董玲玲，玉素甫·買買提，王昶文，黃 韜△，克力木·阿不都熱依木△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，武漢 4300222新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院微創(chuàng)外科，烏魯木齊 830001

Src表達與甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的相關性研究*

董玲玲1，玉素甫·買買提2，王昶文1，黃 韜1△，克力木·阿不都熱依木2△

1華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，武漢 4300222新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院微創(chuàng)外科，烏魯木齊 830001

目的 研究甲狀腺乳頭狀癌組織中Src的表達與中央?yún)^(qū)淋巴結轉移及其他臨床病理特征的相關性。方法 采用組織芯片和免疫組織化學技術對88例甲狀腺乳頭狀癌患者組織標本中的Src進行檢測。采用卡方檢驗分析Src的表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的關系，采用Logistic回歸模型分析中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的危險因素。所有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。結果 88例甲狀腺乳頭狀癌組織中Src陽性率為43.2%，在中央?yún)^(qū)淋巴結轉移陽性組，Src陽性率為65.0%，卡方檢驗結果表明Src的表達與中央?yún)^(qū)淋巴結轉移、TNM分期顯著相關(均P<0.05)，Src的表達與年齡、性別、腫瘤大小、癌灶多少、甲狀腺包膜浸潤無相關關系(均P>0.05)。Logistic回歸分析結果顯示Src陽性是甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的獨立危險因素(P<0.05)。結論 Src的表達與甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移密切相關，檢測Src表達水平可能有助于臨床決策，Src抑制劑或可作為甲狀腺乳頭狀癌術后頸部淋巴結復發(fā)和轉移的新型靶向治療藥物。

甲狀腺乳頭狀癌； 中央?yún)^(qū)淋巴結轉移； Src； 組織芯片

甲狀腺乳頭狀癌是甲狀腺癌中最常見的病理類型，自然病史長，預后好，手術治療效果最佳。在甲狀腺乳頭狀癌患者中，超過一半的患者初診即發(fā)現(xiàn)頸部中央?yún)^(qū)淋巴結轉移[1]。甲狀腺切除聯(lián)合頸部中央?yún)^(qū)淋巴結清掃成為甲狀腺乳頭狀癌經(jīng)典的手術方式。目前的爭議在于，術前影像學評估為cN0的甲狀腺乳頭狀癌患者是否有必要在甲狀腺切除的同期手術中聯(lián)合預防性中央?yún)^(qū)淋巴結清掃[2]。年齡大于45歲，伴有頸部淋巴結轉移的患者總生存期顯著下降[3]，提示甲狀腺乳頭狀癌術后頸部淋巴結的轉移和復發(fā)需密切隨訪。找到一個預測頸部淋巴結轉移的生物學指標，可能有助于臨床決策。Src是由c-Src原癌基因編碼的蛋白質，是Src激酶家族的成員，參與癌細胞的增殖、分化、侵襲[4]及上皮細胞-間充質轉換[5]。在甲狀腺乳頭狀癌小鼠模型中應用Src抑制劑，癌細胞的生長、浸潤及遠處轉移受到顯著抑制，患病小鼠總生存期顯著延長[6]，但是Src的表達與甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的相關性并不明確。我們采用組織芯片和免疫組織化學技術，探討Src的表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征及中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

組織芯片購自上海國家生物芯片工程公司，原發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌患者的病理標本88例。在每個甲狀腺乳頭狀癌組織的外圍取1個直徑1.5 mm的標本，注意避免壞死的腫瘤組織，這些標本組成組織芯片隊列，采用免疫組織化學染色法檢測癌組織中Src的表達水平。所有患者具有完整的臨床病理資料，發(fā)病年齡14～91歲，平均年齡(49.8±13.9)歲。所有患者行甲狀腺切除聯(lián)合頸部中央?yún)^(qū)淋巴結清掃術，術前均沒有頭頸部手術史及其他惡性腫瘤病史、放療史，術前檢查均未發(fā)現(xiàn)遠處轉移，術后切除組織全部送檢，病理診斷均為甲狀腺乳頭狀癌，病理分期全部采用2010年美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)第7版TNM分期法。

