薛建利

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院骨三科，陜西 西安 710004)

Foxl2基因對小鼠軟骨及骨發(fā)育的調控研究

薛建利

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院骨三科，陜西 西安 710004)

目的 Foxl2轉錄因子單倍劑量不足會導致小瞼裂綜合征(blepharophimosis ptosis epicanthus inversus syndrome，BPES)，表現為眼瞼異常和卵巢功能早衰。小鼠Foxl2基因缺乏亦導致眼瞼、額頭缺陷和雌性性腺發(fā)育不全。本試驗旨在研究Foxl2缺乏對小鼠出生后的生長和胚胎期骨、軟骨形成的影響。方法 對比雄性Foxl2-/-與野生型小鼠在不同發(fā)育階段的特征，測量繪制生長曲線。骨骼用阿爾新蘭/茜素紅、硝酸銀染色，行免疫熒光分析和共聚焦顯微鏡下分析。RT-qPCR分析生長激素(growth hormone，GH)/胰島素樣生長因子1(insulin like grouth factor-1，IGF1)通路以評估下丘腦-垂體-骨軸上標記物的表達。結果 較之野生型小鼠，Foxl2敲除小鼠表現出較小體型、骨骼異常、軟骨和骨礦化缺陷、GH/IGF1軸下調。結論 Foxl2是生長發(fā)育、軟骨和骨形成的過程的主要轉錄因子。

Foxl2；骨發(fā)育；軟骨發(fā)育；小鼠

Foxl2基因位于細胞核內，是一個2.7 kb的單外顯子基因，位于3q23區(qū)域，其編碼蛋白質屬于forkhead轉錄因子家族，由376個氨基酸組成，包含一個由100個氨基酸構成的forkhead DNA結合區(qū)和一個多聚丙氨酸區(qū)[1]。Foxl2 (MIM # 605597)變異最初發(fā)現于一種常染色體顯性遺傳病[2]，小瞼裂綜合癥(blepharophimosis ptosis epicanthus inversus syndrome，BPES，MIM # 110100)，表現為眼瞼、前額異常和卵巢功能障礙所致原發(fā)性卵巢功能不全。Foxl2基因也被證實的在卵巢功能維持方面發(fā)揮重要作用[3]，是卵巢發(fā)育中的一種早期調節(jié)因子，Foxl2基因突變導致其編碼的蛋白質在聚丙氨酸區(qū)域前有截斷則發(fā)生BPES I型的風險高，可致女性患者不育，原發(fā)性閉經或提前絕經；若基因突變引起聚丙氨酸區(qū)域擴增可導致BPES Ⅱ型，男女皆可生育。有些病例還存在其他的異常，如智力低下、發(fā)育遲緩、心臟缺損、小頭及突出耳等。Foxl2-/-小鼠呈現的顱面部和性腺特征類似于人BPES，包括兩性眼瞼異常、卵泡發(fā)育不全所致雌性不育、睪丸決定基因上調(Sox9、Fgf9、Wt1、Gata4、Dhh、Sf1、Dmrt1和Fgfr2)和局部性反轉[4-6]。野生型小鼠交配后14.5 dpc，Foxl2即開始在卵巢顆粒細胞中表達。但敲除小鼠folxl2基因后可出現更多表型，如兩性體型減小，血漿胰島素樣生長因子1(insulin like grouth factor-1，IGF1)水平可降低60%。研究證實，Foxl2在垂體促性腺細胞(11.5 dpc)[7]、成人垂體促甲狀腺和促性腺細胞也有表達[8]，但foxl2基因缺失對體型及發(fā)育的影響機制尚無相關研究報道。

已有文獻報道Foxl2在眼瞼和卵巢發(fā)育中的作用，本試驗擬探索Foxl2對生長發(fā)育和頭面部、骨骼發(fā)育的影響，通過構建Foxl2-/-小鼠，對比雄性Foxl2-/-與野生型小鼠在不同發(fā)育階段的特征，研究foxl2基因缺失影響激素水平和生長發(fā)育的可能機制。

1 資料與方法

1.1 實驗動物建立 利用Cre/Loxp技術敲除小鼠促性腺組織中的FOXL2，建立Foxl2-/-小鼠[9]，實驗小鼠常規(guī)安置于溫度20～24℃、濕度50%～60%、12 h光暗循環(huán)的環(huán)境中，水、食物可自由獲取。小鼠通過二氧化碳窒息法處死。利用PCR基因分型方法檢測、驗證野生型和突變小鼠的FOXL2基因(公用引物b：GGATCTCTGAGTGCCAACGC，野生型序列識別引物a：CACGGGAAAGCAGAGGCCGC或c：CACACTGCTCGACATTGGGTG)。

