王藝純+唐秋竹

[摘要]目的 建立通竅耳聾丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法 對通竅耳聾丸中各味藥材進(jìn)行顯微鑒別，并對柴胡、龍膽進(jìn)行薄層色譜鑒別；采用HPLC法測定龍膽苦苷含量。采用Phenomenon Luna C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（25∶75）；流速為0.8 ml/min；檢測波長270 nm；柱溫35℃。結(jié)果 顯微鑒別特征專屬，薄層色譜斑點(diǎn)清晰陰性對照無干擾；龍膽苦苷在0.091～0.912 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.9999，n=6）；平均回收率為99.9%（n=6），RSD=1.2%。結(jié)論 本方法易于操作，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性良好，可用于通竅耳聾丸制劑的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]通竅耳聾丸；質(zhì)量控制；顯微鑒別；薄層色譜；高效液相色譜法

[中圖分類號] R927.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（c）-0115-03

[Abstract]Objective To establish quality control standards for Tongqiao Erlong Pills.Methods Microscopical identification was used to qualitative of material medcine prescription，thin layer chromatography （TLC） method were established to identify Bupleuri Radix and Gentianae Radix et Rhizoma，gentiopicroside was determined by HPLC with Phenomenon Luna C18 column （4.6 mm×250 mm，5 μm） used with the mobile phase of mthanol-water （25∶75） at a flow rate of 0.8 ml/min.The detecting wavelength was 270 nm，the column temperature was 35℃.Results Microscopic identification features were exclusive.The spots of TLC were clear and the negative control without interference.The linear range of gentiopicroside was 0.091-0.912 μg（r=0.9999，n=6） with a great linear relationship.The mean recovery rates were 99.9% （n=6），RSD equal to 1.2%.Conclusion This method is simple，rapid，reproducible，precise，reliable and accurate.It can be used for the quantification of Tongqiao Erlong Pills.

[Key words]Tongqiao Erlong Pills；Quality control；Microscopical；Thin layer chromatography；HPLC

通竅耳聾丸由北柴胡、龍膽、蘆薈、熟大黃、黃芩、青黛、天南星（礬炙）、木香、青皮（醋炙）、陳皮、當(dāng)歸、梔子（姜炙）12種中藥材組成，具有瀉火清肝，潤便通竅之功效。臨床使用病癥為肝經(jīng)熱盛，頭目眩暈，耳聾蟬鳴，耳底腫痛，目赤口苦，胸膈滿悶，大便燥結(jié)[1]。通竅耳聾丸現(xiàn)行法定標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》第1冊僅有性狀及檢查項(xiàng)，不能很好地控制其質(zhì)量。本試驗(yàn)增加了通竅耳聾丸各味藥材的顯微鑒定，并對龍膽及柴胡進(jìn)行了薄層色譜鑒別[2-3]。采用HPLC法對方中君藥龍膽進(jìn)行了含量測定[4]。

1儀器與試藥

生物顯微鏡顯微鏡（日本尼康公司，型號80I，視場22 mm/25 mm）；薄層色譜數(shù)碼相機(jī)成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司，型號CAMCAG，光源頻率：25～30 kHz）；高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，型號：1200系列，在線脫氣，四元泵，自動進(jìn)樣，DAD檢測器）；賽多利斯BT-125D電子天平（美國賽多利斯公司，型號：BT125D，1/100 000天平）；AE-160電子天平（梅特勒-托利多測量技術(shù)有限公司，型號：AE160，1/10 000天平）；超純水機(jī)（法國密理博公司，型號：Milli-Q，產(chǎn)水電阻率：>18.2 MΩ·cm）。

龍膽苦苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110770-201013）、龍膽對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121530-200501）、柴胡對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：120992-201108）；甲醇（Fisher Scientific，色譜純），水為超純水（臨用新制），其他試劑試藥均為優(yōu)級純。

2方法與結(jié)果

2.1顯微特征鑒別

取通竅耳聾丸，研細(xì)，取粉末適量，加水合氯醛透化，置顯微鏡下觀察各藥味的顯微鑒別特征，結(jié)果見圖1。

黃芩：纖維淡黃色，梭形，壁厚，孔溝細(xì)（圖1A）。柴胡：油管含淡黃色或黃棕色條狀分泌物（圖1B）。木香：木纖維成束，長梭形，直徑14～26 μm，紋孔口橫裂縫狀、十字狀或人字狀（圖1C）。青黛：不規(guī)則塊片或顆粒藍(lán)色（圖1D）。熟大黃：草酸鈣簇晶大，直徑60～140 μm（圖1E）。梔子：種皮石細(xì)胞黃色或淡棕色，多破碎，完整者長多角形、長方形或形狀不規(guī)則，壁厚，有大的圓形紋孔，胞腔棕紅色（圖1F）。陳皮：草酸鈣方晶成片存在于無色薄壁組織中（圖1G）[5]。