1.2 免疫組織化學染色方法

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法檢測甲狀腺乳頭狀癌組織中Src的表達。實驗用Src抗體來自CST公司，SP免疫組織化學試劑盒來自Dako公司。已知的陽性組織切片作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。實驗步驟：①脫蠟，梯度乙醇水化；②內源性過氧化物酶阻斷劑37℃孵育10 min，PBS洗滌3次，每次5 min；③枸櫞酸緩沖液(pH6.0)中煮沸15～20 min，自然冷卻20 min，快速冷卻至室溫，PBS洗滌3次，每次5 min；④滴加正常血清封閉液，37℃孵育10 min，滴加Src單抗，4℃冰箱孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加生物素標記二抗，37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加SP試劑，37℃孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min；⑤滴加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，蘇木精復染，脫水，封片，顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學結果判定

由2位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對所有標本進行獨立的結果判定，此過程采用雙盲法。根據(jù)切片陽性細胞率(陽性細胞占標本腫瘤細胞百分比)和陽性細胞著色強度分別記分；陽性細胞中核膜和胞質染色為棕黃色，陽性細胞率：0～記1分，11%～記2分，34%～記3分，≥67%記4分；細胞著色強度：未著色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。將上述兩項得分相加即為標本的Src免疫組織化學評分，4～7分記為Src陽性表達，0～3分記為Src陰性表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)分析均采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。應用描述性統(tǒng)計分析88例甲狀腺乳頭狀癌患者的臨床病理特征，應用χ2檢驗和Fisher精確概率法分析組間差異，建立Logistic二元回歸模型進行單因素、多因素分析并計算風險比(HR)，評價臨床病理特征及Src的表達對于甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的風險，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌組織中Src的表達

共88例甲狀腺乳頭狀癌患者納入本研究，根據(jù)免疫組化檢測結果將患者分為Src陽性組和Src陰性組，Src染色陽性反應以胞膜為主，呈棕黃色顆粒，見圖1。

A：甲狀腺乳頭狀癌中Src陰性表達；B：甲狀腺乳頭狀癌中Src陽性表達圖1 Src在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.1 Expression of Src in papillary thyroid carcinoma(immunohistochemical staining,×400)

2.2 甲狀腺乳頭狀癌組織中Src的表達與臨床病理特征的關系

本研究中，38例甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織中Src表達陽性，50例甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織中Src表達陰性，Src陽性率43.2%。Src的表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的相關性分析結果見表1。在40例中央?yún)^(qū)淋巴轉移陽性患者中，Src陽性率為65.0%，在48例中央?yún)^(qū)淋巴結轉移陰性患者中Src陽性率為25.0%，卡方檢驗顯示Src的表達與中央?yún)^(qū)淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)。與病理分期Ⅰ～Ⅱ期的患者相比，病理分期Ⅲ～Ⅳ期的患者Src陽性率較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Src的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、癌灶多少、甲狀腺包膜浸潤無相關性(均P>0.05)。

表1 Src的表達與88例甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理特征的關系Table 1 Relationship between Src expression and clinicopathological characteristics of papillary thyroid carcinoma in 88 patients

a：皮爾遜卡方；b：Fisher精確概率法

2.3 甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移危險因素的單因素、多因素分析

使用Logistic二元回歸模型分析甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的風險因素，結果見表2。我們分析了年齡、性別、腫瘤大小、癌灶多少、甲狀腺包膜浸潤與中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的關系，單因素及多因素分析結果顯示，Src陽性是甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的獨立危險因素(P<0.05)，年齡≥45歲是中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的非獨立危險因素(P<0.05)，而性別、腫瘤大小、癌灶多少、甲狀膜包膜浸潤不能顯著影響甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移(均P>0.05)。

表2 甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移危險因素的二元Logistic回歸分析Table 2 Logistic regression analysis of risk factors for central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma

HR：風險比；CI：可信區(qū)間

3 討論

Elsberger等[7]的研究結果顯示，Src在乳腺癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等多種實體腫瘤中高表達，與腫瘤的不良預后密切相關。Cho等[8]報道，Src的表達在甲狀腺癌灶中顯著上調，與甲狀腺良性病灶中Src的表達有顯著差異(60%vs.0%，P<0.05)。本研究中Src陽性率為43.2%，低于相關文獻報道，可能是由于本研究中Src陽性表達的判斷標準相對嚴格，導致Src陽性表達率偏低。Src與多種細胞膜表面受體酪氨酸激酶相互作用，參與絲裂原活化蛋白激酶信號通路、信號轉導和轉化激活因子3信號通路、磷酸肌醇-3激酶-蛋白激酶信號通路、FAK焦點黏著激酶信號通路等，以高度活化狀態(tài)參與癌細胞的分化、遷移、血管生成及存活[9]。在甲狀腺乳頭狀癌細胞中單獨使用Src抑制劑達沙替尼或者Si-Src可以顯著抑制癌細胞的生長和增殖[10]。王麗等[11]研究Src的表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征的相關性，發(fā)現(xiàn)Src的表達與腫瘤大小及頸部淋巴結轉移顯著相關。本研究結果顯示，Src的表達水平與甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移、TNM分期顯著相關，中央?yún)^(qū)淋巴結轉移陽性患者較淋巴結轉移陰性患者Src陽性率高，腫瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ期與Ⅰ～Ⅱ期的癌灶相比，Src陽性率顯著增加，進一步說明Src高表達與甲狀腺乳頭狀癌細胞的發(fā)生、發(fā)展及浸潤有關，這與多數(shù)研究結果一致[6-11]。但是在本研究中，Src陽性與腫瘤大小、癌灶多少、甲狀腺包膜浸潤不相關，與部分研究結果不符[11-12]，可能是由于實驗取材位置距離甲狀腺乳頭狀癌腫瘤中心的遠近不等所致。

甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移陽性患者中Src高表達，推測Src陽性可能促進甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移。Ischenko等[13]研究表明在胰腺癌細胞中，Src抑制劑可以抑制孤立淋巴管上皮細胞的增殖和遷移能力，在淋巴管瘤小鼠體內，Src抑制劑可以減少新生淋巴管瘤的形成。由于腫瘤的淋巴結轉移與淋巴管生長關系密切，我們可以認為Src在腫瘤細胞淋巴結轉移過程中發(fā)揮了重要作用，并且，在前列腺原位癌裸鼠模型中，Src抑制劑達沙替尼被證實可以減少癌細胞淋巴結轉移的發(fā)生率[14]。在本研究中，單因素和多因素分析結果顯示，Src陽性表達是甲狀腺乳頭狀癌患者中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的獨立危險因素，進一步證實Src在甲狀腺乳頭狀癌中央?yún)^(qū)淋巴結轉移的過程中起到關鍵作用。此外，本研究結果顯示年齡≥45歲是甲狀腺乳頭狀癌頸部淋巴結轉移的非獨立危險因素，結合Zaydfudim等[3]的研究結果，對于年齡大于45歲的甲狀腺乳頭狀癌，必須警惕其頸部淋巴結轉移。

綜上所述，Src的表達與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤有關，Src高表達與頸部中央?yún)^(qū)淋巴結轉移關系密切。甲狀腺乳頭狀癌組織中Src高表達比Src低表達的患者在甲狀腺癌術后更加需要密切隨訪，警惕頸部淋巴結的轉移或復發(fā)，同時，Src抑制劑可能成為甲狀腺乳頭狀癌術后頸部淋巴結復發(fā)和轉移的新型靶向治療藥物。

[1] LiVolsi V A.Papillary thyroid carcinoma：an update[J].Mod Pathol，2011，24(Suppl 2)：S1-S9.

[2] Cisco R M，Shen W T，Gosnell J E.Extent of surgery for papillary thyroid cancer：preoperative imaging and role of prophylactic and therapeutic neck dissection[J].Curr Treat Options Oncol，2012，13(1)：1-10.

[3] Zaydfudim V，F(xiàn)eurer I，Griffin M，et al.The impact of lymph node involvement on survival in patients with papillary and follicular thyroid carcinoma[J].Surgery，2008，144(6)：1077-1078.

[4] Mayer E L，Krop I E.Advances in targeting SRC in the treatment of breast cancer and other solid malignancies[J].Clin Cancer Res，2010，16(14)：3526-3532.

