劉彩霞段志敏杜蕾蕾曾 榮沈永年胡素泉劉維達(dá)陳 青李 岷

申克孢子絲菌酵母相對人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞NF－κB信號通路及TNF－α的影響

劉彩霞1段志敏1杜蕾蕾1曾 榮1沈永年1胡素泉1劉維達(dá)1陳 青2李 岷1

目的:明確申克孢子絲菌酵母相對人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP－1)NF－κB信號通路激活和腫瘤壞死因子α(TNF－α)分泌的影響。方法:實(shí)時熒光定量PCR分析申克孢子絲菌酵母相刺激THP－1細(xì)胞TNF－αmRNA的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法檢測TNF－α分泌量，免疫印跡法分析申克孢子絲菌酵母相體外作用于THP－1細(xì)胞后IκBα和磷酸化IκBα的水平，免疫熒光法觀察NF－κB－p65核轉(zhuǎn)位。同時設(shè)置地塞米松(NF－κB抑制劑)抑制組，并檢測100 nM地塞米松預(yù)處理THP－1細(xì)胞后TNF－αmRNA水平的變化。結(jié)果:申克孢子絲菌酵母相刺激THP－1細(xì)胞后6 h TNF－αmRNA水平顯著高于空白對照組(P＜0．001)。申克孢子絲菌酵母相刺激THP－1細(xì)胞后24 h，TNF－α蛋白水平為(4610．419±121．501)pg/mL，顯著高于空白對照組(186．964±98．073)pg/mL，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．001)。申克孢子絲菌酵母相作用THP－1細(xì)胞后30～60 min，磷酸化IκBα蛋白水平顯著升高，為時間依賴性。申克孢子絲菌酵母相組細(xì)胞核內(nèi)NF－κB－p65較空白對照組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。100 nM地塞米松預(yù)處理各組THP－1細(xì)胞后，TNF－αmRNA水平較前明顯降低。結(jié)論:人THP－1細(xì)胞體外與申克孢子絲菌酵母相作用后激活NF－κB信號通路并上調(diào)TNF－α分泌。

申克孢子絲菌;單核細(xì)胞白血病;腫瘤壞死因子α;NF－κB

孢子絲菌病(sporotrichosis)是一種由雙相病原真菌申克孢子絲菌(Sporothrix schenckii)感染引起的亞急性或慢性肉芽腫性疾病。申克孢子絲菌是一種分布于自然界的腐生菌，可從土壤、木材、植物、水果、昆蟲、海藻、海生動物及動物糞便中分離出來。孢子絲菌病遍布世界各地，熱帶及亞熱帶地區(qū)多見，在我國主要集中于東北及長江中下游地區(qū)，多為局部微創(chuàng)傷后接觸孢子絲菌污染物致病，通常散發(fā)，偶因爆發(fā)洪水或飼養(yǎng)寵物而引起小范圍爆發(fā)流行［1－3］。近年孢子絲菌病發(fā)病率較前攀升，隨著抗真菌藥物的應(yīng)用，多藥耐藥菌株不斷出現(xiàn)，威脅人類健康［4］。因此，研究人體天然免疫反應(yīng)在抗申克孢子絲菌感染過程中的作用極為重要。單核巨噬細(xì)胞作為宿主天然免疫中重要的反應(yīng)細(xì)胞，能夠識別并吞噬、殺傷、清除入侵的申克孢子絲菌病原體［5］。本研究旨在探討申克孢子絲菌酵母相能否激活人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(Human acute monocytic leukemia cell line，THP－1)的核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF－κB)信號通路并誘導(dǎo)分泌TNF－α。

1 材料和方法

1．1 材料細(xì)胞、菌株、主要試劑:申克孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(F)D1a，由中國微生物菌種保藏管理委員會醫(yī)學(xué)真菌中心提供。人THP－1細(xì)胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。兔抗人IκBα、磷酸化IκBα抗體和β肌動蛋白抗體為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。TNF－α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒為欣博盛公司產(chǎn)品。PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。iTaq Universal SYBR Green Supermix為美國Bio－rad公司產(chǎn)品。佛波酯(PMA)、Curdlan為美國Sigma公司產(chǎn)品，地塞米松為美國Invivogen公司產(chǎn)品。

