王 倩， 關(guān) 磊， 林 嬌， 陳韋羽， 梁興國， 李 敬??

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

利用天然核酸制備的多層水凝膠球及其性能研究*

王 倩1， 關(guān) 磊2， 林 嬌2， 陳韋羽2， 梁興國2， 李 敬2??

(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003)

為了開發(fā)天然安全、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的細(xì)胞包埋載體，本研究初次選取天然鮭魚精DNA作為材料，層層自組裝構(gòu)建DNA/殼聚糖/海藻酸鈣多層水凝膠球。通過顯微鏡及掃描電鏡觀察水凝膠球結(jié)構(gòu)，并表征其性能，透析法評(píng)價(jià)其在模擬消化液中的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示水凝膠球形態(tài)圓整，膜層清晰，平均粒徑為(2.7±0.1) mm，凍干脫水后球體內(nèi)部呈大孔網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，外膜層致密無孔隙。該水凝膠球失水產(chǎn)生明顯形變而復(fù)水后恢復(fù)原有形狀；可固定吸附陽離子小分子及與DNA特異結(jié)合的分子。水凝膠球在模擬消化液中可穩(wěn)定存在，其中pH=7.8條件下2 h僅有0.5% DNA釋放。包埋酵母菌的水凝膠球孵育24 h后可發(fā)生局部形變，但結(jié)構(gòu)仍保持完整，未見酵母菌逸出。研究結(jié)果表明此多層水凝膠球具有良好的生物相容性、形狀記憶性、膜透性及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，為細(xì)胞生長提供了良好的微環(huán)境，可包埋酵母細(xì)胞并使其在寡營養(yǎng)條件下增殖。

DNA；殼聚糖；多層水凝膠球；特性；固定化；酵母菌

層層自組裝技術(shù)作為目前發(fā)展迅速的一種成膜技術(shù)，可以使帶相反電荷的聚電解質(zhì)在靜電作用力下交替沉積得到自組裝的多層薄膜[1]。相對(duì)于傳統(tǒng)的載體，這種自組裝膜具有核殼機(jī)構(gòu)可以逐層控制周圍分子的擴(kuò)散行為，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)藥物的釋控，已廣泛應(yīng)用在生物醫(yī)藥領(lǐng)域[2]。Volodkin等[3]將PSS和PAH交替沉積在多孔碳酸鈣微球的表面，用EDTA溶液將碳酸鈣溶解后形成載藥微膠囊，提高了被包埋藥物的親水性。Luo等[4]利用層層自組裝技術(shù)構(gòu)建了聚醛化葡聚糖接枝金剛烷(PAD-g-AD)和羧甲基葡聚糖接枝β環(huán)糊精(CMD-g-β-CD)微膠囊載體，可以控制阿霉素的釋放，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的吸收，提高了腫瘤治療的效率。但這些合成聚電解質(zhì)沒有很好的生物相容性，一些載體材料如聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDADMAC)等還對(duì)生物體有毒性[5]，因此，對(duì)基于層層自組裝技術(shù)的天然聚電解質(zhì)類載體的研究越來越關(guān)注。

