和SPK1組相對(duì)表達(dá)量分別為(1.13±0.16)vs.(4.46±0.23)，P<0.05(圖4B)。

ADSC細(xì)胞分別感染10 MOI的CON和SPK1慢病毒48 h后，A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)RFP陽性細(xì)胞比例；B：Western blot檢測(cè)SPK1的表達(dá)圖2 SPK1過表達(dá)慢病毒感染效率及表達(dá)水平檢測(cè)Fig.2 Measurement of infection efficiency and expression of SPK1 over-expression lentivirus

A：使用茜素紅和油紅O染色檢測(cè)CON與SPK1組ADSC成骨、成脂的變化;B：在A595 nm和A490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)CON與SPK1組ADSC成骨成脂能力;C：CON與SPK1組ALP活性比較；*P<0.05 **P<0.01圖3 SPK1過表達(dá)對(duì)于組織工程化骨細(xì)胞成骨、成脂的影響Fig.3 Impact of SPK1 overexpression on osteogenic and adipogenic ability of tissue-engineered bone cells

A：復(fù)合物植入到骨缺損的SD大鼠中，分別在4、6周處死大鼠，X線檢測(cè)骨缺損的修復(fù)情況，箭頭所示為骨缺損處修復(fù)情況;B：48 h后Western blot檢測(cè)CON與SPK1組ADSC中BMP7的表達(dá)圖4 SPK1對(duì)ADSC體內(nèi)成骨的影響Fig.4 Effect of SPK1 on osteogenesis of ADSC in vivo

3 討論

在骨損傷的治療中，應(yīng)用組織工程化骨已經(jīng)能夠起到很好的效果。組織工程化骨的構(gòu)建過程為，首先得到分離純化的種子細(xì)胞如間充質(zhì)干細(xì)胞，體外誘導(dǎo)成骨并擴(kuò)大培養(yǎng)后，種植于合適的支架材料中，并將細(xì)胞與支架材料的復(fù)合物植入到骨缺損部位[11]。影響組織工程化骨的主要因素為種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子及支架材料[12]，其中種子細(xì)胞起到至關(guān)重要的作用。組織工程化骨中的細(xì)胞可分為分化成熟的細(xì)胞及未分化的干細(xì)胞兩種，在分化成熟的細(xì)胞中，細(xì)胞的可用性極其有限，因此，研究主要集中于間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用[13]。對(duì)于組織工程化骨的改進(jìn)主要集中于通過種子細(xì)胞的選擇、支架材料的選擇、運(yùn)用基因修飾、細(xì)胞因子等方法更有效地促進(jìn)種子細(xì)胞的成骨分化[14]。ADSC近年來在組織工程化骨中的作用已被廣泛認(rèn)可，然而在實(shí)際的應(yīng)用中，依然存在著成骨能力弱、新生血管少等問題。因此，針對(duì)特定基因進(jìn)行修飾，改善種子細(xì)胞如ADSC的生物學(xué)指標(biāo)以完善組織工程化骨成為研究的熱點(diǎn)，如在Lieberman等[15]的研究中，BMP-2過表達(dá)腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠基質(zhì)細(xì)胞后，能夠修復(fù)自體股骨8 mm大小的節(jié)段性缺損。目前對(duì)于ADSC的基因修飾主要集中于BMP及其相關(guān)蛋白，針對(duì)BMP蛋白的修飾盡管能夠改善ADSC的成骨特性[16]，單一BMP的修飾如BMP2、BMP7的修飾并不能夠收到滿意的效果[17]，而聯(lián)合表達(dá)BMP2、BMP7則會(huì)增加可變因素從而限制臨床的應(yīng)用，因此尋求新的靶點(diǎn)修飾ADSC成為必要。