2.2薄層色譜鑒別

2.2.1柴胡的薄層色譜鑒別

2.2.1.1供試品溶液的制備 取通竅耳聾丸樣品5 g，研細(xì)，加入甲醇約50 ml，超聲波提取30 min，濾過，濾液蒸干，蒸干后的殘?jiān)?%氫氧化鈉溶液20 ml，加熱使溶解，分次轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇強(qiáng)力振搖提取2次，每次20 ml，合并正丁醇液，蒸干。蒸干后的殘?jiān)偌铀? ml使溶解，溶解后樣品通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），分別用水80 ml洗脫，水液棄去，再用80 ml 20%的乙醇洗脫，洗脫液棄去，最后用100 ml 70%的乙醇洗脫，洗脫液置80℃水浴上蒸干，蒸干后的殘?jiān)? ml甲醇溶解，作為供試品溶液[6]。

2.2.1.2對照藥材溶液的制備 柴胡對照藥材粉末0.5 g，加入約20 ml甲醇，超聲波提取10 min，濾過，濾液蒸干，蒸干后的殘?jiān)?%氫氧化鈉溶液20 ml，加熱使溶解，分次轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇強(qiáng)力振搖提取2次，每次20 ml，合并正丁醇液，蒸干。蒸干后的殘?jiān)偌铀? ml使溶解，溶解后樣品通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），分別用水80 ml洗脫，水液棄去，再用80 ml 20%的乙醇洗脫，洗脫液棄去，最后用100 ml 70%的乙醇洗脫，洗脫液置80℃水浴上蒸干，蒸干后的殘?jiān)? ml甲醇溶解，作為對照藥材溶液。

2.2.1.3陰性樣品的制備 按通竅耳聾丸的處方組成、工藝及制法制成缺柴胡的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法，同法制成陰性樣品。

2.2.1.4試驗(yàn)方法 吸取上述供試品、對照藥材及陰性樣品溶液各3 μl，以條帶狀點(diǎn)樣法點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑制備的硅膠G薄層板上，三氯甲烷-甲醇-水（30∶10∶1）作為展開劑，置于雙槽展開缸內(nèi)，預(yù)飽和20 min，展開，取出，晾干，以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液作為顯色劑，并在置于105℃的烘箱內(nèi)加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別于日光及紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2.1.5結(jié)果判定 供試品色譜中，在與柴胡對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紅色斑點(diǎn)及相同顏色的熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)顯色清晰，且陰性樣品無干擾，證明該方法可行。結(jié)果見圖2。

2.2.2龍膽的薄層鑒別

2.2.2.1供試品溶液的制備 取通竅耳聾丸樣品5 g，研細(xì)，加10 ml 17%氨溶液潤濕，加30 ml二氯甲烷，超聲提取15 min，濾過，蒸干，殘?jiān)? ml二氯甲烷溶解，即得[7-9]。

2.2.2.2對照藥材溶液的制備 取龍膽對照藥材0.5 g，加17%氨溶液1 ml潤濕，加10 ml二氯甲烷，超聲提取15 min，濾過，蒸干，殘?jiān)? ml二氯甲烷溶解，即得。

2.2.2.3陰性樣品的制備 按通竅耳聾丸的處方組成、工藝及制法制成缺龍膽的陰性對照樣品5 g，按“2.2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.2.2.4試驗(yàn)方法 吸取上述供試品、對照藥材及陰性樣品溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑制備的硅膠G薄層板上，二氯甲烷-乙醇（15∶1.5）作為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。

2.2.2.5結(jié)果判定 供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同綠色熒光斑點(diǎn)。斑點(diǎn)清晰，且陰性樣品無干擾，證明該法可行。結(jié)果見圖3。

2.3龍膽苦苷的含量測定

2.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Phenomenon Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（25∶75）；檢測波長：270 nm；流速：0.8 ml/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μl。在上述條件下龍膽苦苷與其他組分色譜峰可基線分離，與相鄰峰分離度均>1.5，按龍膽苦苷峰計(jì)算理論板數(shù)≤3000。