天然核酸由于本身的生物相容性和低免疫原性，以及可與聚陽離子靜電相互作用的性質(zhì)，使其也成為載體應(yīng)用的理想材料[6]。任科峰等[7]利用DNA與帶正電荷的聚賴氨酸(PLL)通過層層自組裝構(gòu)建了多層超薄膜，并進(jìn)一步研究了該多層超薄膜的酶解及釋放。另有研究表明，核酸自組裝材料具有良好的形狀記憶性[8]，在自組裝材料發(fā)生形變后在一定條件下可以恢復(fù)其初始形狀。殼聚糖因?yàn)槠浒踩珶o毒性、抗菌活性及生物相容性，被廣泛用于藥物載體的制備[9]。將殼聚糖作為材料層層自組裝制備功能載體的研究也很廣泛。Jiang等[10]發(fā)現(xiàn)丙烯酸(AA)與殼聚糖可通過靜電作用自組裝形成空心微囊，用于抗腫瘤藥阿霉素的包埋，提高了阿霉素的包封率及穩(wěn)定性。Donath等[11]將天然高分子殼聚糖與硫酸葡聚糖、海藻酸鈉或羧甲基纖維素通過層層自組裝技術(shù)將藥物布洛芬包裹，研究結(jié)果表明所得微囊對(duì)布洛芬具有很好的緩釋性能。此外，海藻酸鈉也是一種生物相容性和生物降解的聚電解質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，醫(yī)藥工程等[12-13]，通常海藻酸鈉與溶液中的Ca2+可形成能固化的膜層，被成功用于一些敏感藥物的釋放[14]及蛋白質(zhì)、活性細(xì)胞的固化[15]。黃達(dá)明等[16]利用海藻酸鈣微球?qū)崿F(xiàn)了對(duì)酵母細(xì)胞的包埋，但其凝膠球在細(xì)胞生長環(huán)境下易破碎溶解，穩(wěn)定性較差，不利于固定化細(xì)胞的多次利用[17]。因此，利用天然核酸類凝膠基質(zhì)良好的形狀記憶性，以及其與殼聚糖分子間相互作用構(gòu)建具有良好生物相容性和功能特性的水凝膠球，有望解決以上問題。

本研究首次將天然核酸，鮭魚精DNA聚陰離子大分子作為功能性載體材料，利用鮭魚精DNA、殼聚糖、海藻酸鈉這3種安全、無毒的生物大分子層層自組裝制備水凝膠球，對(duì)多層水凝膠球的結(jié)構(gòu)、特性進(jìn)行系統(tǒng)研究，并將其初步用于酵母細(xì)胞的固定化。

1 材料與方法

1.1 材料

鮭魚精DNA(Salmon sperm DNA, DNA)、殼聚糖(Chitosan, CS)、海藻酸鈉(Sodium alginate, SA)、溴百里香酚藍(lán)(Bromothmol blue, BB)、中性紅(Neutral red, NR)、吖啶橙(Acridine orange, AO)購于Sigma 公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、HBSS緩沖液購于gibco 公司；氯化鈣、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 DNA/殼聚糖/海藻酸鈣(DCS)多層水凝膠球的制備 DNA/CS軟凝聚態(tài)核心球由滴注法制成，用1 mL規(guī)格的注射器吸取DNA溶液，以1 mL/min的速度逐滴滴入正在攪拌(100 r/min)的殼聚糖(CS，pH=5)溶液中，孵育30 min使其交聯(lián)均勻。將制成的核心球取出并用去離子水沖洗干凈以去除球表面未結(jié)合的CS。將核心球轉(zhuǎn)移至海藻酸鈉(SA)溶液中，孵育30 min使其膜層交聯(lián)均勻，然后將其用水沖洗干凈并轉(zhuǎn)移至CaCl2溶液中孵育20 min，使SA層固化，最后將多層球取出并用水沖洗干凈即得DCS多層水凝膠球。

1.2.2 DCS多層水凝膠球的形態(tài)表征 隨機(jī)選取10粒制得的水凝膠球，在倒置顯微鏡下觀察其多層膜結(jié)構(gòu)，并計(jì)算水凝膠球的平均粒徑。吸干多層水凝膠球表面多余的水分，于-80 ℃冷凍過夜，隨后將其置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干24 h。小心的將凍干小球用小刀縱向剖開，固定在金屬支架上，表面噴金后通過掃描電鏡觀察多層水凝膠球的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.3 DCS多層水凝膠球的形狀記憶特性 將新鮮制備的DCS多層水凝膠球轉(zhuǎn)移至光滑的0.22 μm濾膜上，37 ℃干燥脫水；然后將載有脫水球的濾膜重新浸泡于去離子水中，觀察復(fù)水前后多層水凝膠球的形態(tài)變化。