在本研究中，首先從SD大鼠腹股溝脂肪組織中分離提取ADSC，在使用流式細(xì)胞儀對(duì)ADSC常見標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)后，確定了分離的ADSC具有很高的純度，同時(shí)包裝、純化SPK1過表達(dá)慢病毒，在使用10 MOI感染ADSC后，分別通過流式細(xì)胞儀、Western blot確定了SPK1慢病毒對(duì)于ADSC具有很高的感染效率，且能夠在蛋白水平顯著促進(jìn)SPK1的表達(dá)。ADSC在感染SPK1病毒14 d后分別使用茜素紅和油紅O染色檢測(cè)ADSC成骨、成脂能力的變化，結(jié)果表明SPK1的表達(dá)增高使得ADSC成骨能力增加、成脂能力減弱，ADSC成骨、成脂平衡得到改變，SPK1 ADSC在A595 nm的升高和A490 nm的降低也印證了這一點(diǎn)，而SPK1組成骨細(xì)胞標(biāo)志酶ALP活性也明顯高于CON，進(jìn)一步證實(shí)了ADSC-SPK1組成骨能力的增加，因此，SPK1對(duì)ADSC體外成骨能力的促進(jìn)得到證實(shí)。隨后將CON和SPK1 ADSC與β-TCP復(fù)合，使用SD大鼠骨缺損模型觀察成骨效果后發(fā)現(xiàn)，從第4周開始，SPK1組大鼠骨缺損修復(fù)明顯優(yōu)于CON組，且在第6周SPK1組完全愈合，而CON組骨缺損依然存在，進(jìn)一步證實(shí)了SPK1組骨缺損修復(fù)優(yōu)于CON組，在ADSC感染CON和SPK1慢病毒48 h時(shí)，使用Western blot檢測(cè)BMP7的變化后發(fā)現(xiàn)，BMP7表達(dá)顯著上調(diào)，提示SPK1對(duì)于骨缺損修復(fù)的促進(jìn)可能與BMP7的上調(diào)有關(guān)。

[1] Yang Z，Jin L，Tao H，et al.Reconstruction of large tibial bone defects following osteosarcoma resection using bone transport distraction：A report of two cases[J].Oncol Lett，2016，12(2)：1445-1447.

[2] Iviglia G，Cassinelli C，Torre E，et al.Novel bioceramic-reinforced hydrogel for alveolar bone regeneration[J].Acta Biomater，2016，44：97-109.

[3] Badieyan Z S，Berezhanskyy T，Utzinger M，et al.Transcript-activated collagen matrix as sustained mRNA delivery system for bone regeneration[J].J Control Release，2016，239：137-148.

[4] Li S，Hu C，Li J，et al.Effect of miR-26a-5p on the Wnt/Ca2+pathway and osteogenic differentiation of mouse adipose-derived mesenchymal stem cells[J].Calcif Tissue Int，2016，99(2)：174-186.

[5] 王之發(fā)，翁雁鳴，劉彥普，等.兔骨髓干細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞體外成骨能力的比較[J].口腔頜面外科雜志，2013，23(1)：8-13.

[6] Yu H，Yuan L，Xu M，et al.Sphingosine kinase 1 improves cutaneous wound healing in diabetic rats[J].Injury，2014，45(7)：1054-1058.

[7] Yester J W，Bryan L，Waters M R，et al.Sphingosine-1-phosphate inhibits IL-1-induced expression of C-C motif ligand 5 via c-Fos-dependent suppression of IFN-β amplification loop[J].Faseb J，2015，29(12)：4853-4865.

[8] Park E S，Choi S，Shin B，et al.Tumor necrosis factor(TNF)receptor-associated factor(TRAF)-interacting protein(TRIP)negatively regulates the TRAF2 ubiquitin-dependent pathway by suppressing the TRAF2-sphingosine 1-phosphate(S1P)interaction[J].J Biol Chem，2015，290(15)：9660-9673.

[9] 賽巖，代學(xué)強(qiáng)，白紀(jì)民，等.鞘氨醇激酶通過調(diào)控血管發(fā)生促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[J].中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2012，7(3)：171-176.

[10] Rose F R，Oreffo R O.Bone tissue engineering：hope vs hype[J].Biochem Biophys Res Commun，2002，292(1)：1-7.

