李克躍，石承先，湯可立，劉振華，黎濤，張帥民，徐賢剛

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2.貴州省人民醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550002）

良性膽道狹窄（benign biliary stricture，BBS）是由于膽道損傷、復(fù)發(fā)性膽管炎、肝移植等病因?qū)е碌哪懝芮话毯坌钥s窄[1]。近年來，隨著腹腔鏡膽囊切除及肝移植等腹部手術(shù)的開展，BBS的發(fā)病率逐漸增高，有報道[2-4]顯示腹腔鏡膽囊切除及肝移植引起的BBS發(fā)病率分別為0.2%～0.7%及3%～13%。BBS常表現(xiàn)為膽道壓力增高、膽管炎反復(fù)發(fā)作、肝功能衰竭等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者健康及生命。研究[5-7]發(fā)現(xiàn)膽管成纖維細(xì)胞（fibroblast，F(xiàn)B）大量增殖并轉(zhuǎn)化為表現(xiàn)α-平滑肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）陽性的肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）、成纖維細(xì)胞功能異常是導(dǎo)致膽管疤痕攣縮及BBS形成的主要原因；轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）是誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的關(guān)鍵刺激因素，是與膽管疤痕及BBS形成最重要、最直接的因素。筆者[8]的前期研究發(fā)現(xiàn)P311等基因在BBS模型膽管成纖維細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，提示P311基因在BBS形成過程中可能發(fā)揮了重要作用。BBS的治療核心是解除膽道梗阻，外科手術(shù)，內(nèi)鏡引流及介入治療是目前治療BBS的主要方式，但它們均有一定的并發(fā)癥及病死率[1]。藥物是治療疤痕的方式之一，但令人遺憾的是目前尚缺乏一種可靠、特效的藥物用于臨床[9]。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）是一種重要的免疫及炎癥介質(zhì)，在組織損傷后迅速升高，在組織損傷修復(fù)的炎癥反應(yīng)階段具有重要的調(diào)節(jié)作用[10]。與正常皮膚相比，疤痕組織及其成纖維細(xì)胞的TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增高，提示TNF-α可能在皮膚疤痕形成的病理過程中發(fā)揮了重要作用[11-12]。筆者[8]前期的研究發(fā)現(xiàn)中藥單體川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）能下調(diào)BBS模型膽管成纖維細(xì)胞中P311及TGF-β1等基因的表達(dá)，并且能抑制BBS模型膽管成纖維細(xì)胞的增殖，提示TMP可能在抑制BBS形成過程中發(fā)揮了重要作用。但TNF-α在膽管疤痕修復(fù)及BBS形成過程中的作用尚不清楚，TMP對TNF-α處理的膽管成纖維細(xì)胞的作用也不清楚。本研究對TNF-α誘導(dǎo)的兔膽管成纖維細(xì)胞使用不同濃度的TMP進(jìn)行干預(yù)，觀察細(xì)胞增殖水平及P311/TGF-β1/α-SMA通路表達(dá)的變化，現(xiàn)匯報如下。

1　材料與方法

1.1　材料

UNIQ-10柱式TRIZOL總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、α-SMA引物、β-Actin引物、Trizol、CCK-8細(xì)胞計數(shù)盒、胎牛血清、DMEM（高糖型）、全蛋白提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）；TGF-β1及P311引物（上海Introgen公司）；P311上游引物序列為：5'-TAA TAA ATG CCC TCT GAA AAA GCC A-3'，下游引物序列為：5'-GGA GCA AGG ACA AAA GTG TAA AAT C-3'；TGF-β1上游引物序列為：5'-GGC TCA CCT TCT GCC CGT CT-3'，下游引物序列為：5'-GTC TCG GTA TCC CAC GAA AGA AAC G-3'；α-SMA上游引物序列為：5'-GCT GTC CCT CTA TGC CTC TG-3'，下游引物序列為：5'-TAG CCA CGC TCA GTC AGG AT-3'；β-Actin上游引物序列為：5'-CTC TCC ACC TTC CAG CAG AT-3'，下游引物序列為：5'-TGG CTC TAA CAG TCC GCC TA-3'；抗-TGFβ1多克隆抗體（ab99562）、抗-α-SMA單克隆抗體（ab7817）（英國abcam公司）；抗-Vimentin單克隆抗體（V2258）、抗-cytokeratin單克隆抗體（C-1801）、PVDF膜（美國sigma公司）；抗-β-Actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記的第二抗體（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；ECL發(fā)光試劑盒（美國Millipore公司）；SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus）（大連寶生物工程有限公司）；DAPI（瑞士Roche公司）；鹽酸川芎嗪注射液（北京四環(huán)科寶制藥有限公司，批號14032015）；TNF-α（sigma，T7539，USA）；家兔2只（購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）。