1.2.4 DCS多層水凝膠球的膜透性 稱取一定量的溴百里香酚藍(lán)(BB)、中性紅(NR)、吖啶橙(AO)染料分別用去離子水溶解并定容制成濃度為1‰(m/v)的染液。將BB、NR、AO 3種染料分別與DNA溶液按照體積比為1∶9的比例混合，得到染料與DNA的混合液。將混合液分別在CS、SA、CaCl2溶液中孵育，制備得到包載染料分子的多層水凝膠球，依次標(biāo)注為BB-水凝膠球、NR-水凝膠球、AO-水凝膠球。將包載染料分子的水凝膠球浸入Hank’s緩沖液(pH=7.4)中，在倒置顯微鏡下觀察水凝膠球形態(tài)以及核心球內(nèi)染料分子的釋放情況。

1.2.5 模擬胃、腸消化液對(duì)DCS多層水凝膠球穩(wěn)定性的影響 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性觀察：取鹽酸234 mL加水稀釋至1 000 mL得到稀鹽酸，取16.4 mL稀鹽酸加水約800 mL，與胃蛋白酶10 g混勻后，加水定容至1 000 mL得到模擬胃液；取磷酸二氫鉀6.8 g溶于500mL水，用0.4% 氫氧化鈉調(diào)pH至6.8，另取胰蛋白酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋成1 000 mL，得到模擬腸液。取3-4粒新鮮制備的多層水凝膠球用緩沖液潤洗后，分別置于裝有20 mL 模擬胃液和20 mL 模擬腸液的燒杯中，于室溫下低速攪拌(50 r/min)，觀察水凝膠球在孵育過程中的形態(tài)變化，并在設(shè)定時(shí)刻拍照記錄。

DCS水凝膠球內(nèi)DNA含量的檢測： DCS水凝膠球的制備步驟同2.2.1。取一定體積的DNA溶液(C，10 mg/mL)連續(xù)制備40粒多層水凝膠球，根據(jù)剩余的DNA溶液體積計(jì)算制備40粒凝膠球所用的DNA溶液體積(V)。吸干DCS水凝膠球表面多余的水分放入凍干瓶內(nèi)，于-80 ℃冷凍過夜，隨后將其置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干24 h后取出。用精密分析天平稱量40粒凍干球的總質(zhì)量(m總)。脫水DCS水凝膠球中DNA的含量根據(jù)公式(1)計(jì)算。

DNA含量=C×V/m總×100% 。

(1)

DCS水凝膠球內(nèi)DNA的累積釋放檢測：取新制備的多層水凝膠球，用模擬消化液(模擬胃液、模擬腸液)潤洗后，投入裝有4 mL模擬消化液的離心管中，在37 ℃，100 r/min水浴震蕩鍋中孵育。每隔一定時(shí)間，取40 μL清液，同時(shí)向釋放體系內(nèi)補(bǔ)充等體積的模擬消化液。將清液與等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，7 800 r/min，4 ℃離心2 min；取上清30 μL重復(fù)前面的抽提、離心步驟，最終得到的上清液取30 μL凍存?zhèn)溆?。在避光條件下，將取出的待測液用1×SYBR Green I染色，其中待測液與染液的體積比為19∶1，小心吸取100 μL混合液置于96孔板中，通過熒光酶標(biāo)儀檢測樣品在激發(fā)波長497 nm，發(fā)射波長520 nm下的熒光強(qiáng)度。

