楊婧，黃顯斌，詹渭鵬，景武堂，顧遠暉

（甘肅省人民醫(yī)院　普外一科，甘肅　蘭州730000）

良性膽管狹窄（benign biliary stricture，BBS）是指非腫瘤因素引起的膽管（尤其是肝外膽管）管腔纖維組織增生、瘢痕攣縮。良性膽管狹窄是膽道外科的常見疾病，形成原因多由醫(yī)源性膽管損傷、缺血、炎癥、放化療引起，處理棘手，患者并發(fā)癥發(fā)生率高[1]。膽管損傷后，即使經(jīng)滿意修復，后期仍易出現(xiàn)狹窄。膽管損傷后狹窄主要表現(xiàn)為局部纖維化瘢痕形成，在這個過程中膽管上皮細胞的病理改變及免疫炎癥反應(yīng)失控發(fā)揮了重要作用，它們與釋放的炎癥因子相互作用的直接后果是大量炎癥細胞浸潤，導致成纖維細胞增殖旺盛，膠原過度合成，管腔瘢痕狹窄。Toll樣受體4（TLR4）目前認為是啟動天然免疫及炎癥反應(yīng)重要的細胞受體，在炎癥中發(fā)揮重要作用。為了闡明TLR4在膽管狹窄形成中的作用，本研究檢測了人正常膽管壁及狹窄膽管壁中的表達情況；通過建立TLR4基因缺陷小鼠（TLR4-/-）和野生型（TLR4+/+）小鼠肝外膽管缺血損傷修復模型，采用免疫組化方法對TLR4在愈合過程中的表達進行觀察，探討其在術(shù)后膽管狹窄形成過程中的作用及意義。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

收集了甘肅省人民醫(yī)院普外一科2013年10月—2015年1月期間膽道良性狹窄患者12例，均為膽腸吻合口瘢痕，病程3個月至2年，均有黃疸病史，經(jīng)影像學或手術(shù)證實存在膽總管或肝總管狹窄，在手術(shù)中取足量狹窄部位全層膽管壁組織。形成原因均為膽囊切除術(shù)（經(jīng)腹腔鏡10例，經(jīng)開腹2例）膽管損傷后行Roux-en-Y式膽腸吻合術(shù)。4例胰十二指腸切除術(shù)患者的正常膽總管組織作為正常組。TLR4兔抗人多克隆抗體和TLR4兔抗鼠多克隆抗體購自甘肅寶信生物科技有限公司，免疫組織化學SP試劑盒購自甘肅寶信生物科技有限公司。

SPF級TLR4-/-和TLR4+/+雄性小鼠，5～6周，體質(zhì)量25～30 g。購自美國匹茲堡大學。

1.2　實驗方法

1.2.1免疫組化方法標本獲取后，立即用等滲鹽水沖洗表面的血液和膽汁，用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚切片，常規(guī)脫蠟至脫水，高溫修復后用動物血清封閉備用。加入兔抗人多克隆抗體和兔抗鼠多克隆抗體（TLR4為1:100），4 ℃過夜；次日以PBS溶液清洗后加入二抗（生物素羊抗兔多克隆抗體，濃度為1:300）及鏈霉菌生物素-過氧化物酶，室溫下孵育30 min；最后以DAB顯色、蘇木精復染后封片。以0.01 mol/L PBS溶液代替一抗作為陰性對照。細胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色或者褐色顆粒即為陽性細胞。顯微鏡（400倍）下隨機計數(shù)10個視野的陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，計算陽性細胞比例，并換算成陽性表達強度后再進行評價。陽性表達強度標準：“-”（＜25%）、“+”（25%～50%）、“++”（51%～75%）及“+++”（＞75%），其中“-”和“+”定義為表達陰性，“++”和“+++”定義為表達陽性。