[11] Ho S S，Vollmer N L，Refaat M I，et al.Bone morphogenetic protein-2 promotes human mesenchymal stem cell survival and resultant bone formation when entrapped in photocrosslinked alginate hydrogels[J].Adv Healthc Mater，2016，5(19)：2501-2509.

[12] Lee D E，Kim J H，Choi S H，et al.The sphingosine-1-phosphate receptor 1 binding molecule FTY720 inhibits osteoclast formation in rats with ligature-induced periodontitis[J].J Periodontal Res，2016,doi:10.111/jre.12366.

[13] Zhang J N，Zhao Y，Liu C，et al.The role of the sphingosine-1-phosphate signaling pathway in osteocyte mechanotransduction[J].Bone，2015，79：71-78.

[14] Wong R W K，Rabie A B M.Early healing pattern of statin-induced osteogenesis[J].Br J Oral Maxillofac Surg，2005，43(1)：46-50.

[15] Lieberman J R，Daluiski A，Stevenson S，et al.The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats[J].J Bone Joint Surg Am，1999，81(7)：905-917.

[16] Ma P X.Biomimetic materials for tissue engineering[J].Adv Drug Deliver Rev，2008，60(2)：184-198.

[17] Sun P，Wang J，Zheng Y，et al.BMP2/7 heterodimer is a stronger inducer of bone regeneration in peri-implant bone defects model than BMP2 or BMP7 homodimer[J].Dent Mater J，2012，31(2)：239-248.

(2016-09-23 收稿)

Impact of SPK1 Modified ADSC on Osteogenesis of Tissue Engineered Bone

Wu Jingdong，Li Haohuan△

DepartmentofBoneandJointSurgery，RenmingHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China

Objective To investigate the impact of sphingosine kinase 1(SPK1) modified adipose tissue-derived stromal cells(ADSC)on tissue engineered bone osteogenesis.Methods ADSC cells isolated from SD rat fat cells were divided into CON group and SPK1 group，and then the cells were respectively infected with 10 MOI CON and SPK1 lentivirus for 48 h.The infection efficiency was confirmed by using flow cytometry.Alizarin red and oil red O was used to stain the cells 14 days after ADSC infection，and osteogenic and adipogenic ability was evaluated by detectingA595 nmandA490 nm.In the meantime，the activity change of alkaline phosphatase(ALP)was detected.The SD rat femoral defect model was created，and then after combining ADSC with β-TCP，the tissue engineered bone was pressed to the defect site.The repairment of bone defect was detected by X-ray in 4，6 weeks.After infection of CON and SPK1 virus，bone morphogenetic protein(BMP7)expression in ADSC of these two groups was detected.Results The infection efficiency of CON and SPK1 lentivirus was 94.4%vs.94.9% respectively by flow cytometry.The SPK1 protein expression level in CON group and SPK1 group was (0.73±0.10)vs.(1.29±0.17)(P<0.05).TheAvalue of CON and SPK1 group at 595 nm was (0.20±0.02)vs.(0.41±0.01)(P<0.05)，respectively.TheAvalue of CON and SPK1 group at 490 nm was (0.72±0.01)vs.(0.51±0.02)(P<0.05)，respectively.The expression level of ALP in CON and SPK1 group was (1.42±0.09)vs.(2.68±0.09)(P<0.01)，respectively.In the repairment of bone defect，high density tissue at rat bone defect was significantly larger in SPK1 group than in CON group in 4 weeks，and in 6 weeks，bone defect of SPK1 group was healed，but CON group still had defect.The expression level of BMP7 in CON and SPK1 group was (1.13±0.16)vs.(4.46±0.23)(P<0.05)，respectively，48 h after infection.Conclusion SPK1 modified ADSC has an enhanced osteogenesis abilityinvitroandinvivo，which was related to the activation of BMP7.

sphingosine kinase 1； adipose tissue-derived stromal cells； tissue engineered bone； osteogenesis； bone morphogenetic protein 7

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81171760)

吳景冬，男，1976年生，副主任醫(yī)師，E-mail：377181369@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：lihaohuan@139.com

R681.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.011