1.2.6 DCS多層水凝膠球?qū)湍讣?xì)胞的包埋 將DNA溶液高壓滅菌后置于超凈臺(tái)內(nèi)備用；CS(pH=6)、SA及CaCl2溶液通過無菌濾膜過濾的方式滅菌備用。挑取少量經(jīng)純化培養(yǎng)的菌種接種到無菌的葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。按照5%的接種量吸取適量含菌培養(yǎng)液與已滅菌的DNA溶液按照體積比為9∶1的比例充分混合，用1 mL規(guī)格的注射器吸取混有菌液的DNA溶液并逐滴滴加到CS溶液中，100 r/min攪拌30 min以保證DNA與CS充分交聯(lián)，小心取出核心球并用無菌去離子水充分沖洗以除去殘留在核心球表面的CS和菌體。然后依次浸入SA溶液和CaCl2溶液中(孵育條件同2.2.1)，最終制得包載酵母菌的多層水凝膠球，簡稱為酵母菌/水凝膠球。將新鮮制備的酵母菌/水凝膠球分別置于無菌的HBSS緩沖液或葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡及掃描電鏡下觀察新鮮制備的以及培養(yǎng)24 h的酵母菌/水凝膠球的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA/殼聚糖/海藻酸鈣(DCS)多層水凝膠球的制備及形態(tài)表征

DCS多層水凝膠球是利用聚電解質(zhì)分子之間的靜電相互作用層層自組裝制得。制得的水凝膠球呈半透明狀的圓球形，在顯微鏡下可觀察到清晰的三層膜結(jié)構(gòu)(見圖1)，由內(nèi)到外依次是DNA/CS凝膠膜、CS/SA 凝膠膜及海藻酸鈣固化膜。通過對(duì)比顯微鏡中的標(biāo)尺計(jì)算可得水凝膠球的平均粒徑為(2.7±0.1)mm，CS/SA膜層厚度約為0.24 mm。掃描電鏡(SEM)觀察到水凝膠球表面光滑無褶皺，水凝膠脫水后其內(nèi)部形成大孔網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，從其剖面的微觀結(jié)構(gòu)圖可見兩層大孔網(wǎng)格結(jié)構(gòu)分別由兩層致密的薄膜層隔開(見圖2A)，其中海藻酸鈣外膜層的厚度約為6 μm(見圖2B)，網(wǎng)格孔隙內(nèi)壁光滑致密，且有絲狀或柱狀纖維狀結(jié)構(gòu)支承大孔空間結(jié)構(gòu)(見圖2C)，這使得水凝膠球具有較快的球內(nèi)外分子的交換和溶脹/去溶脹速度，保持水凝膠球有較好的彈性形變[18]。

圖1 新鮮制備的水凝膠球(A)及其在顯微鏡下(60 X)的照片(B)Fig.1 Freshly prepared hydrogel beads (A) and its microcope photographs observed under 60 X zoom, ordinary light (B), respectively

圖2 DCS多層水凝膠球的掃描電鏡照片：凍干球的剖面(A)、外膜層(B)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)(C)圖

2.2 DCS多層水凝膠球的形狀記憶特性

如圖3所示，制備的DCS水凝膠球在自然干燥后，由圓潤的球形變成圓形薄片貼附于中性紅染色的濾膜上(見圖3B)。當(dāng)將已發(fā)生形變的的水凝膠球復(fù)水后，片狀的水凝膠逐漸吸水膨脹，當(dāng)浸泡12 h后水凝膠球恢復(fù)到最初的球形，不再發(fā)生形態(tài)變化(見圖3C)，呈現(xiàn)出較好的形狀記憶特性。由DNA組裝形成的水凝膠球可以在失水過程中產(chǎn)生明顯形變，而在復(fù)水后可恢復(fù)原有形狀的記憶特性得益于DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，堿基對(duì)間作用力及磷酸二酯鍵連接的DNA骨架使其有一定的韌性和剛性，而DNA與CS的非共價(jià)相互作用更加強(qiáng)了這一特性。