1.2.2動物實驗方法將實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為TLR4-/-模型組、假手術(shù)組、TLR4+/+模型組、TLR4-/-TLR4+/+假手術(shù)組，每組5只。術(shù)前各組體質(zhì)量、精神狀態(tài)、進食量差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。實驗小鼠術(shù)前12 h禁食，6 h禁水。模型組1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后備皮，固定于清潔手術(shù)臺上，腹部碘伏消毒，無菌條件下取上腹部正中切口打開腹腔，沿胃找十二指腸系膜緣，距十二指腸上緣約1.5cm處尋找到一條透明或半透明的條帶狀結(jié)構(gòu)即為膽管。向上解剖一段長約0.8cm游離的膽總管，用2枚顯微血管夾鉗夾膽總管，術(shù)中間斷注入生理鹽水。3-0號絲線間斷縫合關(guān)閉腹腔。術(shù)后不用抗生素，夾閉時間為48 h。術(shù)中或術(shù)后死亡的大鼠均重新補建模型，其中TLR4-/-模型組和TLR4+/+模型組小鼠在術(shù)中各死亡1只，均因在分離膽總管過程中不慎損傷門靜脈出血導致死亡。術(shù)后觀察指標動物的一般情況，包括進食、活動、反應(yīng)狀況、傷口情況。假手術(shù)組僅顯露肝外膽管和游離膽總管，不做膽總管夾閉，余同模型組。術(shù)后48 h，模型組膽管及肝臟大體與光鏡所見有明顯改變，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）及膽紅素水平顯著升高，與假手術(shù)組相比有明顯差異，提示用鉗夾法建立小鼠膽管狹窄動物模型成功[2-3]。

1.3　統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。統(tǒng)計數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。對照組和病例組TLR4陽性細胞百分率采用t檢驗，同時兩組之間的陽性率分別進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)　果

2.1　患者組織中TLR4的表達情況

免疫組織化學染色結(jié)果顯示，正常組組織中TLR4罕有陽性染色；狹窄組中見大量陽性染色細胞，主要為膽管上皮細胞及浸潤的淋巴細胞，中性粒細胞等炎癥細胞，TLR4表達主要集中在細胞膜和細胞質(zhì)中，染色呈棕黃色（圖1）。狹窄組組織中TLR4的表達陽性率為83.33%（10/12），高于正常組的25.00%（1/4），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=36.65，P＜0.01）。

圖1　免疫組化檢測TLR4的表達（×400）　A：正常膽管組織；B：狹窄膽管組織Figure 1　Immunohistochemical staining for TLR4 expression (×400)　A: Normal bile duct tissue; B: Bile duct tissue with biliary stricture

2.2　小鼠組織中膽管病理形態(tài)的變化

TLR4-/-模型組和TLR4+/+模型組小鼠結(jié)扎48 h后鉗夾部位以上膽管明顯擴張，肝臟、小腸淤膽嚴重。病理示TLR4+/+模型組小鼠缺血膽管管腔變小或閉塞，膽管黏膜壞死脫落，管壁纖維化增厚。肝臟可見少量肝細胞壞死，炎性細胞浸潤；而TLR4-/-模型組膽管黏膜壞死及炎性細胞浸潤均較TLR4+/+模型組輕（圖2）。

2.3 小鼠肝功能變化情況

與各自的對照組比較，TLR4-/-與TL R4+/+模型組小鼠血清ALT水平明顯升高（P＜0.05），但TLR4-/-模型組低于TLR4+/+模型組（均P＜0.05）；TLR4-/-模型組和TLR4+/+模型組小鼠血清總膽紅素、直接膽紅素水平均明顯升高于，TLR4-/-模型組（均P＜0.05），但TLR4-/-模型組兩者水平均低于TLR4+/+模型組（均P＜0.05）。TLR4-/-和TLR4+/+假手術(shù)組血清ALT、總膽紅素、直接膽紅素水平無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）（表1）。

圖2　大體與組織病理學觀察（×400）　A：TLR4-/-模型組；B：TLR4+/+模型組Figure 2　Gross pathology and histopathological observations (×400)　A: TLR4–/– model group; B: TLR4+/+ model group

