蔣文琳， 黃 文， 陳艷蘭， 彭定越， 陳德斌， 鄒 敏

Ras信號(hào)通路在HIV-1 Tat誘導(dǎo)ZO-1及腦啡肽酶破壞的作用

蔣文琳1， 黃 文1， 陳艷蘭2， 彭定越1， 陳德斌1， 鄒 敏1

目的 探討Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路在人類免疫缺陷病毒-1型反式轉(zhuǎn)錄激活因子(HIV-1 transactivator of transcription,HIV-1 Tat)誘導(dǎo)血腦屏障(BBB)中緊密連接蛋白Zonula Occludens(ZO)-1及腦啡肽酶(Neprilysin,NEP)破壞的作用。方法 以不同濃度Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑法尼基硫代水楊酸(farnesylthiosalicylic acid,FTS)刺激培養(yǎng)好的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(human cerebral microvascular endothelium cells,HBEC-5i),并設(shè)立對(duì)照組，觀察其對(duì)細(xì)胞活力的影響。分別予以HIV-1 Tat、FTS刺激細(xì)胞，以蛋白免疫印跡法及實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR )檢測HIV-1 Tat誘導(dǎo)的緊密連接蛋白ZO-1及NEP(腦內(nèi)降解β淀粉樣蛋白Amyloid-beta，Aβ的限速酶)的蛋白和mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 FTS在20 μmol/L(0.35±0.06)以下時(shí)對(duì)HBEC-5i活力無明顯影響(P>0.05)，HIV-1 Tat能抑制HBEC-5i的ZO-1、NEP蛋白(0.53±0.07，P<0.01；0.40±0.04，P<0.05)與mRNA(0.42±0.10，P<0.05；0.31±0.09，P<0.05)的表達(dá)。用FTS阻斷Ras信號(hào)通路后可顯著增加ZO-1、NEP蛋白(1.20±0.22，P<0.01；0.58±0.03，P<0.05)及mRNA(1.10±0.19，P<0.05；0.97±0.38，P<0.05)的表達(dá)。結(jié)論 HIV-1 Tat可促進(jìn)緊密連接蛋白ZO-1蛋白和mRNA下調(diào)而導(dǎo)致血腦屏障破壞，同時(shí)誘導(dǎo)腦內(nèi)腦啡肽酶NEP蛋白和mRNA下調(diào)，可能導(dǎo)致Aβ在腦內(nèi)沉積增加。阻斷Ras信號(hào)傳導(dǎo)通路可抑制HIV-1 Tat誘導(dǎo)的ZO-1和NEP破壞，可能減少Aβ在腦內(nèi)的沉積。

HIV-1 Tat; Ras信號(hào)通路； ZO-1; NEP

HIV-1流行病學(xué)顯示，感染人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus-1，HIV-1)的老年人口不斷增加，成為一個(gè)新興發(fā)展的感染人群[1]。已證實(shí)，HIV-1感染者大腦一個(gè)顯著特點(diǎn)是腦內(nèi)β淀粉樣蛋白(Amyloid-beta,Aβ)沉積增加[2～4]。老年人感染HIV-1病毒后更易發(fā)展為HIV-1相關(guān)性癡呆(HIV-associated dementia，HAD)[3,5]。HIV-1反式轉(zhuǎn)錄因子(HIV transactivator of transcription，HIV-1 Tat)能輕易進(jìn)入腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激炎癥反應(yīng)，改變緊密連接蛋白的表達(dá)[6]。有研究證實(shí)HIV-1 Tat可通過激活Ras信號(hào)通路而影響腦血管內(nèi)皮細(xì)胞[1]。HIV-1 Tat蛋白能抑制腦啡肽酶(neprilysin,NEP),抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ，損害神經(jīng)細(xì)胞，促使Aβ斑塊形成[7]，導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂[8]。NEP是主要的內(nèi)源性Aβ降解酶[9]，NEP對(duì)腦中Aβ1-40的降解部分通過血腦屏障的流出轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)HIV-1 Tat能破壞人腦微血管細(xì)胞中的緊密連接蛋白Occludin,促進(jìn)晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)過表達(dá)[11]并下調(diào)脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP1)，而阻斷Rho/ROCK信號(hào)通路可有效抑制HIV-1 Tat對(duì)腦微血管細(xì)胞的不利影響，從而可能減少Aβ在腦微血管細(xì)胞中的沉積[12]。本研究以人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HBEC-5i)體外培養(yǎng)作為血腦屏障(BBB)模型,觀察Ras信號(hào)通路抑制劑法尼基硫代水楊酸(farnesylthiosalicylic acid，F(xiàn)TS)對(duì)HIV-1 Tat誘導(dǎo)緊密連接ZO-1蛋白破壞和NEP表達(dá)的影響，探討Ras信號(hào)通路在HIV-1 Tat誘導(dǎo)Aβ腦內(nèi)沉積的作用機(jī)制，為臨床防治HIV-1相關(guān)性癡呆提供新的思路及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM：F12 Medium)、0.1%明膠溶液、內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(endothelial growth supplement,ECGS)均購自ATCC公司，胎牛血清(FBS)購自Gibco公司，法尼基硫代水楊酸(FTS)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Sigma公司，重組HIV-1 Tat clade-B購自ProSpec公司，二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，ZO-1抗體、NEP抗體購自abcam公司，GAPDH內(nèi)參蛋白抗體購自Proteintech公司，熒光二抗購自LI-COR公司，TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq PCR Master Mix kit均購自Takara公司。