1.2　家兔膽管成纖維細(xì)胞的獲取及鑒定

清潔級家兔2只，術(shù)前12 h禁食，分籠飼養(yǎng)，動物的飼養(yǎng)在貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心進(jìn)行。2.5%戊巴比妥鈉溶液（40～45 mg/kg）靜脈注射麻醉，取上腹部正中切口，長4～6cm，逐層切開皮膚皮下組織，取出長約2cm膽總管后用深麻醉處死動物，逐層關(guān)腹。膽管組織用無菌PBS清洗3次后剪為約2～3 mm3大小，將組織轉(zhuǎn)移到25cm2培養(yǎng)瓶中放入37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中干燥貼壁4 h，加入少許含20%（v/v）胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)[13-14]。使用差速貼壁法分離純化成纖維細(xì)胞（將消化后的細(xì)胞懸浮液以1:3傳代，30 min后除去未貼壁的細(xì)胞，加入新培養(yǎng)液繼續(xù)生長，直到細(xì)胞全部為成纖維細(xì)胞），細(xì)胞生長至80%～90%融合時傳代。選擇第3代的成纖維細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。實驗所用細(xì)胞為第3～5代成纖維細(xì)胞。使用細(xì)胞免疫熒光法檢測波形蛋白[13]、細(xì)胞角蛋白[15]抗體的表達(dá)進(jìn)行成纖維細(xì)胞的鑒定。

1.3　實驗分組及各組細(xì)胞的處理

實驗分為正常膽管成纖維細(xì)胞組（空白對照組）；正常膽管成纖維細(xì)胞+TNF-α 30 ng/mL處理組（TNF-α組）；正常膽管成纖維細(xì)胞+TNF-α 30 ng/mL+3個不同濃度TMP（0.08、0.4、2.0 mg/mL）mg/mL處理組（低、中、高濃度TMP組）。各組細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞消化后，轉(zhuǎn)移到6孔板（細(xì)胞增殖測定用96孔板），調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/孔（細(xì)胞增殖測定2×104/孔），用含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后改為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基饑餓過夜，根據(jù)不同的分組加用含有對應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)48 h。

1.4　觀察指標(biāo)及測定方法

1.4.1成纖維細(xì)胞的鑒定采用細(xì)胞免疫熒光法。取第3代處于對數(shù)期生長期細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后按照2×105/孔均勻接種至帶有玻璃片的六孔板中，24 h后進(jìn)行免疫熒光操作，具體步驟如下：4%多聚甲醛固定15min；0.1%的Triton-100孵育10 min；10%山羊血清封閉30 min；第一抗體4 ℃孵育過夜；第二抗體室溫孵育30 min；滴加稀釋的DAPI（l:100）；熒光顯微鏡下觀察并且拍照；陰性對照以PBS代替第一抗體。

1.4.2成纖維細(xì)胞增殖的測定用CCK-8法，具體按CCK-8說明書進(jìn)行。接種成纖維細(xì)胞于96孔板，調(diào)整細(xì)胞為2×104/孔，每孔體積為100 μL，做5個復(fù)孔。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后根據(jù)分組加入對應(yīng)的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑培養(yǎng)2.5h，在酶標(biāo)儀上450 nm波長處測定每個孔的光密度值（OD值），采用扣除本底策略來消除誤差。

1.4.3P311、TGF-β1及α-SMA mRNA的表達(dá) 用Real-time PCR方法檢測。分別將各組細(xì)胞提取總RNA，選擇純度好、完整性高的RNA合成cDNA。設(shè)置real-time PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中上、下游引物各 0.8 μL，2×SYBRRPremix 10μL，樣品cDNA 2 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，雙蒸水6 μL，每個樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，然后進(jìn)行40個擴(kuò)增循環(huán)（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）。采用 ABI Stepone software v2.3實時熒光定量PCR系統(tǒng)采集并分析結(jié)果，以β-actin為內(nèi)參，溶解曲線為單峰表示引物特異性好，采用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.4.4TGF-β1及 α-SMA蛋白的表達(dá)用Western blot方法檢測。分別提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，放置蛋白于聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜后以封閉液給予封閉，按1:5 000稀釋目的蛋白的一抗，在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜后用TBST在搖床上洗PVDF膜3次。按1:5 000稀釋二抗，在室溫下振蕩孵育2 h，以TBST清洗PVDF膜3次。電化學(xué)發(fā)光后用顯影和定影方法對膠片進(jìn)行掃描，用β-actin為內(nèi)參，以Quantity one系統(tǒng)分析目的條帶的相對灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.5　統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)　果