2.3 DCS多層水凝膠球的膜透性

分別選取帶負(fù)電荷(BB)、正電荷(NR)及可與DNA特異結(jié)合(AO)的染料分子包封于DNA/CS核心球內(nèi)，多層水凝膠球在Hank’s緩沖液(pH=7.4)中各染料的釋放情況如圖4所示。其中，包裹BB的水凝膠球(BB-水凝膠球)內(nèi)染料分子已幾乎全部釋放至球外，水凝膠球呈無色透明狀(見圖4A)，在顯微鏡下觀察與未染色水凝膠球的顏色和形狀均無差異(見圖4B)；包裹NR的水凝膠球(NR-水凝膠球)中染料分子幾乎無釋放，球體呈艷麗的紅色(見圖4C)，NR分子集中于DNA-CS凝膠膜層以內(nèi)，外層膜仍保持無色透明狀(見圖4D)。這可能是由于堿性NR染料分子可與聚陰離子DNA發(fā)生靜電相互作用而滯留于DNA/CS膜層以內(nèi)，而不擴(kuò)散至同樣帶負(fù)電荷的SA分子與CS組裝的膜層，另外CS分子對(duì)帶相同電荷的NR分子的排斥作用也阻礙了NR分子的自由擴(kuò)散；包裹AO的水凝膠球(AO-水凝膠球)中染料分子在水凝膠球制備過程中可穩(wěn)定存在于水凝膠球的DNA/CS核心球中，但由于AO的分子量較小，且分子在溶液中不解離出電荷，因此未嵌入DNA的游離AO分子可以透過多層膜，將多層水凝膠球均勻的染為熒光黃色(見圖4E)，即使在顯微鏡下也無法觀察到明顯的多層膜結(jié)構(gòu)(見圖4F)。

圖3 DCS水凝膠球在脫水干燥前、后(A、B)及復(fù)水12 h后(C)的形態(tài)照片

圖4 新鮮制備的BB-水凝膠球(A)、NR-水凝膠球(C)和AO-水凝膠球(E)，以及在光學(xué)顯微鏡下(60 X)觀察的BB-水凝膠球(B)、NR-水凝膠球(D)和AO-水凝膠球(F)的顯微照片F(xiàn)ig.4 Freshly prepared BB-hydrogel beads (A), NR-hydrogel beads (C), AO-hydrogel beads (E), and their microcope photographs (B, D and F) observed under 60X zoom

結(jié)果說明水凝膠球內(nèi)的大孔網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可以允許染料小分子物質(zhì)“進(jìn)出”膜層，小分子自身所帶電荷，以及小分子與聚電解質(zhì)分子間特異性結(jié)合作用對(duì)其在凝膠膜層間的運(yùn)動(dòng)有較大影響，其中與DNA能特異性結(jié)合的小分子可以被穩(wěn)定的包裹于水凝膠球內(nèi)。陽離子分子不僅易與呈負(fù)電性的DNA相互作用，且易被呈正電性的CS分子排斥，因而不易跨越DNA-CS膜層；陰離子分子不易與DNA分子相互作用，CS分子與其作用力也較弱，因而可以在膜層間自由擴(kuò)散；中性分子則可以在各凝膠膜層自由擴(kuò)散。

2.4 模擬胃、腸消化液對(duì)DCS多層水凝膠球穩(wěn)定性的影響

2.4.1 模擬胃、腸消化液中DCS多層水凝膠球的結(jié)構(gòu)形態(tài) 載體材料在人體消化液中的穩(wěn)定性影響著所包載物質(zhì)的靶向釋放，由于制備的多層水凝膠球允許小分子及帶電荷粒子通過自由擴(kuò)散的方式進(jìn)出水凝膠球的各層膜結(jié)構(gòu)，因此我們研究了多層水凝膠球在人體胃腸環(huán)境中pH對(duì)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。在模擬胃液中，隨著CS-SA凝膠膜層的“硬化”，水凝膠球的膜結(jié)構(gòu)更致密結(jié)實(shí)，使得在pH=1.8的環(huán)境中多層水凝膠球仍保持完整形態(tài)(見圖5A)，說明在胃環(huán)境中多層水凝膠球有良好的穩(wěn)定性。而水凝膠球顏色由半透明狀逐漸變?yōu)榘咨∮谝好嫔?，這可能是因?yàn)檫^高的酸性環(huán)境使組成水凝膠球膜結(jié)構(gòu)的SA分子逐漸轉(zhuǎn)換為海藻酸而析出，其水合能力逐漸降低使得水凝膠球的比重減小而造成的。將多層水凝膠球置于模擬腸液中孵育一定時(shí)間，水凝膠球仍保持著球形狀態(tài)(見圖5B)，顯示了其較好的穩(wěn)定性。而水凝膠球顏色由最初的半透明狀逐漸變?yōu)橥该鳡?，可能是因?yàn)榫S持球體結(jié)構(gòu)的海藻酸鈣固化膜在堿性溶液中逐漸溶脹，使得水凝膠球的膜層“吸收”更多水分后厚度變大，從而水凝膠球的顏色更加透明。