1.2 主要試劑配制 DMEM：F12完全培養(yǎng)基的配制：100 ml DMEM：F12中需加入10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清、40 μg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(ECGS)、1%青霉素-鏈霉素。HIV-1 Tat配制：HIV-1 Tat短暫離心后于超凈工作臺(tái)中用超純水完全溶解，制成100 μg/ml儲(chǔ)存液，分裝后于-80℃保存，HIV-1 Tat能與血清結(jié)合，HIV-1 Tat干預(yù)實(shí)驗(yàn)都在無血清條件下進(jìn)行。FTS配制：FTS短暫離心后于超凈臺(tái)中用二甲基亞砜(DMSO)完全溶解，制成0.1 mol/L儲(chǔ)存液，分裝后于-20 ℃保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HBEC-5i)來源于人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,購自ATCC公司。將人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(HBEC-5i)種植于0.1%明膠溶液(ATCC)包被過的25 cm2培養(yǎng)瓶(Corning)內(nèi)，加入3～4 ml DMEM：F12完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)基顏色及細(xì)胞生長情況，1～2 d換液一次，待細(xì)胞達(dá)80%以上融合即可傳代。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理 (1)FTS對(duì)細(xì)胞活力影響的檢測：用不同濃度梯度的FTS(0、5、10、20、30、40、50 μmol/L)處理HBEC-5i細(xì)胞24 h，四甲基偶氮唑鹽(MTT法)檢測細(xì)胞活力；(2)蛋白免疫印跡法檢測HBEC-5i中ZO-1、NEP蛋白的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組(0.01%DMSO)、1 μg/ml HIV-1 Tat處理組、5 μmol/L FTS干預(yù)組、5 μmol/L FTS干預(yù)+1 μg/ml HIV-1 Tat處理組，處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白；(3)實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR法)檢測HBEC-5i中ZO-1、NEP的mRNA表達(dá)：實(shí)驗(yàn)分組同上，處理細(xì)胞12 h后收集細(xì)胞提取總RNA。FTS預(yù)處理細(xì)胞3 h后再加入HIV-1 Tat[13]。

1.5 四甲基偶氮唑鹽(MTT法)檢測細(xì)胞活力 對(duì)數(shù)生長期HBEC-5i細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，離心后重懸，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板(Corning)，每個(gè)濃度梯度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁生長良好，在無血清條件下以不同濃度FTS(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、40 μmol/L、50 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后輕柔吸棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測定吸光度值(波長570 nm)。