2.1　成纖維細(xì)胞的鑒定

鏡下可見原代培養(yǎng)的膽管成纖維細(xì)胞呈不規(guī)則三角形，隨后逐漸變?yōu)樗笮蔚膯蝹€核細(xì)胞，為成纖維樣細(xì)胞。第3代成纖維細(xì)胞波形蛋白細(xì)胞免疫熒光陽性，角蛋白細(xì)胞免疫熒光陰性，符合成纖維細(xì)胞的特點（圖1）。

圖1　兔成纖維細(xì)胞的鑒定（×100）　A：波形蛋白陽性；B：細(xì)胞角蛋白陰性Figure 1　Identi fi cation of rabbit bile duct fi broblasts (×100)A: Positive vimentin expression; B: Negative cytokeratin expression

2.2　各組細(xì)胞增殖水平檢測

與空白對照組比較，TNF-α處理的膽管成纖維細(xì)胞的增殖（OD）明顯增加（均P＜0.05），使用不同濃度的TMP干預(yù)后，TNF-α誘導(dǎo)的膽管成纖維細(xì)胞增殖被明顯抑制，并呈濃度依耐趨勢，中、高濃度TMP的抑制作用有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（表1）。

表1　各組細(xì)胞增殖情況（±s）Table 1　Proliferation in cells of each group (±s)

表1　各組細(xì)胞增殖情況（±s）Table 1　Proliferation in cells of each group (±s)

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與TNF-α組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.blank control group; 2) P＜0.05 vs.TNF-α group

組別　OD空白對照組　0.331±0.005 TNF-α 組　0.390±0.0081)低濃度TMP組　0.376±0.0041)中濃度TMP組　0.364±0.0091),2)高濃度TMP組　0.352±0.0041),2)

2.3　各組細(xì)胞P311、TGF-β1及α-SMA mRNA表達(dá)檢測結(jié)果

與空白對照組比較，TNF-α處理的膽管成纖維細(xì)胞中P311、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)較明顯上調(diào)（均P＜0.05），使用不同濃度的TMP干預(yù)后，TNF-α誘導(dǎo)的膽管成纖維細(xì)胞中P311、TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)上調(diào)被不同程度的抑制，并呈濃度依耐趨勢，中、高濃度TMP的抑制作用有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（表2）。

表2　各組細(xì)胞P311、TGF-β1及α-SMA mRNA表達(dá)水平（±s）Table 2　Expression levels of P311,TGF-β1 and α-SMA mRNA±s)

表2　各組細(xì)胞P311、TGF-β1及α-SMA mRNA表達(dá)水平（±s）Table 2　Expression levels of P311,TGF-β1 and α-SMA mRNA±s)

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與TNF-α組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.blank control group; 2) P＜0.05 vs.TNF-α group

組別　TGF-β1　α-SMA　P311空白對照組　1.000±0.001　1.000±0.002　1.000±0.002 TNF-α 組　2.557±0.0231)　2.366±0.0081)　3.411±0.0221)低濃度TMP組 2.443±0.0081)　2.276±0.0271)　3.336±0.0331)中濃度TMP組 2.390±0.0041),2)2.223±0.0071),2)3.221±0.0321),2)高濃度TMP組 2.107±0.0681),2)1.945±0.0361),2)2.920±0.0291),2)

2.4　各組細(xì)胞TGF-β1及α-SMA蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

與空白對照組比較，TNF-α處理的膽管成纖維細(xì)胞中TGF-β1與α-SMA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，使用不同濃度的TMP干預(yù)后，TNF-α誘導(dǎo)的膽管成纖維細(xì)胞的TGF-β1與α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)受到不同程度的抑制，并呈濃度依耐趨勢，中、高濃度TMP的抑制作用有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2）（表3）。

圖2　Western blot檢測結(jié)果Figure 2　Results of Western blot analysis

表3　各組細(xì)胞TGF-β1與α-SMA蛋白表達(dá)水平（±s）Table 3　Expression levels of TGF-β1 and α-SMA protein (±s)