1.2 生長曲線測繪 利用卡尺和分析天平分別測量同窩出生的三種雄性小鼠(WT、Foxl2+/-和Foxl2-/-)的身長、體重，分別于小鼠出生后0～100 d內測量，每周3次，每次時間點相同。用GraphPad 6軟件進行生長曲線繪制、回歸分析和特異性生長速率計算，標準t檢驗用于檢驗組內測量值的顯著性意義。

1.3 骨骼染色和影像學分析 新生、成年小鼠的骨骼用進行茜素紅/阿爾新蘭染色[10]，小鼠窒息致死后，使用Faxitron X-Ray機器進行X線攝像，觀察分析骨骼情況[11]。

1.4 組織學分析[4]取不同發(fā)育階段的胚胎(12.5 dpc，13.5 dpc，14.5 dpc，15.5 dpc，16.5 dpc)，在室溫下用Histochoice(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)固定液固定4～6 h，進行石蠟包埋、5μm連續(xù)切片。利用PCR反應擴增Y染色體性別決定區(qū)域(Sry)，僅選取雄性胚胎(SryF 5′-GTGGTGAGAGGCACAAGT-3′；SryR 5′-CTGTGTAGGATCTTCAATC-3′)。將切片先后行阿爾新蘭/茜素紅染色、硝酸銀染色，置于3%雙氧水中處理1 h，用1×檸檬酸鹽緩沖液和0.01 M EDTA(pH 8)洗滌，封閉液(Protein Block Serum-free，×0909，Dako，Glostrup，Denmar)室溫下封閉30 min，一抗4℃孵化過夜，再行免疫熒光檢測。相關抗體：1︰50兔抗-Foxl2(Eurogentec s.a.)，1︰500山羊抗兔IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)。Leica DMIRE激光共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.5 RT-qPCR分析 按RT-qPCR步驟，利用Trizol法抽提RNA，反轉錄獲得cDNA，將Gapdh設為內部參照，分析Foxl2表達情況。反轉錄前利用熒光綠實時定量PCR分析三個生物學樣本(野生型，P0和P7 Foxl2-/-)的RNAs，檢測Ghrh，Ghrh-r，Gh，Igf1基因，內部參照基因為β-actin。每次檢驗用10 ng cDNA和Universal TaqMan master mix 2X在測序點重復三遍，所有信號均可通過ABI PRISMR 7700系統(tǒng)檢測。

1.6 倫理聲明 本試驗的動物及操作符合西安交通大學附屬第二醫(yī)院動物保護和使用委員會要求，并符合全國實驗動物標準化技術委員會發(fā)布的《動物實驗通用要求》。針對實驗動物的使用方案和詳細的申請表格已獲西安交通大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會審核通過。

2 結 果

2.1 一般資料 既往文獻報道Foxl2-/-小鼠多于出生后不久就死亡[4]，幸存小鼠體型發(fā)育相對較小，血漿IGF1水平有所降低。我們的試驗擴大了樣本量，從而定量分析雌性小鼠生育能力和后代的存活、生長特征。Foxl2+/-雌性小鼠生育能力顯著降低，Foxl2-/-小鼠的一胎生仔數僅為野生型小鼠的40%。野生型和Foxl2-/-新生小鼠遵循孟德爾遺傳定律(χ2=3.51，185例新生小鼠)，但出生后可出現不明原因的驚厥樣發(fā)作，死亡率高達82%。為避免雌性小鼠激素水平影響表型造成偏倚，本試驗全納入雄性Foxl2-/-小鼠。

2.2 發(fā)育期生長加速遲緩導致Foxl2-/-成年小鼠體格減小 比較Foxl2-/-小鼠生長期間體型，同窩WT和Foxl2-/-小鼠出生時體重和身長相當。出生后100 d(P100)內，WT小鼠生長呈三相曲線(見圖1)，新生兒期生長加速，而后生長速率陡降，斷奶后又迎來生長突增。不同之處在于，WT小鼠在中間段的生長速率僅單純下降，Foxl2-/-小鼠此期卻出現生長停滯。并且，隨后的生長突增，WT小鼠開始于P12，Foxl2-/-小鼠延遲至P20。P20時，WT和Foxl2-/-小鼠的體重、身長已有顯著差異(P<0.05)，P100時Foxl2-/-小鼠的體重、身長分別比WT小鼠低29.4%、10.6%。根據連續(xù)時間點的小鼠體重繪制特異性生長速率圖，可見在P40內，WT小鼠的生長速率都高于Foxl2-/-小鼠，隨后變得不相上下，此后趨于穩(wěn)定。