[5] Liu W，Kovacevic Z，Peng Z，et al.The molecular effect of metastasis suppressors on Src signaling and tumorigenesis：new therapeutic targets[J].Oncotarget，2015，6(34)：35522-35541.

[6] Kim W G，Guigon C J，F(xiàn)ozzatti L，et al.SKI-606，an Src inhibitor，reduces tumor growth，invasion，and distant metastasis in a mouse model of thyroid cancer[J].Clin Cancer Res，2012，18(5)：1281-1290.

[7] Elsberger B.Translational evidence on the role of Src kinase and activated Src kinase in invasive breast cancer[J].Crit Rev Oncol Hematol，2014，89(3)：343-351.

[8] Cho N，Lin C，Du J，et al.Global tyrosine kinome profiling of human thyroid tumors identifies Src as a promising target for invasive cancers[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，421(3)：508-513.

[9] Roskoski R Jr.Src protein-tyrosine kinase structure，mechanism，and small molecule inhibitors[J].Pharmacol Res，2015，94：9-25.

[10] Henderson Y C，Toro-Serra R，Chen Y，et al.Src inhibitors in suppression of papillary thyroid carcinoma growth[J].Head Neck，2014，36(3)：375-384.

[11] 王麗，劉澤兵，羅金芳,等.c-src和c-met與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結轉移的關系[J].復旦學報：醫(yī)學版，2011，38(2)：131-135.

[12] Michailidi C，Giaginis C，Stolakis V，et al.Evaluation of FAK and Src expression in human benign and malignant thyroid lesions[J].Pathol Oncol Res，2010，16(4)：497-507.

[13] Ischenko I，Seeliger H，Camaj P，et al.Src tyrosine kinase inhibition suppresses lymphangiogenesisinvitroandinvivo[J].Curr Cancer Drug Targets，2010，10(5)：546-553.

[14] Park S I，Zhang J，Phillips K A，et al.Targeting SRC family kinases inhibits growth and lymph node metastases of prostate cancer in an orthotopic nude mouse model[J].Cancer Res，2008，68(9)：3323-3333.

(2016-10-18 收稿)

Relationship between Src Expression and Central Lymph Node Metastasis of Papillary Thyroid Carcinoma

Dong Lingling1，Yusufu Maimaiti2，Wang Changwen1etal

1DepartmentofBreastandThyroidSurgery，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China2DepartmentofGeneralSurgery(ResearchInstituteofMinimallyInvasion)，People’sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion，Urumqi830001，China

Objective To investigate the relationship between the expression of Src and clinicopathological characteristics，and evaluate influence of Src on central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.Methods Tissue microarray and immunohistochemistry technique were used to detect Src expression in papillary thyroid carcinoma tissues of 88 cases.Chi-square test was used to assess the relationship between Src expression and clinicopathological characteristics，and logistic regression model was used to investigate the risk factors for central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.All data were analyzed by using SPSS statistics version 22.0 software.Results In the papillary thyroid carcinoma tissues of 88 patients，Src positive rate was 43.2%，and in group of patients with central lymph node metastasis，Src positive rate was 65.0%.Chi-square test showed that Src expression was significantly associated with central lymph node metastasis(P<0.05)and TNM stage(P<0.05)，and Src expression was not significantly correlated with tumor age，gender，tumor size，cancer lesion number，or thyroid capsule invasion(allP>0.05).Logistic regression analysis showed Src was an independent risk factor for central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma(P<0.05).Conclusion Src expression is strongly linked to central lymph node metastasis of papillary thyroid carcinoma.Testing Src expression level may be helpful to decide therapeutic strategies and Src inhibitor may be a new target therapeutic drug for cervical lymph node recurrence and metastasis of postoperative papillary thyroid carcinoma.

papillary thyroid carcinoma； central lymph node metastasis； Src； tissue microarray

*華中科技大學自主創(chuàng)新基金資助項目(No.0118530088)

董玲玲，女，1990年生，碩士研究生，E-mail：lcyxdll@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：huangtaowh@163.com(黃 韜);E-mail：klm6075@163.com(克力木·阿不都熱依木)

R736.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.010