2.3.2溶液的制備及樣品測定

2.3.2.1供試品溶液的制備 取通竅耳聾丸樣品10 g，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，用移液管精密加入20 ml甲醇，稱定重量，置于90℃水浴上加熱回流15 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得[10-15]。

2.3.2.2對照品溶液的制備 取龍膽苦苷對照品10 mg，用1/100 000天平精密稱定，轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，加甲醇適量使對照品溶解，用甲醇稀釋至刻度，即得每1毫升含0.2 mg的龍膽苦苷對照品溶液。

2.3.2.3陰性對照溶液的制備 按通竅耳聾丸的處方組成、工藝及制法制成缺龍膽的陰性對照樣品，按上述供試品溶液制備方法，制得陰性對照樣品溶液。依正文所述方法進(jìn)行測定。結(jié)果龍膽陰性樣品色譜在與龍膽苦苷相應(yīng)的保留時(shí)間附近無干擾峰檢出，證明陰性無干擾（圖4～6）。

2.3.2.4線性范圍的考察 分別精密吸取按上述方法配制好的對照品溶液（濃度為每1毫升溶液含0.0912 mg龍膽苦苷）1、2、4、6、8、10 μl測定，以對照品進(jìn)樣量（x，μg）作為橫坐標(biāo)，以龍膽苦苷峰面積（y）作為為縱坐標(biāo)，按照偏最小二乘法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到龍膽苦苷進(jìn)樣量與峰面積的線性回歸方程為y=2365.09x-4.168（r=0.9999）。結(jié)果表明龍膽苦苷在0.091～0.912 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積之間具有較好的線性關(guān)系，滿足外標(biāo)法進(jìn)行含量測定的需求。

2.3.2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀，重復(fù)6次，測定其色譜峰面積值，結(jié)果其龍膽苦苷峰面積積分值RSD為0.64%，提示所使用的液相色譜儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.3.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，分別考察0、3、6、12、24 h龍膽苦苷峰面積，結(jié)果龍膽苦苷峰面積積分值穩(wěn)定，結(jié)果提示該方法制備的供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品（長春人民藥業(yè)有限公司，批號：20130406）6份依“2.3.1.1”項(xiàng)下方法提取，進(jìn)行測定，結(jié)果RSD=2.0%，說明本法重復(fù)性良好。

2.3.2.8加樣回收率試驗(yàn) 采取半量加樣回收率測定法，取已知含量的供試品（長春人民藥業(yè)有限公司，批號：20130406，含龍膽苦苷1.44 mg/g）0.5 g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，精密量取龍膽苦苷對照品的甲醇溶液（0.0392 mg/ml）20 ml，依法測定回收率，結(jié)果測得龍膽苦苷的平均回收率為99.9%，RSD=1.2%。結(jié)果提示本法回收率較好，準(zhǔn)確度較高（表1）。

2.3.2.9樣品的測定 依正文方法測定9批樣品，結(jié)果見表2。

3討論

3.1檢測波長的選擇

以甲醇溶液為空白，采用1 cm比色池，經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)對龍膽苦苷的甲醇溶液在200～800 nm范圍內(nèi)的吸收度進(jìn)行掃描，結(jié)果龍膽苦苷對照品在272.0 nm波長處有最大吸收，并且同時(shí)參考《中國藥典》2015年版一部龍膽藥材項(xiàng)下的龍膽苦苷的測定方法，選擇270 nm為本實(shí)驗(yàn)的測定波長。

3.2流動相的選擇

參照《中國藥典》2015年版一部龍膽項(xiàng)下含量測定方法，采用甲醇∶水（25∶75）為流動相，結(jié)果龍膽苦苷與其他色譜峰的分離度均>2.0，且龍膽苦苷色譜峰出峰時(shí)間適中。決定采用甲醇∶水（25∶75）作為本試驗(yàn)的流動相。

3.3質(zhì)量分析評價(jià)

通竅耳聾丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不能有效控制本制劑質(zhì)量。筆者對方中君藥龍膽中主成分龍膽苦苷進(jìn)行了含量測定，并采用顯微鑒定和薄層色譜鑒別的方式對方中多數(shù)藥材進(jìn)行了鑒別。與原標(biāo)準(zhǔn)比較，本試驗(yàn)可以更好地控制通竅耳聾丸的質(zhì)量，并為繼續(xù)研究本制劑的質(zhì)量控制方法提供了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2016-10-15 本文編輯：方菊花）