2.3 Foxl2-/-小鼠生長激素(growth hormone，GH)/IGF1軸受損 Foxl2-/-小鼠的血清IGF1水平較低，本實驗又研究了變異小鼠GH/IGF1軸改變與異常生長發(fā)育是否存在相關性[4]。經RT-qPCR，P7時即可在WT小鼠的下丘腦、垂體和顱蓋骨檢測到Foxl2，肝臟中檢測不到。若下丘腦的Foxl2表達量定為1，則顱蓋骨和垂體的表達量分別是其10、244倍。在Foxl2-/-小鼠的同一組織內，比較下丘腦-垂體-骨軸上的標記物表達量，結果發(fā)現Foxl2-/-小鼠的下丘腦生長激素釋放激素上調，而垂體Ghrh受體和生長激素下調，而Igf1基因在顱蓋骨和肝臟中均可檢測到(見圖2)。

2.4 Foxl2-/-小鼠骨骼表型特征 新生同窩WT和Foxl2-/-小鼠僅可通過眼瞼發(fā)育不全加以區(qū)別，到2～3周時，Foxl2-/-小鼠開始出現短鼻和牙反合。牙反合隨門牙不斷增長而越發(fā)明顯，出生后13～15 d開始每兩天對其下門牙做修剪以利生存。

用阿爾新蘭/茜素紅進行骨架染色，發(fā)現Foxl2-/-小鼠骨骼形成異常。4周時，Foxl2-/-小鼠頭部明顯較短，上頜骨、前頜骨、鼻骨發(fā)育不足。因圓拱形的顱蓋骨、大小相對正常的下頜骨和其他面部小骨骼共同導致了明顯的牙反合(見圖3)。4周后，兩種小鼠出現體型差異，Foxl2-/-小鼠有明顯的脊柱過度前凸和后凸。通過放射顯影和茜素紅染色對比觀察到，Foxl2-/-和WT小鼠的體型和脊柱存在顯著差異，成年Foxl2-/-小鼠骨骼染色較WT小鼠顏色更淡，提示骨量減少(見圖4)。

2.5 Foxl2-/-小鼠存在骨骼發(fā)育遲緩和軟骨成熟缺陷 為探明新生和成年小鼠骨骼異常的緣由，我們檢測了WT和Foxl2-/-小鼠的胚胎。如圖5，交配后12.5 d(12.5 dpc)，經阿爾新蘭/核固紅和硝酸銀染色后發(fā)現，Foxl2-/-小鼠椎體致密度受損(vc)，椎間間質中(im)，間充質紊亂(mt、箭頭處)、細胞數少，且阿爾新蘭染色略顯蒼白，提示致密軟骨形成延遲或減少(見圖5)。14.5 dpc和15.5 dpc時，Foxl2-/-小鼠胸椎處(Mk)可見成熟軟骨排列紊亂，同時WT小鼠該處著色較深，提示其軟骨已開始鈣化(見圖6)。16.5dpc時Foxl2-/-小鼠椎體仍礦化不足(見圖7)。以上結果表明，Foxl2-/-小鼠存在骨骼發(fā)育延遲和軟骨成熟缺陷。

3 討 論

3.1 Foxl2通過GH/IGF1軸影響生長發(fā)育 GH以旁分泌形式存在于大多數組織中，其調節(jié)是機體生長和發(fā)育重要的生理過程，通過直接活化特定的GH受體或由肝臟產生IGF1間接應答GH刺激[12-13]。Gh和Igf1缺陷的小鼠模型出現生長缺陷，但除局部長骨礦化缺陷外并沒有顯著的骨骼異常[14]。

本試驗中，Foxl2-/-小鼠GH/IGF1軸活性降低可解釋兩種小鼠的生長曲線差異?？赡艿臋C制為，Gh負反饋調節(jié)Ghrh表達，Foxl2-/-小鼠垂體內缺乏Gh，因此下丘腦Ghrh上調，故Gh在Ghrh通路中的負反饋調節(jié)作用明顯減弱。而垂體中經Foxl2調節(jié)的Gh和Ghrh-r水平降低，也能解釋肝臟、骨骼、血清中IGF1水平降低。

a WT、Foxl2-/-小鼠出生后21～23 d(虛線所示)體重開始出現顯著差異 b WT、Foxl2-/-小鼠出生后10～30 d(虛線所示)生長速率(dW/dt)出現顯著差異 c WT、Foxl2-/-小鼠出生后10～30d(虛線所示)比時生長速率[(dW/dt)*(1/W)]有顯著差異