表1　各組小鼠肝功能指標變化（±s）table 1　Changes in liver function parameters of each group of mice (±s)

表1　各組小鼠肝功能指標變化（±s）table 1　Changes in liver function parameters of each group of mice (±s)

注：1）與各自的對照組比較，P＜0.05；2）與TLR4+/+模型組比較，P＜0.05Note: 1) P＜0.05 vs.corresponding control group; 2) P＜0.05 vs.TLR4+/+ model group

3　討　論

近年來，隨著微創(chuàng)技術(shù)在膽道外科的廣泛應(yīng)用，經(jīng)腹腔鏡造成的醫(yī)源性膽管損傷仍是肝膽外科難以避免的技術(shù)難題，目前該類損傷的發(fā)病率仍保持在0.5%～1%[4]。雖然手術(shù)重新建立了通道，但卻不能解決瘢痕形成，再次狹窄的問題。因此對良性狹窄形成機制的研究具有重要意義。

膽管上皮細胞（biliary epithelial cell，BEC）是襯復在膽管內(nèi)的上皮細胞，它構(gòu)成膽道系統(tǒng)對病原微生物的第一道防線。BEC可以表達多種病原體識別受體，并激活細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導通路，啟動內(nèi)在的抗病原微生物的防御系統(tǒng)。BEC在病理條件下產(chǎn)生和分泌TNF-α[5-6]、IL-4、IL-6[7-8]、結(jié)締組織生長因子等[9-10]。近年來，細胞因子和信號通路在膽道損傷修復中的作用受到了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，但是其具備的早期速發(fā)和鏈式加重的特點并不能很好的解釋。膽管瘢痕狹窄是BEC對多種慢性損傷的修復反應(yīng)，被認為是多種類型細胞，氧化應(yīng)激、細胞因子和生長因子等一系列復雜作用的結(jié)果[11-12]。由于炎癥反應(yīng)及其炎癥因子的作用在機體應(yīng)激反應(yīng)中具備雙向性的特點，因此迫切需要深入了解炎癥因子的始發(fā)點，找到控制其鏈式反應(yīng)的“閘門”。

既往對膽道損傷狹窄的研究總是聚焦于細胞形態(tài)學或終末反應(yīng)階段的細胞因子，沒有取得實質(zhì)性進展。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）的發(fā)現(xiàn)為這個問題的解決創(chuàng)造了可能。TLRs是一類可以識別病原體并迅速啟動天然免疫反應(yīng)的跨膜蛋白[13-15]。TLRs不僅識別外源性病原微生物，也可能被內(nèi)源性配體激活，許多內(nèi)源性配體與組織損傷有關(guān)，稱為“損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMP）”，TLRs能夠識別損傷與感染信號，因此它是連接組織損傷，感染和炎癥的橋梁[16-18]。TLRs信號通路參與誘導BEC細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生并介導BEC的增殖[19-21]，而且BEC上調(diào)TLRs在原發(fā)性膽汁性肝硬化，原發(fā)性硬化性膽管炎，肝內(nèi)外膽管結(jié)石的患者中被證實[22-23]。本實驗也表明瘢痕狹窄的人膽管上皮細胞高表達TLR4，通過建立TLR4基因缺陷的小鼠缺血狹窄模型也發(fā)現(xiàn)，TLR4基因缺陷的小鼠在結(jié)扎48 h后表現(xiàn)出更輕的膽管炎癥反應(yīng)及肝功能的損傷。因此筆者推測腸道內(nèi)毒素與其受體TLR4結(jié)合[24-26]，激活下游信號轉(zhuǎn)導路徑，在機體內(nèi)產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答，從而促成了膽管纖維化和狹窄的發(fā)生。但TLRs信號，免疫炎癥反應(yīng)，膽管纖維化之間的分子聯(lián)系和調(diào)控機制仍需進一步的研究。

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