1.6 Western blot法檢測HBEC-5i中ZO-1、NEP蛋白的表達(dá)量 將HBEC-5i接種于六孔板(JET BIOFIL)，按實(shí)驗(yàn)方案處理后，用預(yù)冷的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞3次，冰上用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，4 ℃ 12000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，每道上樣20 μg蛋白，在8%或5%SDS聚丙酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，用5%脫脂奶粉封閉30 min，分別加入ZO-1一抗(1∶400)、NEP一抗(1∶400)、內(nèi)參GAPDH(1∶5000),4 ℃孵育過夜，次日用1×三乙醇胺緩沖鹽水加吐溫20溶液(Tris Buffered Saline,with Tween-20，TBST)緩沖液洗膜5 min×4次后加入熒光二抗，室溫?fù)u床孵育1 h,1×TBST緩沖液洗膜5 min×4次，用熒光掃膜儀掃膜，用Image-J圖像分析軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析，以ZO-1、NEP灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值反映ZO-1、NEP蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR法)檢測HBEC-5i中ZO-1、NEP的mRNA表達(dá) 將HBEC-5i接種于六孔板，按實(shí)驗(yàn)方案處理細(xì)胞，用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用StepOne Plus序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s,然后進(jìn)行PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,20 μl體系共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物序列分別為：ZO-1：5’-GACCAATAGCTGATGTTGCCAGAG-3’和5’-TGCAGGCGAATAATGCCAGA-3’；NEP:5’-TAAGCAGCCTCAGCCGAACC-3’和5’-TTGACATAGTTTGCACAACGTCTCC-3’;GAPDH:5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’和5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果取至少3個(gè)復(fù)孔的均值作為一次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品通過管家基因GAPDH作為內(nèi)參使目標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度FTS對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響 不同濃度梯度FTS處理HBEC-5i 24 h后，以空白組為對(duì)照(0.38±0.03)，當(dāng)FTS濃度大于20 μmol/L(0.35±0.06)時(shí)，對(duì)HBEC-5i有明顯的抑制作用，且隨著FTS濃度增高，其對(duì)HBEC-5i活性的抑制作用增強(qiáng)。因此，選擇FTS5 μmol/L(0.41±0.07，P>0.05)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理濃度(見圖1)。

2.2 不同處理對(duì)HBEC-5i中ZO-1、NEP蛋白水平的影響 與對(duì)照組(1.24±0.37，0.55±0.05)相比，HIV-1 Tat組ZO-1蛋白(0.53±0.07，P<0.01)、NEP蛋白(0.40±0.04，P<0.05)水平顯著降低；與HIV-1 Tat組相比，F(xiàn)TS預(yù)處理組ZO-1蛋白(1.20±0.22，P<0.01)、NEP蛋白(0.58±0.03，P<0.05)水平顯著增加(見圖2)。

2.3 不同處理對(duì)HBEC-5i中ZO-1、NEP mRNA水平的影響 與對(duì)照組(1.00±0.00)相比，HIV-1 Tat組的ZO-1(0.42±0.10，P<0.05)、NEP(0.31±0.09,P<0.05)的mRNA顯著降低；與HIV-1 Tat組相比，F(xiàn)TS預(yù)處理組的ZO-1(1.10±0.19，P<0.05)、NEP(0.97±0.38，P<0.05)mRNA水平顯著增加(見圖3)。

與對(duì)照組相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖1 MTT法檢測不同濃度FTS對(duì)HBEC-5i細(xì)胞活力的影響(n=4,F=46.311)

與對(duì)照組相比*P<0.05，**P<0.01；與HIV-1 Tat組相比#P<0.05，##P<0.01

圖2 不同處理對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBEC-5i中ZO-1、NEP蛋白表達(dá)的影響(A：n=3,F=6.816;B:n=3,F=12.25)

與對(duì)照組相比*P<0.05；與HIV-1 Tat組相比#P<0.05

圖3 不同處理對(duì)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBEC-5i中ZO-1、NEP mRNA表達(dá)的影響(A：n=3,F=12.95;B:n=3，F(xiàn)=5.108)

3 討 論

血腦屏障由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足和周細(xì)胞構(gòu)成，緊密連接是其必不可少的組成部分，在血腦屏障完整性的調(diào)節(jié)中緊密連接是主要的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)[14]。正常情況下，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接相結(jié)合形成一層無孔的內(nèi)皮使血腦屏障能選擇性滲透外圍蛋白質(zhì)和其他分子，緊密連接提供了高跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(transendothelial electrical resistance，TEER)，進(jìn)一步限制多種類型的大分子物質(zhì)通透[15]。

ZO-1作為支架分子調(diào)節(jié)跨膜緊密連接與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的聯(lián)系，在維持血腦屏障的重要屬性包括阻力和滲透率中起著重要作用[16]。HIV-1 Tat蛋白是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，對(duì)病毒的生命周期至關(guān)重要，能誘導(dǎo)炎癥、毒性以及損傷多種細(xì)胞類型包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞[17]。