1．2 方法(1)申克孢子絲菌酵母相誘導(dǎo):將申克孢子絲菌接種至沙堡弱固體培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)7 d，活化3次后轉(zhuǎn)種于含2%葡萄糖的腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基，37℃5%CO2下培養(yǎng)，每14天傳代，觀察菌落及革蘭染色后顯微鏡下形態(tài)是否完全轉(zhuǎn)化為酵母相。培養(yǎng)14～28天制備酵母相菌液，生理鹽水沖洗2遍，計數(shù)后配制成109CFU/mL濃度菌懸液待用。(2)細(xì)胞培養(yǎng):人THP－1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。將細(xì)胞制備成2×105/mL細(xì)胞懸液，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔1 mL)及6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔2 mL)，加入100 ng/mL PMA刺激48 h后誘導(dǎo)形成巨噬細(xì)胞，根據(jù)預(yù)實(shí)驗，分別加入終濃度為2×106CFU/mL的申克孢子絲菌酵母相及100μg/mL的Curdlan共培養(yǎng)。(3)實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR:申克孢子絲菌與THP－1細(xì)胞共孵育，并設(shè)陽性刺激物Curdlan組、空白對照組、地塞米松抑制組(100 nM NF－κB抑制劑地塞米松預(yù)先30 min與THP－1細(xì)胞共培養(yǎng))。預(yù)實(shí)驗中曾設(shè)置多個申克孢子絲菌與THP－1細(xì)胞共孵育時間點(diǎn)，刺激后隨時間延長，TNF－α mRNA表達(dá)水平漸升高，6 h后達(dá)最高峰，繼續(xù)延長作用時間則開始降低。本實(shí)驗選擇3、6 h作為觀察時間，而地塞米松抑制組選擇6 h。TRIzol法抽提總RNA，按PrimeScript RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ABI 7300 PCR儀，采用Syber green法對目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。以β－肌動蛋白作為內(nèi)參照，引物TNF－α及β－肌動蛋白由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列TNF－α上游5'－CGAGTGACAAGCCTGTAGC－3'，下游5'－GGTGTGGGTGAGGAGCACAT－3'，β－肌動蛋白上游5'－TCTGGCACCACACCTTCAT－3'，下游5'－AGGCATACAGGGACAGCAC－3'，反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃10 min，變性95℃15 s，退火60℃30 s，延伸72℃30 s，循環(huán)數(shù)40。采用2－△△Ct法計算目的基因的變化水平，△Ct=目的基因－內(nèi)參照(β肌動蛋白);某一樣品的△△Ct=某一樣品△Ct–對照組樣品的△Ct。2－△△Ct值即為實(shí)驗組目的基因較對照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)。(4)ELISA法:刺激THP－1細(xì)胞后24 h，收集上清液，按照試劑盒說明書檢測TNF－α含量。根據(jù)預(yù)實(shí)驗，申克孢子絲菌酵母相刺激THP－1細(xì)胞后，上清液TNF－α含量升高更明顯。設(shè)置不同的共孵育時間，發(fā)現(xiàn)刺激24 h后上清液TNF－α含量達(dá)到最高。本實(shí)驗選擇24 h作為觀察時間。(5)Western印跡分析:收集處理后的THP－1細(xì)胞，裂解細(xì)胞，提取總蛋白。應(yīng)用BCA定量法計算蛋白濃度，煮沸變性，SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%血清白蛋白(BSA)封閉2 h，兔抗人單克隆抗體4℃孵育過夜。TBST液(Tris－Buffered Saline Tween－20)洗膜3次后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG第二抗體孵育2 h，Supersignal試劑顯色發(fā)光，檢測申克孢子絲菌酵母相與THP－1細(xì)胞共孵育30、60 min后IκBα和磷酸化IκBα水平變化。(7)免疫熒光法觀察NF－κB－p65核轉(zhuǎn)位:THP－1細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)同上。共孵育16 h后吸棄培養(yǎng)基，細(xì)胞待PBS清洗后用4%多聚甲醛室溫固定30 min，并用0．1% Triton X－100室溫通透15 min。3%BSA室溫封閉1 h后，細(xì)胞與NF－κB－p65抗體4℃孵育過夜，TBST洗后與Texas Red－羊抗兔IgG室溫避光孵育1 h，TBST漂洗干凈后用500 ng/mL DAPI染核，避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察，NF－κB－p65呈紅色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色，核轉(zhuǎn)位時紅色熒光進(jìn)入細(xì)胞核。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件，計量數(shù)據(jù)以珋x±s表示。不同時間不同組別間TNF－αmRNA比較采用多因素方差分析;不同組別間TNF－α蛋白含量的比較采用單因素方差分析，并采用LSD－t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 申克孢子絲菌酵母相對THP－1細(xì)胞TNF－α mRNA水平的影響申克孢子絲菌酵母相刺激THP－1細(xì)胞后3、6 h，TNF－αmRNA水平逐漸增高，均顯著高于空白對照組，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 4503．89，P＜0．001)。TNF－αmRNA水平的變化情況，見表1。