表3　各組細(xì)胞TGF-β1與α-SMA蛋白表達(dá)水平（±s）Table 3　Expression levels of TGF-β1 and α-SMA protein (±s)

注：1）與空白對照組比較，P＜0.05；2）與TNF-α組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.blank control group; 2) P＜0.05 vs.TNF-α group

組別　TGF-β1　α-SMA空白對照組　1.000±0.021　1.000±0.044 TNF-α 組　1.743±0.0991)　1.519±0.0861)低濃度TMP組　1.668±0.0521)　1.410±0.0211)中濃度TMP組　1.500±0.0771),2)　1.316±0.0551),2)高濃度TMP組　1.364±0.0231),2)　1.205±0.0361),2)

3　討　論

在損傷修復(fù)的過程中，增生性疤痕（HS）的形成是不可避免的結(jié)果，HS接著形成不同程度的疤痕疙瘩[16]，疤痕疙瘩如果較輕微，通過組織塑形得以糾正，如疤痕過多，就難以通過簡單的組織塑形予以解決。在膽道，HS的形成伴隨著較高的BBS發(fā)病率。

成纖維細(xì)胞是由胚胎時期的間充質(zhì)細(xì)胞（mesenchymal cells）分化而來，在組織損傷修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。組織損傷后，成纖維細(xì)胞大量增殖并分化為肌成纖維細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），收縮并填補(bǔ)創(chuàng)面，正常情況下，一旦創(chuàng)面被完全表皮化，成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞就開始加速凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)的分泌就明顯減少，組織修復(fù)過程趨于停止；另一方面，一旦成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞等組織修復(fù)細(xì)胞持續(xù)過度增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚，則形成HS[17]。膽道創(chuàng)傷修復(fù)過程中，成纖維細(xì)胞大量增殖,同時轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞收縮創(chuàng)面、分泌細(xì)胞外基質(zhì)填補(bǔ)創(chuàng)面，在膽管疤痕修復(fù)及BBS形成過程中發(fā)揮了主要作用[6-7]。

TGF-β1是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，在細(xì)胞的增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)及疤痕形成等生理及病理過程中發(fā)揮了重要作用[18]。組織創(chuàng)傷后，TGF-β1在成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，TGF-β1反過來又能激活成纖維細(xì)胞，使其增殖旺盛，促進(jìn)組織損傷后的修復(fù)。如果TGF-β1過度作用或持續(xù)過表達(dá)，將會引起成纖維細(xì)胞過度增殖，誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)化為大量肌成纖維細(xì)胞，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，同時抑制細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而導(dǎo)致瘢痕形成，是目前已知的與疤痕及膽管疤痕形成最密切的細(xì)胞因子[5-7]。TGF-β1主要是通過TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用，抑制疤痕組織及疤痕成纖維細(xì)胞中TGF-β1/Smads通路的表達(dá)是目前治療疤痕的重要措施之一[19]。

α-SMA陽性表達(dá)是肌成纖維細(xì)胞較特異的標(biāo)志，肌成纖維細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的特點，具有較強(qiáng)的收縮性，同時能分泌大量的ECM及ECM的調(diào)控物基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）[20]。研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，在疤痕組織及膽管疤痕組織中細(xì)胞外基質(zhì)尤其是I、III型膠原過度沉積，細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積是疤痕的主要生物學(xué)特征之一。MMPs 及TIMPs正常情況下能維持ECM的代謝平衡，異常情況下，MMPs及TIMPs的表達(dá)出現(xiàn)異常，引起ECM降解減少，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的大量積聚，形成HS[21]。而α-SMA在膽管疤痕成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)主要受到TGF-β1的調(diào)控[5-7]。在創(chuàng)傷修復(fù)晚期，成纖維細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ艹熟o止?fàn)顟B(tài)的纖維細(xì)胞。