血腦屏障在HIV-1感染與淀粉樣變性中都有很重要的作用，調(diào)節(jié)血源性淀粉樣蛋白進(jìn)入腦內(nèi)以及大腦對(duì)淀粉樣蛋白的清除[4]。血腦屏障被認(rèn)為在艾滋病相關(guān)性癡呆(HAD)的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，有研究顯示，相比于非癡呆艾滋病患者或?qū)φ战M患者，艾滋病相關(guān)性癡呆患者中血腦屏障破壞更常見[18]。Tat蛋白不僅具有神經(jīng)毒性，也已被證明能夠破壞血腦屏障的完整性[19]。Lei Chen等人研究觀察到HIV-1 Tat時(shí)間依賴性地提高小鼠血腦屏障(BBB)通透性，在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中也同樣觀察到HIV-1 Tat誘導(dǎo)的血腦屏障(BBB)通透性增加及白細(xì)胞的黏附與遷移增加[5]。

本研究也觀察到，HIV-1 Tat刺激HBEC-5i后ZO-1蛋白和mRNA的表達(dá)量下降(見圖2A、圖3A)，從而驗(yàn)證了HIV-1 Tat在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平可誘導(dǎo)ZO-1蛋白和mRNA表達(dá)的下調(diào)，進(jìn)而影響HBEC-5i細(xì)胞間的緊密連接形成。

腦啡肽酶(neprilysin,NEP)也稱為CD10，是一種細(xì)胞表面含鋅的金屬內(nèi)切酶，能夠降解小分子肽如緩激肽、P物質(zhì)、腦啡肽等[20,21]。近年來，NEP在Aβ分解代謝中的作用逐漸引起重視，被認(rèn)為是腦內(nèi)關(guān)鍵的Aβ降解酶[20～22]，已證實(shí)能夠降解Aβ單體[22],在類似NEP的同系物中NEP具有降解Aβ1-40與Aβ1-42最強(qiáng)活性[21]，在NEP敲除小鼠腦內(nèi)Aβ40與Aβ42水平顯著上升[22]。Rempel HC等人研究觀察到腦內(nèi)NEP蛋白表達(dá)量與NEP酶活性成線性關(guān)系，HIV-1 Tat能夠特定地抑制NEP活性，增加腦組織內(nèi)Aβ沉積[21]。本研究中也觀察到HIV-1 Tat能誘導(dǎo)HBEC-5i中NEP蛋白與mRNA的下調(diào)，使NEP降解Aβ的活性降低，同時(shí)誘導(dǎo)ZO-1蛋白下調(diào)、破壞血腦屏障，導(dǎo)致腦內(nèi)Aβ沉積增加。Ras信號(hào)通路抑制劑法尼基硫代水楊酸(FTS)能夠減弱HIV-1 Tat的作用，使ZO-1表達(dá)上調(diào)，保護(hù)血腦屏障，上調(diào)NEP蛋白水平，可能減少Aβ在腦細(xì)胞內(nèi)的沉積。

HIV-1 Tat能促進(jìn)Aβ在腦內(nèi)的沉積，但在艾滋病患者中艾滋病相關(guān)性癡呆發(fā)生的介導(dǎo)機(jī)制目前尚不清楚[7]。已證實(shí)，許多的細(xì)胞信號(hào)通路參與緊密連接蛋白的調(diào)節(jié)，而Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與氧化應(yīng)激有關(guān)[23]。Ras信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、運(yùn)動(dòng)和死亡等細(xì)胞過程，是許多信號(hào)通路的主要交叉點(diǎn)，Ras信號(hào)通過下游效應(yīng)器Mitogen-activated protein kinase kinase(MEK)/Extracellular signal-regulated kinases(ERK)發(fā)揮作用，有研究顯示Ras信號(hào)通路參與緊密連接蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，與血腦屏障通透性密切相關(guān)[13]。有研究顯示，在Tat刺激的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中觀察到劑量依賴性氧化應(yīng)激增加及細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽減少[18]，細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)是Ras/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要的第二信使，HIV-1 Tat能激活Ras，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧增加，通過Ras/ERK介導(dǎo)緊密連接蛋白的破壞[23]，然而目前尚不清楚Ras信號(hào)通路是否參與調(diào)節(jié)HIV-1 Tat蛋白誘導(dǎo)Aβ沉積。