2．2 申克孢子絲菌酵母相對THP－1細(xì)胞TNF－α表達(dá)的影響申克孢子絲菌酵母相與THP－1細(xì)胞共孵育24 h，申克孢子絲菌組、Curdlan組、空白對照組的上清液中TNF－α蛋白濃度分別為(4610．419± 121．501)pg/L、(4505．824±198．124)pg/L、(186．964± 98．073)pg/L，申克孢子絲菌組、Curdlan組與空白對照組比較TNF－α蛋白濃度均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1802．37，P＜0．001)。

表1 申克孢子絲菌酵母對TNF－αmRNA水平的影響

表1 申克孢子絲菌酵母對TNF－αmRNA水平的影響

注:a與空白對照組比較，P＜0．01

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2．3 申克孢子絲菌酵母相對THP－1細(xì)胞IκBα激活的影響刺激后30 min，與空白對照組比，申克孢子絲菌酵母相刺激后30 min磷酸化IκBα蛋白水平已升高，60 min時磷酸化IκBα蛋白水平顯著升高;IκBα蛋白水平則相應(yīng)有所降低，如圖1示申克孢子絲菌酵母相能夠激活THP－1細(xì)胞信號分子IκBα，并呈時間依賴性。

圖1 申克孢子絲菌酵母對THP－1細(xì)胞IκBα活化的影響

2．4 申克孢子絲菌酵母相對THP－1細(xì)胞NF－κB－p65核轉(zhuǎn)位的影響結(jié)果見圖2，空白對照組的NF－κB－p65主要位于細(xì)胞漿，細(xì)胞核內(nèi)僅少量分布;而申克孢子絲菌酵母相刺激THP－1細(xì)胞后，細(xì)胞核內(nèi)NF－κB－p65熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，進(jìn)一步提示申克孢子絲菌酵母相能夠激活NF－κB通路。

圖2 申克孢子絲菌酵母對THP－1細(xì)胞NF－κB－p65核轉(zhuǎn)位的影響

2．5 地塞米松對申克孢子絲菌酵母相上調(diào)THP－1細(xì)胞TNF－αmRNA的影響100 nM地塞米松預(yù)處理THP－1細(xì)胞30 min后，分別與申克孢子絲菌酵母相、Curdlan共培養(yǎng)6 h，TNF－αmRNA水平見表2。用地塞米松阻斷后各組TNF－αmRNA水平較未用地塞米松組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=564．81，P＜0．001)，表明100 nM地塞米松抑制申克孢子絲菌酵母相誘導(dǎo)的TNF－αmRNA上調(diào)。