2.4.2 DCS多層水凝膠球在模擬胃、腸液中DNA累積釋放量 DCS多層水凝膠球的核心球內(nèi)是高濃度的DNA，DNA在脫水凝膠球中的含量比重很大，為(72.1±6.4)%。為了定量分析水凝膠球在模擬消化液中的穩(wěn)定性，測定了核心球內(nèi)DNA的累積釋放量(見圖6)。結(jié)果表明當(dāng)多層水凝膠球在模擬胃液中孵育24 h時(shí)，釋放介質(zhì)中仍未檢測到游離DNA，說明水凝膠球在模擬胃液中可穩(wěn)定存在。當(dāng)水凝膠球在模擬腸液中孵育2 h后，只有0.5%游離DNA“逸出”，15 h內(nèi)DNA的累積釋放量僅有約4%。但是孵育15 h后出現(xiàn)DNA的突釋，孵育至24 h時(shí)DNA的累積釋放量達(dá)到15%。以上結(jié)果表明該水凝膠球有一定的pH響應(yīng)性，在酸性環(huán)境中水凝膠球穩(wěn)定性良好，而在堿性環(huán)境中穩(wěn)定性相對(duì)較弱，這種pH響應(yīng)特性使得多層水凝膠球可用于活性物質(zhì)或藥物的靶向定位釋放，如腸道微環(huán)境等[19]。

圖5 DCS多層水凝膠球在模擬胃液(A)和模擬腸液(B)中孵育的形態(tài)照片

圖6 DCS多層水凝膠球在模擬胃、腸液中游離DNA的釋放

2.5 包載酵母菌的水凝膠球的制備及固定化培養(yǎng)

利用聚電解質(zhì)層層自組裝的方法固定酵母菌，材料安全且制備過程溫和，能夠保證酵母菌的活性。通過顯微鏡觀察酵母菌/水凝膠球具有明顯的核-膜結(jié)構(gòu)，各膜層均保持透明狀(見圖7A)。將酵母菌/水凝膠球在HBSS緩沖液和液體培養(yǎng)基中分別孵育24 h后，均可觀察到明顯的酵母細(xì)胞增殖。其中，酵母菌/水凝膠球在HBSS緩沖液培養(yǎng)24 h后，原本透明狀的球體逐漸變白，在暗視野下可觀察到水凝膠球內(nèi)部幾乎被酵母菌“占據(jù)”(見圖7B)，水凝膠膜層比新制備的酵母菌/凝膠球膜層明顯變薄，且開始出現(xiàn)膜層向球內(nèi)凹陷的趨勢(見圖7C箭頭所指處)，說明該凝膠球在HBSS緩沖液中孵育過程中，隨著酵母菌繁殖和數(shù)量的增多而使核心球“膨脹”而產(chǎn)生形變。當(dāng)將酵母菌/水凝膠球置于酵母菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，水凝膠球的顏色同樣變?yōu)榘咨?，球體局部發(fā)生形變(見圖7D箭頭所指處)，多層膜結(jié)構(gòu)被破壞，僅可見完整的外膜層(見圖7E)。此外，球體硬度明顯比在HBSS中孵育的水凝膠球高，說明酵母菌的密度非常高，甚至已因局部酵母菌的大量繁殖而形成凸出于原來球體的新半球，但水凝膠球的完整結(jié)構(gòu)并未被破壞，且未發(fā)現(xiàn)有酵母菌從水凝膠球中“逸出”。水凝膠球能夠包裹活性菌并保持其增殖活性，主要得益于多層水凝膠球的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢。海藻酸鈣外膜層有利于保護(hù)包埋在核心球內(nèi)的細(xì)胞不受外界機(jī)械力的破壞，為其增殖過程提供了穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境。水凝膠球的多層膜結(jié)構(gòu)均為相互連通的網(wǎng)狀大孔，可以保證營養(yǎng)分子的供給，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而且能夠使細(xì)胞分泌的代謝產(chǎn)物有選擇性的蓄積或擴(kuò)散至多層膜外，利于活性代謝產(chǎn)物的收集。此外，該水凝膠球的內(nèi)核主要由DNA組成，維持了球體很好的形變能力，利于細(xì)胞在核心球內(nèi)的運(yùn)動(dòng)和增殖，為細(xì)胞的繁殖提供相對(duì)寬松自由的生長空間。