本研究中用Ras信號(hào)通路抑制劑FTS預(yù)處理HBEC-5i細(xì)胞，與HIV-1 Tat共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)FTS可減弱HIV-1 Tat對(duì)ZO-1及NEP蛋白與mRNA的抑制作用，上調(diào)ZO-1與NEP蛋白及mRNA表達(dá)(見圖2、圖3)，推測可能與抑制Ras信號(hào)通路活性減少HIV-1 Tat誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上，HIV-1 Tat可誘導(dǎo)緊密連接蛋白ZO-1下調(diào)導(dǎo)致血腦屏障破壞，同時(shí)抑制NEP表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)HIV-1 Tat可通過激活Ras信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下調(diào)人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBEC-5i)緊密連接ZO-1蛋白與mRNA，導(dǎo)致血腦屏障破壞，同時(shí)抑制NEP的表達(dá)，影響Aβ在腦內(nèi)的沉積。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)HIV-1感染促進(jìn)中樞系統(tǒng)Aβ沉積的可能機(jī)制提供了新的認(rèn)識(shí)，將Ras信號(hào)通路作為目標(biāo)可能對(duì)艾滋病相關(guān)性癡呆提供一個(gè)新的治療途徑。

[1]Andras IE,Eum SY,Toborek M.Lipid rafts and functional caveolae regulate HIV-induced amyloid beta accumulation in brain endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,421(2):177-183.

[2]Andras IE,Eum SY,Huang W,et al.HIV-1-induced amyloid beta accumulation in brain endothelial cells is attenuated by simvastatin[J].Mol Cell Neurosci,2010,43(2):232-243.

[3]Chen X,Hui L,Geiger NH,et al.Endolysosome involvement in HIV-1 transactivator protein-induced neuronal amyloid beta production[J].Neurobiol Aging,2013,34(10):2370-2378.

[4]Andras IE,Toborek M.HIV-1 stimulates nuclear entry of amyloid beta via dynamin dependent EEA1 and TGF-beta/Smad signaling[J].Exp Cell Res,2014,323(1):66-76.

[5]Chen L,Choi JJ,Choi YJ,et al.HIV-1 Tat-induced cerebrovascular toxicity is enhanced in mice with amyloid deposits[J].Neurobiol Aging,2012,33(8):1579-1590.

[6]Andras IE,Rha G,Huang W,et al.Simvastatin protects against amyloid beta and HIV-1 Tat-induced promoter activities of inflammatory genes in brain endothelial cells[J].Mol Pharmacol,2008,73(5):1424-1433.

[7]Kim J,Yoon JH,Kim YS.HIV-1 Tat interacts with and regulates the localization and processing of amyloid precursor protein [J].PLoS One,2013,8(11):e77972.

[8]Huang W,Rha GB,Han MJ,et al.PPARalpha and PPARgamma effectively protect against HIV-induced inflammatory responses in brain endothelial cells[J].J Neurochem,2008,107(2):497-509.

[9]Chen PT,Chen CL,Lin LT,et al.Design of peptide substrate for sensitively and specifically detecting two abeta-degrading enzymes:neprilysin and angiotensin-converting enzyme[J].PLoS One,2016,11(4):e0153360.

[10]Ito S,Matsumiya K,Ohtsuki S,et al.Contributions of degradation and brain-to-blood elimination across the blood-brain barrier to cerebral clearance of human amyloid-beta peptide(1-40) in mouse brain[J].J Cereb Blood Flow Metab,2013,33(11):1770-1777.

[11]陳艷蘭,黃 文,巫相宏,等.Rho/ROCK信號(hào)通路在HIV-1 Tat誘導(dǎo)血腦屏障破壞及β淀粉樣蛋白沉積中的作用[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2015,32(12):1060-1063.

[12]Chen Y,Huang W,Jiang W,et al.HIV-1 Tat regulates occludin and abeta transfer receptor expression in brain endothelial cells via Rho/ROCK signaling pathway[J].Oxid Med Cell Longev,2016,4196572.

[13]Zhong Y,Smart EJ,Weksler B,et al.Caveolin-1 regulates human immunodeficiency virus-1 Tat-induced alterations of tight junction protein expression via modulation of the Ras signaling[J].J Neurosci,2008,28(31):7788-7796.

[14]Huang W,Eum SY,Andras IE,et al.PPARalpha and PPARgamma attenuate HIV-induced dysregulation of tight junction proteins by modulations of matrix metalloproteinase and proteasome activities[J].FASEB J,2009,23(5):1596-1606.