表2 地塞米松對申克孢子絲菌酵母上調(diào)THP－1細(xì)胞TNF－αmRNA轉(zhuǎn)錄的影響

表2 地塞米松對申克孢子絲菌酵母上調(diào)THP－1細(xì)胞TNF－αmRNA轉(zhuǎn)錄的影響

注:a與空白對照組比較，P＜0．001;b與未用地塞米松阻斷組比較，P＜0．01

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3 討論

天然免疫在抗真菌感染中發(fā)揮重要作用，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等作為主要的天然免疫細(xì)胞，識別、吞噬入侵的真菌，啟動細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，誘導(dǎo)特異性基因表達(dá)，最終合成分泌多種細(xì)胞因子，構(gòu)成抵御病原微生物入侵的第一道防線［6，7］。THP－1細(xì)胞是一種人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞，經(jīng)PMA誘導(dǎo)可分化為成熟的巨噬細(xì)胞，常用于單核－巨噬細(xì)胞的功能研究［8］。申克孢子絲菌是一種雙相致病真菌，該菌宿主體內(nèi)和37℃培養(yǎng)為酵母相，室溫下為分生孢子或菌絲相，皮膚創(chuàng)傷感染菌絲相待其轉(zhuǎn)換為酵母相后致病，本病患者的組織病理和電鏡檢查證實(shí)申克孢子絲菌在宿主體內(nèi)僅為酵母相［9］。因此，本研究選用申克孢子絲菌酵母相為研究對象，探討THP－1細(xì)胞經(jīng)申克孢子絲菌酵母相刺激后能否激活NF－κB信號通路并誘導(dǎo)分泌TNF－α。TNF－α是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的前炎癥因子，主要由激活的單核巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞分泌，能促進(jìn)IL－12、IFN－γ表達(dá)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化及樹突狀細(xì)胞遷移，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［10］。有研究指出，TNF－α在抗白念珠菌感染中發(fā)揮重要作用［11］。Carlos等［12］對申克孢子絲菌感染的小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，TNF－α表達(dá)降低時小鼠感染的病情加重。我們研究中發(fā)現(xiàn)，申克孢子絲菌酵母相刺激THP－1細(xì)胞后，TNF－αmRNA表達(dá)呈現(xiàn)時間依賴效應(yīng)，刺激后3 h已經(jīng)出現(xiàn)升高，6 h時為3 h的4．63倍。Curdlan是一種β－1，3－D－葡聚糖，被單核巨噬細(xì)胞表面C－型凝集素受體－1(Dectin－1)識別后，能激活細(xì)胞內(nèi)信號通路，合成分泌多種細(xì)胞因子［13］。我們選用Curdlan做為激活THP－1細(xì)胞的陽性對照物，本實(shí)驗誘導(dǎo)出與申克孢子絲菌酵母相相似的效應(yīng)，刺激后6 h TNF－α mRNA水平比3 h時升高3．95倍。申克孢子絲菌酵母相作用THP－1細(xì)胞后24 h，上清液TNF－α蛋白含量顯著高于空白對照組。此研究表明申克孢子絲菌酵母相在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平均能誘導(dǎo)THP－1細(xì)胞TNF－α表達(dá)上調(diào)。Negrini等［14］和Sass 等［15］用申克孢子絲菌酵母相或脂類抗原刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，能誘發(fā)炎癥反應(yīng)使TNF－α等表達(dá)增加。Romo－Lozano等［16］用申克孢子絲菌酵母相刺激肥大細(xì)胞，激活ERK信號通路，誘導(dǎo)分泌IL－6、TNF－α，引發(fā)固有免疫反應(yīng)。Verdan等［17］用申克孢子絲菌酵母相刺激樹突狀細(xì)胞也能誘導(dǎo)TNF－α分泌增強(qiáng)。以上研究與本研究結(jié)果一致，可見TNF－α在抗申克孢子絲菌感染中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞內(nèi)信號分子NF－κB在調(diào)控前炎癥因子轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用，在無外界刺激因素時，p50和p65組成的亞單位與IκBα結(jié)合成復(fù)合體，在細(xì)胞漿中處于失活狀態(tài);適宜刺激后，IκB激酶復(fù)合體的激活可使IκBαN端保守的絲氨酸殘基磷酸化、降解，導(dǎo)致NF－κB p50、p65二聚體與IκBα解離，隨后移位入核，結(jié)合到NF－κB特異性結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄［18］。申克孢子絲菌酵母相刺激THP－1細(xì)胞后能使磷酸化IκBα水平升高，促進(jìn)NF－κB－p65移位入核，最終激活NF－κB信號通路。