圖1 WT、Foxl2-/-小鼠出生后體重-生長曲線比較

a 下丘腦Ghrh上調 b 垂體Ghrh-r和Gh下調 c 顱蓋骨和肝臟中Igf 1下調

圖2 WT和Foxl2-/-小鼠的IGF1/GH軸基因表達比較

a 腹位像 b 側位放射顯象 c 側位茜素紅染色 d 背位示頭骨形態(tài)差異

注：白線示Foxl2-/-小鼠篩骨(et)缺失；箭頭示Foxl2-/-小鼠額骨隆起；i-人字形骨縫；s-矢狀縫；c-冠狀縫；if-額間縫

圖3 WT與Foxl2-/-成年小鼠頭蓋骨發(fā)育缺陷對比(標尺=1 cm)

a 放射顯影 b 茜素紅染色

圖4 WT和Foxl2-/-成年小鼠骨骼對比(標尺=1 cm)

注：vc-椎體致密度；im-椎間間質；mt-間充質

圖5 WT和Foxl2-/-小鼠胚胎軟骨形成比較(12.5 dpc，阿爾新蘭/核固紅和硝酸銀染色，×20，標尺=50 μm)

a WT小鼠胚胎軟骨細胞 b Foxl2-/-小鼠胚胎軟骨細胞

圖6 WT和Foxl2-/-小鼠胚胎的骨骼礦化分析(15.5 dpc，×200，標尺=5 μm)

a WT小鼠胚胎軟骨細胞 b Foxl2-/-小鼠胚胎軟骨細胞

圖7 注：np-髓核；vb-椎體WT和Foxl2-/-小鼠胚胎的骨骼礦化分析(16.5 dpc，×200，標尺=5 μm)

3.2 Foxl2對顱面部和骨骼發(fā)育的影響 顱骨間質分化自頭部軸旁中胚層和顱神經嵴兩個不同的胚胎來源，Foxl2-/-小鼠顱面部和骨骼異常表型和骨化受損與神經管上皮細胞和頭部間質細胞在9.5 dpc時Foxl2表達缺失有關。這些細胞作為多潛能細胞群，可以分化出許多不同的細胞類型，包括面部軟骨和骨[15]。神經管上皮細胞和頭部間質細胞中有Foxl2表達，提示Foxl2參與上皮到間充質的轉變和間充質細胞分化成軟骨細胞和成骨細胞的過程。

根據對Foxl2-/-小鼠模型的全面研究，我們發(fā)現Foxl2不僅在卵巢和眼瞼發(fā)育過程中發(fā)揮作用，還可通過GH/IGF1軸特異調節(jié)小鼠生長發(fā)育。盡管配對的WT和Foxl2-/-小鼠均存在由基因差異引起的骨骼表型差異，但Foxl2是直接還是間接地參與這些調節(jié)尚不明確。Foxl2在顱面部、骨和軟骨的發(fā)育過程中復雜的調節(jié)機制，有待今后進一步研究。

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Modulations of FOXL2 on Cartilage and Skeletal Development in Mice

Xue Jianli

(The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China)

Objective Haploinsufficiency of the Foxl2 transcription factor in humans causes Blepharophimosis/Ptosis/Epicanthus Inversus syndrome(BPES)，characterized by eyelid anomalies and premature ovarian failure.Mice lacking Foxl2 recapitulate human eyelid/forehead defects and undergo female gonadal dysgenesis.Our experiment aims to explore the influence of lacking Foxl2 in postnatal growth and embryonic bone and cartilage formation in mice.Methods Foxl2-/-male mice at different stages of development have been characterized and compared to wild type.Body length and weight were measured and growth curves were created.Skeletons were stained with alcian blue and/or alizarin red.Bone and cartilage formation was analyzed by Von Kossa staining and immunofluorescence using anti-Foxl2 antibodies followed by confocal microscopy.Analysis of the GH/IGF1 pathway was done evaluating the expression of several hypothalamic-pituitary-bone axis markers by RT-qPCR.Results Compared to wild-type，Foxl2 null mice are smaller and show skeletal abnormalities and defects in cartilage and bone mineralization，with down-regulation of the GH/IGF1 axis.Conclusion Our results support Foxl2 as a master transcription factor in a spectrum of developmental processes，including growth，cartilage and bone formation.

foxl2；bone development；cartilage development；mice

陜西省社會發(fā)展科技攻關項目(2016SF-187)

1008-5572(2017)02-0142-05

R322.7+1

A

2016-03-18

薛建利(1981- )，男，主治醫(yī)師，西安交通大學第二附屬醫(yī)院骨三科，710004。

薛建利.Foxl2基因對小鼠軟骨及骨發(fā)育的調控研究[J].實用骨科雜志，2017，23(2)：142-146.

實驗研究