[15]Strazza M,Pirrone V,Wigdahl B,et al.Breaking down the barrier: the effects of HIV-1 on the blood-brain barrier[J].Brain Res,2011,1399:96-115.

[16]Alluri H,Wilson RL,Anasooya Shaji C,et al.Melatonin Prpserves blood-brain barrier integrity and permeability via matrix metalloproteinase-9 inhibition[J].PLoS One,2016,11(5):e0154427.

[17]Woollard SM,Bhargavan B,Yu F,et al.Differential effects of Tat proteins derived from HIV-1 subtypes B and recombinant CRF02_AG on human brain microvascular endothelial cells: implications for blood-brain barrier dysfunction[J].J Cereb Blood Flow Metab,2014,34(6):1047-1059.

[18]Banerjee A,Zhang X,Manda KR,et al.HIV proteins (gp120 and Tat) and methamphetamine in oxidative stress-induced damage in the brain:potential role of the thiol antioxidant N-acetylcysteine amide[J].Free Radic Biol Med,2010,48(10):1388-1398.

[19]Niu F,Yao H,Zhang W,et al.Tat 101-mediated enhancement of brain pericyte migration involves platelet-derived growth factor subunit B homodimer: implications for human immunodeficiency virus-associated neurocognitive disorders[J].J Neurosci,2014,34(35):11812-11825.

[20]Brian Spencer RaM,Ryan Gindi,et al.Peripheral delivery of a CNS targeted,metalo-protease reduces Aβ toxicity in a mouse of Alzheimer’s disease [J].PLoS One,2011,6(1):e16575.

[21]Rempel HC,Pulliam L.HIV-1 Tat inhibits neprilysin and elevates amyloid beta[J].AIDS,2005,19:127-135.

[22]Liu M,Guo H,Li C,et al.Cognitive improvement of compound danshen in an Abeta25-35 peptide-induced rat model of Alzheimer’s isease[J].BMC Complement Altern Med,2015,15:382-391.

[23]Dalvi P,Wang K,Mermis J,et al.HIV-1/cocaine induced oxidative stress disrupts tight junction protein-1 in human pulmonary microvascular endothelial cells:role of Ras/ERK1/2 pathway[J].PLoS One,2014,9(1):e85246.

The role of Ras signaling pathway in HIV-1 Tat induced dysfunction of ZO-1 and Neprilysin

JIANGWenlin,HUANGWen,CHENYanlan,etal.

(DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To evaluate the role of Ras singnaling pathway in HIV-1 Tat-induced dysfunction of ZO-1 and neprilysin (NEP,endogenous Aβ-degrading enzyme) in human cerebral microvascular endothelium cells (HBEC-5i). Methods HBEC-5i viability was tested by MTT assay,with the exposure of different concentrations of Ras inhibitor farnesylthiosalicylic acid (FTS).The levels of protein and mRNA of ZO-1 and NEP in HBEC-5i were evaluated with Western blot and Real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) assay respectively.Results Farnesylthiosalicylic acid at 20 μmol/L (0.35±0.06，P>0.05) or less had no significant effect on the HBEC-5i cell viability as determined by the MTT assay.Treatment with HIV-1 Tat decreased protein and mRNA levels of ZO-1 (0.53±0.07，P<0.01 in protein levels；0.42±0.10，P<0.05 in mRNA levels) and NEP (0.40±0.04，P<0.05 in protein levels；0.31±0.09，P<0.05 in mRNA levels).While inhibition of Ras by FTS effectively protected against HIV-1 Tat-induced downregulation of ZO-1 (1.20±0.22，P<0.01 in protein levels；1.10±0.19，P<0.05,in mRNA levels) and NEP(0.58±0.03，P<0.05 in protein levels；0.97±0.38,P<0.05 in mRNA levels) expression.Conclusion These results show that HIV-1 Tat induces dysfunction of ZO-1 and neprilysin in both protein and mRNA levels and these effects can be attenuated by FTS.Ras signaling pathway plays a role in HIV-1 Tat-induced ZO-1 dysfunction and neprilysin in cerebral microvascular endothelial cells.

HIV-1 Tat; Ras signaling pathway; ZO-1; NEP

2016-10-14；

2016-11-29

國家自然科學(xué)基金(No.81371333)

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 南寧 530021；2.廣西廣西壯族自治區(qū)南溪山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 桂林 541000)

黃 文，E-mail:hwen1229@163.com

1003-2754(2017)02-0100-05

R749.1+1

A