有研究證實(shí)，100 nM地塞米松能夠阻斷NF－κB信號通路并抑制多種細(xì)胞因子的表達(dá)［19］。100 nM地塞米松預(yù)處理THP－1細(xì)胞抑制了申克孢子絲菌酵母誘導(dǎo)的TNF－αmRNA上調(diào)，以上研究提示申克孢子絲菌酵母相可能通過激活NF－κB信號通路調(diào)控TNF－α的合成。但選用地塞米松作為NF－κB信號通路阻斷劑，不能排除對實(shí)驗的其他影響，為本研究的不足之處。

本研究發(fā)現(xiàn)，人THP－1細(xì)胞經(jīng)申克孢子絲菌酵母相刺激后激活NF－κB信號通路并誘導(dǎo)分泌TNF－α，參與機(jī)體抗申克孢子絲菌天然免疫反應(yīng)。Toll樣受體2(TLR2)、TLR 4和Dectin－1是識別真菌的主要模式識別受體，已有研究表明TLR2和TLR4在抗申克孢子絲菌感染的天然免疫中發(fā)揮重要作用［7，14，15，20－22］，我們將進(jìn)一步研究Dectin－1及其下游信號通路在抗申克孢子絲菌感染免疫中的作用。

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(收稿:2016－09－13修回:2016－11－17)

Effects of Sporothrix schenckii yeasts on the activation of NF－κB signal pathway and secretion of TNF－αin human acute monocytic leukemia cells

LIUCaixia1，DUANZhimin1，DULeilei1，ZENGRong1，SHENYongnian1，HUSuquan1，LIUWeida1，CHENQing2，LIMin1．
1．InstituteofDermatology，ChineseAcademyofMedicalSicencesandPekingUnionMedicalCollege，Jiangsu KeyLaboratoryofMolecularBiologyforSkinDiseases，Nanjing210042，China;2．JiangsuProvinceBlood Center，Nanjing210042，China
Correspondingauthors:LIMin，E－mail:drlimin@sina．cn
CHENQing，E－mail:qngchen@hotmail．com

Objective:To determine the effects of Sporothrix schenckii yeasts on the activation of NF－κB signal pathway and secretion of TNF－αin human acute monocytic leukemia cells(THP－1)．Methods:The expression of TNF－αmRNA was detected by Real－time fluorescence quantitative PCR and enzyme－linked immunosorbent assay respectively．The level of phosphorylated IκBαwas detected by Western blot．NF－κB－p65 nuclear translocation was measured by immunofluorescence．The level of TNF－αmRNA in THP－1 pretreated with 100 nM Dexamethasone(a NF－κB inhibitor)for 30 minutes was detected by Real－time fluorescence quantitative PCR．Results:The levels of TNF－αmRNA in THP－1 cells treated with Sporothrix schenckii yeasts for 6 hours were increased compared with the blank control group(P＜0．001)．The secretion level of TNF－αin the Sporothrix schenckii yeasts group was 4610．419±121．501 pg/mL，which was higher than that inthe blank group(186．964±98．073 pg/mL)，with a significant difference(P＜0．001)．Phosphorylation IκBα protein increased obviously and in a time－dependent manner after treated with Sporothrix schenckii yeasts from 30 minutes to 60 minutes．The fluorescent intensity of NF－κB－p65 in the Sporothrix schenckii yeasts group was stronger than that in the blank group．The level of TNF－αmRNA was decreased in the THP－1 macrophages treated with 100 nM dexamethasone in the three groups．Conclusion:Sporothrix schenckii yeasts can increase the expression of TNF－αthrough enhancing the activation of NF－κB pathway．

sporothrix schenckii;monocytic leukemia;TNF－α;NF－κB

國家自然科學(xué)基金(編號:81502739)江蘇省自然科學(xué)基金(編號:BK20150068)

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所，江蘇省皮膚性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，南京，210042 2江蘇省血液中心，南京，210042

李岷，E－mail:drlimin@sina．cn陳青，E－mail:qngchen@hotmail．com