為了進(jìn)一步了解水凝膠球內(nèi)固定的酵母細(xì)胞在增殖過程中的分布情況及水凝膠球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，通過掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)(見圖8)。圖8A為在HBSS中培養(yǎng)的水凝膠球微觀結(jié)構(gòu)照片，核-膜結(jié)構(gòu)完整，網(wǎng)狀大孔結(jié)構(gòu)清晰可見。將圖8A中標(biāo)記區(qū)域B放大5倍可以清晰的觀察到依附于大孔網(wǎng)格內(nèi)的酵母菌，且酵母菌周圍的凝膠支架結(jié)構(gòu)光滑完整，未出現(xiàn)被降解或結(jié)構(gòu)疏松的現(xiàn)象，說明水凝膠球成功包裹酵母菌。圖8C為酵母菌/水凝膠球在液體培養(yǎng)基中孵育24 h的微觀結(jié)構(gòu)照片，可見其核-膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)模糊，部分網(wǎng)孔的支架結(jié)構(gòu)已經(jīng)斷裂，膜層表面及切面均富集了大量微生物及其代謝產(chǎn)物。將圖8C中標(biāo)記區(qū)域D放大5倍可見球形的酵母菌及其周圍無規(guī)則狀的代謝產(chǎn)物固態(tài)形式，酵母菌及其代謝產(chǎn)物已經(jīng)覆蓋且填充滿了球內(nèi)凝膠支架。比較分別在緩沖液和培養(yǎng)液中培養(yǎng)相同時(shí)間的酵母菌/水凝膠球，在培養(yǎng)液中孵育的水凝膠球內(nèi)酵母菌繁殖速度明顯比在缺乏營養(yǎng)的緩沖液中快，說明水凝膠球外的營養(yǎng)物質(zhì)可以通過自由擴(kuò)散進(jìn)入到水凝膠球的核心區(qū)內(nèi)，提供細(xì)胞生長繁殖所需的碳源、氮源。以上結(jié)果表明利用天然核酸制備的多層水凝膠球安全無毒，具有良好的生物相容性，可用于固定活性細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物。

圖7 新鮮制備的酵母菌/水凝膠球(A, 60×)及其分別在HBSS緩沖液(B, 40×)和液體培養(yǎng)基(C, 40×)中培養(yǎng)24 h的顯微鏡照片

圖8 酵母菌/水凝膠球分別在HBSS緩沖液(A、B)和液體培養(yǎng)基(C、D)中培養(yǎng)24 h的掃描電鏡照片

3 結(jié)語

本研究利用層層自組裝技術(shù)成功制備了DCS多層水凝膠球。制得的水凝膠球形態(tài)圓整，膜層清晰，平均粒徑為(2.7±0.1) mm?；贒NA特殊的雙螺旋結(jié)構(gòu)，該多層水凝膠球具有良好的形狀記憶特性及膜透性，可以固定吸附帶正電荷的小分子和可與DNA特異性結(jié)合的分子。此外，DCS多層水凝膠球在模擬胃腸液中具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可實(shí)現(xiàn)球內(nèi)被包載物質(zhì)pH響應(yīng)性釋放，可以用于藥物或活性物質(zhì)的包載和腸道微環(huán)境的靶向釋放。利用該水凝膠球成功包埋了活性酵母菌，并實(shí)現(xiàn)了包埋菌株的存活和繁殖，為水凝膠球在活性菌的靶向釋放以及細(xì)胞固定化等應(yīng)用領(lǐng)域提供了理論和數(shù)據(jù)支持。