P31 1（neuronal regeneration related protein，NREP）基因含有在人及小鼠等物種間高度保守的PEST域（為一富含谷氨酰胺、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的約10個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)序列），該結(jié)構(gòu)域是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白代謝中發(fā)揮重要作用的泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin/proteasome pathway）的結(jié)合位點。如前所述，TGF-β1在疤痕及BBS形成過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并且TGF-β1主要是通過TGF-β1/Smads信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮其生物學(xué)作用的，而Smads在轉(zhuǎn)錄表達(dá)后受泛素-蛋白酶體通路的降解，以維持Smad通路信號的正常傳導(dǎo)[22]。報道[23]顯示P311基因在皮膚疤痕組織成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)，對正常皮膚成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染P311基因后，該細(xì)胞的TGF-β1及α-SMA表達(dá)明顯上調(diào)，提示P311基因可能通過對成纖維細(xì)胞TGF-β1及α-SMA表達(dá)的調(diào)控在HS的形成過程中發(fā)揮了重要作用。筆者[8]的前期研究結(jié)果也提示P311基因在BBS模型膽管成纖維細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，提示P311基因在BBS形成過程中可能發(fā)揮了重要作用。本實驗結(jié)果提示P311基因在TNF-α處理的膽管成纖維細(xì)胞中的表達(dá)較正常膽管成纖維細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高（P＜0.01），提示P311基因在膽道疤痕修復(fù)及BBS形成過程中可能發(fā)揮了重要的作用，其機(jī)理可能與對成纖維細(xì)胞TGF-β1/α-SMA通路的調(diào)控有關(guān)。

TNF-α是一種主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的26 kD的蛋白，可分為溶解型（sTNF-α）和膜結(jié)合型（mTNF-α），mTNF-α是sTNF-α的前體，在TNF-α轉(zhuǎn)化酶（TNF-α converting enzyme，TACE）的作用下mTNF-α解離成為sTNF-α[24]。TNF-α在組織損傷修復(fù)的炎癥反應(yīng)階段具有重要的調(diào)節(jié)作用[10]。在人體皮膚損傷修復(fù)的過程中TNF-α的最高峰值出現(xiàn)在損傷后的12～24 h[25]。與正常皮膚相比，疤痕組織及其成纖維細(xì)胞的TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增高，提示TNF-α可能在皮膚疤痕形成的過程中發(fā)揮了重要作用[11,12]。TNF-α調(diào)控的下游主要成分NF-κB、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TNF receptor-associated factors，TRAF，分為TRAF1及TRAF2）及細(xì)胞凋亡抑制劑（cellular inhibitor of apoptosis，c-IAP1）在疤痕組織及其成纖維細(xì)胞中的表達(dá)較正常組織及其成纖維細(xì)胞中的表達(dá)也明顯增高，提示TNF-α及其傳導(dǎo)通路在疤痕形成過程中發(fā)揮了重要作用[11]。在滑膜成纖維細(xì)胞中，TNF-α刺激細(xì)胞增殖及上調(diào)TGF-β1等細(xì)胞因子的表達(dá)[26]。干預(yù)疤痕成纖維細(xì)胞中TNF-α及其調(diào)控的NF-κB等信號轉(zhuǎn)到通路的表達(dá)是目前治療疤痕的方式之一[12]。也有報道[27]顯示TNF-α能夠抑制成纖維細(xì)胞α-SMA、膠原及纖維素的表達(dá)，從而降低膠原基質(zhì)的硬度及收縮，提示TNF-α在一定條件下可能具有抑制疤痕形成的作用。報道[12]顯示TNF-α通過激活2條相互競爭的通路調(diào)控細(xì)胞的凋亡：激活NF-κB通路抑制細(xì)胞的凋亡，激活caspase-8通路促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。因此，TNF-α對細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)作用可能與不同濃度的TNF-α作用于細(xì)胞后介導(dǎo)不同的信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)。本實驗結(jié)果提示TNF-α濃度為30 ng/mL時上調(diào)正常膽管成纖維細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、P311基因mRNA及蛋白的表達(dá)，從而刺激膽管成纖維細(xì)胞的增殖，這與以前報道[12]的50 ng/mL TNF-α激活NF-κB通路抑制細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的濃度趨于一致。提示TNF-α在膽道疤痕修復(fù)及BBS形成過程中可能發(fā)揮了重要作用，而機(jī)理可能與其對膽管成纖維細(xì)胞P311/TGF-β1/α-SMA通路的調(diào)控有關(guān)。

以往報道[28]TMP能抑制血管緊張素II誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大及通過NF-κB通路抑制TNF-α的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)心肌的作用。也有報道[29]顯示TMP能抑制小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α及NF-κB等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。同時TMP還能通過抑制TNF-α的表達(dá)抑制肺纖維化的形成[30]。本實驗結(jié)果提示TMP（0.4～2.0 mg/mL）能下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的膽管成纖維細(xì)胞P311/TGF-β1/α-SMA通路的mRNA及蛋白的表達(dá)，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的膽管成纖維細(xì)胞的增殖，提示TMP抑制BBS形成的機(jī)理之一可能與其直接或間接調(diào)控TNF-α有關(guān)。

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