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責(zé)任編輯 高 蓓

Multi-Layerd Hydrogel Beads Prepared by Using Natural Nucleic Acids and Its Properties

WANG Qian2， GUAN Lei1， LIN Jiao1， CHEN Wei-Yu1， LIANG Xing-Guo1， LI Jing1

(1.College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；2.College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Cell immobilization is an attractive choice for high-throughput cell isolation and culture due to its advantageous such as protecting cell viability and improving the environmental stability of cell growth, which is widely used in the fields of food, medical application, and environmental protection, etc. In order to improve the micro-environment of cell growth, as well as the stability of the carrier media, bioavailable hydrogel beads composed of natural DNA was developed as a novel matrix for cell immobilization. Based on the biological compatibility and the double helix structure of DNA, DNA/chitosan/calcium alginate multi-layered hydrogels bead (DCS) was prepared by using layer-by-layer (LbL) technique. The morphology and inner micro-structure of DCS were observed by microscopy and scanning electron microscopy, respectively. The stability of DCS was evaluated by determining the cumulative DNA release content in different simulated digestive fluids by dialysis method. Yeast was used as a model cell for cell immobilization. DCS was composed of a soft condensed DNA/CS inner-core and a solid calcium alginate outer-layer through intermolecular electrostatic interactions between DNA, chitosan, and alginate. The prepared hydrogel beads were transparent with spherical shape. The average particle size of the beads was (2.7±0.1) mm, and the thickness of CS/SA layer and calcium alginate outer-layer was about 240 and 6 μm, respectively. The interior morphology of the DCS demonstrated open, interconnected highly porous structure, which enabled the multi-layered hydrogel beads fast swelling/deswelling. Re-hydration test showed that the DCS had good shape memory, having obvious deformation in the process of water loss and recover its original shape after re-incubated in water. In addition, small molecules, such as positively charged molecules and specific DNA-binding molecules, can be absorbed and encapsulated in DCS. Stability studies showed that the beads could be stable in simulated gastric fluid, and only 0.5% DNA was released in 2 hours in simulated intestinal fluid. For the first time, yeast cell was successfully embedded in the multilayer hydrogel beads. After incubation of 24 h in the buffer solution and liquid culture medium, cell-embedded hydrogel beads with integrity structure showed local deformation due to the proliferation of the yeast cells. The multilayer hydrogel beads were still intact, and no leak yeast was found outside the hydrogel beads. The above results showed that natural DNA can be used for constructing bioavailable multi-layered hydrogel beads. This novel transparent hydrogel beads showed good shape memory property, membrane permeability and stability, which provided a good micro-environment for cell immobilization and culture.

DNA; chitosan; multilayer hydrogel beads; characteristic; immobilization; yeast

中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2014M551965)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301420；31571937)資助 Supported by the China Postdoctoral Science Foundation Funded Project(2014M551965)；the National Natural Science Foundation of China (31301420；31571937)

2016-04-15；

2016-05-13

王 倩(1987-)，女，碩士生。E-mail: wangqian366616552@163.com

** 通訊作者：E-mail: lijouc@ouc.edu.cn

TS201

A

1672-5174(2017)03-0066-08

10.16441/j.cnki.hdxb. 20160126

王倩， 關(guān)磊， 林嬌， 等. 利用天然核酸制備的多層水凝膠球及其性能研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 47(3): 66-73.

WANG Qian， GUAN Lei， LIN Jiao， et al. Multi-layerd hydrogel beads prepared by using natural nucleic acids and its properties[J]. Periodical of Ocean University of China, 2017, 47(3): 66-73.